CYP17基因多态性等位基因特异性PCR检测方法的建立

目的 建立快速准确检测CYP17基因单核苷酸多态性的新方法 .方法 用等位基因特异PCR(AS-PCR)方法 对53例外周血标本CYP17基因单核苷酸多态性位点rs743572进行基因分型.结果 AS-PCR测定结果 与聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性方法 (PCR-RFLP)的测定结果 一致.结论 采用AS-PCR检测CYP17基因多态性准确、快速.

现代中西医结合杂志 M dr Junl f n ga dTa ioa C ieeadWet nM dc e 0 Fb 2 ( ) oen 0ra o t rt rdt nl h s n s r e in 1 e, 0 4 Ie e i n e i 2 1

.8 4 5.

C 1 YP 7基因多态性等位基因特异性 P CR检测方法的建立陈巧云，李皓，红关，加燕徐冷(苏大学附属人民医院，苏镇江 2 2 0 )江江 1 0 1[要]目的建立快速准确检测 C P 7基因单核苷酸多态性的新方法。方法用等位基因特异 P R( S—摘 Y I C A P R)法对 5 C方 3例外周血标本 C P 7基因单核苷酸多态性位点 r 4 5 2进行基因分型。结果 Y 1 s 37 7 A S—P R测定结果 C

与聚合酶链式反应一限制性片断长度多态性方法( C P R—RF P L )的测定结果一致。结论采用 AS—P R检测 C 1 C YP 7基因多态性准确、速。快

[关键词]等位基因特异 P R; P1多态性 C CY 7;

[图分类号] R 4 中 46

[献标识码] B文

[章编号] 1 0文 0 8—8 4 ( 0 1 0 0 8 8 9 2 1 ) 4— 4 5—0 2 n nh g v S P数据库中查到 C P 7基因 r 4 5 2态性 l i . o/ N/ m. Y 1 s 37多 7位点基因序列， P i e 5 0软件，计 2对特异性引物， l用 r r . m 设 A型：游引物 5上一GC c T .r T C T cr AA AAG C T一3 cA c c下游引物

类固醇激素是维持人体正常生理功能的重要物质，目前已证实有多种疾病与之相关。C P 7基因编码的细胞色素 Y 1 P 5 7 4 0 l d羟化酶/ 7、0裂解酶是类固醇激素合成的关键酶 1 2之一，基因可在一定程度上决定体内性激素的水平。国内该外研究发现， YP1 C 7启动子 5’游 3上 4碱基处单核苷酸多态

5一c A A c c T T c c T T一 A c c G T c A T c c 3 2型：游弓物 5 G— I上 I一 CCTCT T C T T AA AAGC C C一 3下游引物 5 AC T 一C— CA

性位点与乳腺癌、列腺癌等疾病的发生和发展有关前

。

C

G T T C A T C C一 为了增加引物的特异性，考 A CCTT CCTC 3参 K o w k等的方法，下游引物 3端倒数第 3位引入错配碱在’基 (体标注 )黑。 1 3 3 P R反应体系及程序扩增体系及程序：d 6 5 . . C d H O 3 . L,0×P R缓冲液 5 L Mg 1 4 L 1 m lL d T 1 C , C2 , 0 m o N P 1 / t,a x T q酶 0 5 L ( U p )上、游引物各 1 L ( 0 L . 5 I/￣,下 L 2 I o/ ) D A模板 1 L P R扩增条件为： 4预变性 5￣ lL, N m 。 C 9

因此，测 CY 7基因型有助于激素相关疾病的早期诊断和检 P1

预后判断。本研究建立了 C P 7单核苷酸多态性等位基因 Y 1

特异 P R A P R检测方法，对于传统聚合酶链反应一 C ( S— C )相限制性片段长度多态性 ( C—R L )法有一定优势，报 PR FP方现道如下。

1临床资料 11研究对象 . 5 3例血液标本均来门诊或住院患者，为均

mi;4℃变性 3 ,0 C火 3 ,2o伸 3 , 3 n9 0 S6 退 o 0S 7 C延 0 S共 5个循环； 2℃延伸 1 i 7 0 m n后 4o存。 C保

镇江地区汉族人，年龄 1 5~9 4 . 2±1 . 9)。所有患者 O( 7 1 76岁相互问无血缘关系。

13 4扩增产物分析扩增产物用 0 5×T E电泳缓冲液 .. . B配制的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳，泳 4 V c 3 n电 / m,0mi; Mak r为参照，胶图像分析系统记录结果。 re作凝1 3 5质量控制基因分型时做阳性对照和阴性对照。阳 ..

12试剂与仪器 .

T qD A聚合酶等 P R反应试剂购自 a N C

F r na公司； e mc t s引物由上海生工生物技术有限公司合成；限制性核酸内切酶 Ms A1 p I购自 NE B公司；血基因组 DNA全

提取试剂盒购自大连宝生物公司；脂糖和溴化乙锭 ( B均琼 E )为 Sm i a公司产品； 7 0型 P R仪 ( i R D) D Y一6 g 20 C Bo A; Y C电

性对照：择经 A选 S—P R和 P R—R L C C F P

均检测为阳性的

D A样本； N阴性对照：去离子灭菌水代替 D A加入反应体用 N系，以防止非特异性扩增。

泳仪 (京六一仪器厂 )凝胶电泳成像系统 ( imai y 北； Bo g gSs l ntms UVP公司 )。 e,1 3方法 .

13 6方法验证同样标本采用 P R—R L .. C F P测定其基因型，方法参照朱明明等的研究。将结果与 A其 S—P R的测 C采集 5m E T L D A抗凝静脉血，照参定结果对照，测其一致性。检

1 3 1模板 D A提取 .. N

试剂盒说明书提取模板 D NA,经紫外分光光度汁定量后，并

14统计学处理 .

应用 S S 3 0 f n o s软件包进行 P S 1 . o Wid w r

将 D A浓度调到 0 1~1/,一 0℃保存备用。 N . L置 2 g132 ..多态性位点特异性引物设计从 ht:/ w, e i t/ ww n b. p

数据处理，数资料组间差异比较采用 )计 C验， 00检 P< . 5为有显著性差异。

2 0 4( 0 5, 4):7 24

[] Sen egS .诊断外科病理学[ .回允中， .3版 .北京： 6 t br S r M]译北京大学医学出版社，0 3 1 5 2 0:64[] Mo l M, y D, id M.A 5一d c d n l i o 3 7 5 c r 7 di I L eK K d n e ae a a s f, 1 a ys 1—

[ Y m m t M, a a , ioh N, t 1 n o r ec l c rio 4] a a oo N k j S M y s i e a.E d ci el a n ma o n c ( a iod fte g l l d r J A ug P to, 9 9 1 c r n i )o h al a e[] c bd m JS r a l1 8, 3 h( 4):9 2 2—3 2 0

c o m r[] a c r 2 0, 7 4: 3 9 9 i i t os J .C n e,0 3 9 ( ) 9 4— 5 ndu[ Ns ia Y m d N k s o K, l 1 a io u ro e 8] i gmi h T, a a a M, a ah e a.C r n i tmo ft c d h gl ba d r J .Itr Me, 9 6,5 1 ):5 al ld e[] nen d l 9 3 ( 2 9 3

—9 6 5[稿日期] 2 1收 0 0一O 7一l O

[] Mo l M, h pr MD, id M, A n l i o ae c ri i 5 di I S a i n o Kd n a ay s frr acn d s o tm r: lr y g te e cii l c n n rms J Wol J S r, u os c i i h s l c o u d u[] afn na r u g d2 05,9(1 9—1 1 0 2 ):2 0

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