骨髓干细胞移植治疗肝硬化研究进展

肝硬化是一种常见的,由不同病因引起的肝脏慢性、进行性、弥漫性病变,引起肝硬化的病因在国内以病毒性肝炎多见,目前对肝硬化的治疗主要是保护肝功能及对症支持疗法,疗效欠佳。终末期肝病最后考虑肝移植,但供肝来源越来越少,肝移植费用昂贵。手术并发症。且术后出现的移植排斥等问题困扰患者终生,近来兴起的骨髓干细胞移植治疗肝硬化具有操作简单、可莺复进行、免疫源性弱、治疗费用低等优点,国内外有多处报道骨髓干细胞移植

骨髓干细胞移植治疗肝硬化研究进展

肝硬化是一种常见的，由不同病因引起的肝脏慢性、进行性、弥漫性病变，引起肝硬化的病因在国内以病毒性肝炎多见，目前对肝硬化的治疗主要是保护肝功能及对症支持疗法，疗效欠佳。终末期肝病最后考虑肝移植，但供肝来源越来越少，肝移植费用昂贵。手术并发症。且术后出现的移植排斥等问题困扰患者终生，近来兴起的骨髓干细胞移植治疗肝硬化具有操作简单、可莺复进行、免疫源性弱、治疗费用低等优点，国内外有多处报道骨髓干细胞移植治疗肝病的技术，并取得可喜的成果。经过国内外学者的探讨及实践。证明骨髓干细胞移植治疗肝硬化患者可行。且有效。患者临床症状得到不同程度的好转。肝功能的生化指标如白蛋白、胆红索、转氨酶，凝血酶原时间，Child评分改善，使其有望成为一种有广大应用前景的替代治疗方法。

一、肝硬化损伤修复的理论基础及应用价值

肝脏是人类最大的实质性器官，提供了消化道与血液的共同交界面，具有灭活毒性物质，产生胆汁，储存脂肪、糖原和维生素及调控血清蛋白和血糖水平等重要功能。肝脏由实质细胞与非实质细胞组成，前者为肝细胞，是肝脏的基本功能细胞，占所有肝内细胞的90％，肝细胞以中央静脉为中心向周围放射状排列，形成肝板结构，肝板之间的空隙形成肝血窦．收集肝小叶周边的血汇入中央静脉。形成典型的肝小叶。肝细胞有三种不同的功能面：血窦面、胆小管面和肝细胞之间的连接面。肝细胞血寞面与毗邻的窦内皮细胞存在窦周隙。其内分布有肝星状细胞及库普佛细胞。总之。肝脏特殊的微细结构，对维持正常肝功能具有重要意义。病理情况下，各种肝脏疾患常常损坏这些结构导致肝硬化发生。

肝硬化是一种常见的由不同病因引起的肝脏慢性、进行性、弥漫性病变。是在肝细胞广泛变性和坏死基础上产生肝脏纤维组织弥漫性增生，并形成再生结节和假小叶，导致正常肝小叶结构和血管解剖的破坏 。引起肝硬化的病因在国内以病毒性肝炎多见，在欧美国家则以酒精中毒多见，其他病因包括非酒精性脂肪性肝炎、化学毒物或药物、长期胆汁淤积、遗传和代谢疾病、肝脏淤血、免疫紊乱等，病变逐渐进展，肝细胞受到严重破坏，白蛋白、凝血因子合成减少，激素灭活能力减弱，晚期出现肝功能衰竭、门静脉高压及多种并发症。它是严重和不可逆的肝脏疾病，我国城市50～60岁年龄男性组肝硬化年死亡率为112／10万，严重危害国民健康及生存质量。

目前对肝硬化的治疗主要是保护残存的肝细胞及对症支持疗法。疗效欠佳。终末期肝病最后考虑肝移植。但供肝来源越来越少，肝移植费用昂贵。手术的并发症，且术后出现的移植排斥等问题困扰患者终生，近来兴起的骨髓干细胞移植治疗肝硬化具有操作简单、可重复进行、免疫源性弱、治疗费用低等优点，有望成为一种有广大应用前景的替代治疗方法。

肝硬化是一种常见的,由不同病因引起的肝脏慢性、进行性、弥漫性病变,引起肝硬化的病因在国内以病毒性肝炎多见,目前对肝硬化的治疗主要是保护肝功能及对症支持疗法,疗效欠佳。终末期肝病最后考虑肝移植,但供肝来源越来越少,肝移植费用昂贵。手术并发症。且术后出现的移植排斥等问题困扰患者终生,近来兴起的骨髓干细胞移植治疗肝硬化具有操作简单、可莺复进行、免疫源性弱、治疗费用低等优点,国内外有多处报道骨髓干细胞移植

二、干细胞来源的选择

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素影响。当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞是一种高度未分化细胞，具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。然而，人类胚胎干细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行人类胚胎干细胞研究。成年动物的许多组织和器官。比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键作用。在特定条件下，成体干细胞或产生新的干细胞，或按一定程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。l临床治疗中造血于细胞应用较早，在20世纪五十年代。临床上就开始应用骨髓移植(BMT)方法来治疗血液系统疾病。到八十年代末，外周血干细胞移植(PBSCT)技术逐渐推广开来，绝大多数为自体外周血干细胞移植(APBSCT)，在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规治疗．且效果令人满意。

干细胞移植治疗肝硬化的干细胞来源必须满足以下几点：

1．具备向肝细胞分化的潜能；

2．来源充足，获取简便；

3．免疫源性低，最好是自体来源，避免免疫排斥反应；

4．不违背医学伦理道德等。

目前用于移植的干细胞主要是骨髓干细胞及脐带血干细胞。骨髓干细胞直接来源于成人的骨髓．采集方便。自体输注不存在免疫排斥反应，且毒副反应轻微，作为干细胞的生物学特性及优势，使其有可能成为干细胞移植的理想选择。骨髓干细胞包括造血干细胞(HSC)及间充质干细胞(MSC)。已有许多动物实验研究骨髓干细胞移植治疗多种疾病模型。表明骨髓干细胞可分化为骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞等，充分显示骨髓干细胞的可塑性及广阔的应用前景。

三、骨髓千细胞在肝脏的可塑性

骨髓十细胞在体内外分化为肝细胞的实验研究已趋于成熟，并有一定的临床实践。多个研究表明骨髓干细胞在体外一定条件下可诱导分化为肝细胞。有报道HSC及MSC均能分化为有功能的肝细胞样细胞17 ，Schwartz等发现细胞牛长环境(如生长因子及细胞外基质)对调节MSC向肝细胞系特异性分化起至关重要的作用．他们将体外培养的MSC中加入肝细胞生长因子(HGF)及成纤维细胞生长因子一4(FGF-4)后同样诱导分化出具有肝细胞特异性标志及超微结构的肝样细胞。Miyazaki M等一I改进了体外诱导方法，用培养原代肝细胞的HGM培养基加上

肝硬化是一种常见的,由不同病因引起的肝脏慢性、进行性、弥漫性病变,引起肝硬化的病因在国内以病毒性肝炎多见,目前对肝硬化的治疗主要是保护肝功能及对症支持疗法,疗效欠佳。终末期肝病最后考虑肝移植,但供肝来源越来越少,肝移植费用昂贵。手术并发症。且术后出现的移植排斥等问题困扰患者终生,近来兴起的骨髓干细胞移植治疗肝硬化具有操作简单、可莺复进行、免疫源性弱、治疗费用低等优点,国内外有多处报道骨髓干细胞移植

肝细胞生长因子(HGF)及表皮生长因子(EGF)，成功诱导骨髓十细胞向肝样细胞分化，不仅表达白蛋白，还表达分化终末期的肝细胞标记物：色氨酸一2，3加氧酶及酪氨酸氨基转移酶。在肝脏损伤条件下诱导能力更强。Khurana St用10％CCI。制作小鼠肝脏损伤模型后，取小鼠血浆，加入包被了细胞外基质(ECM)的培养板中诱导骨髓造血干细胞。模拟肝脏局部再生的微环境，分化后的细胞形成微绒毛表达白蛋白及CKl8，还表达色氨酸一2，3加氧酶及酪氨酸氨基转移酶。将分化后的细胞移植入健康的小鼠体内，能定植在肝小叶，并表达白蛋白及CKl8。不少研究也在动物身上探索体内分化的情况。Terai在小鼠实验中发现，GFP标记的骨髓干细胞定植于CCI．损伤的肝脏，分化为能分泌自蛋白的肝细胞，血清白蛋白水平升高，减少肝纤维化，提高生存率。AbdelAziz MT等“21通过尾静脉移植MSC入CCL．制作的实验性肝硬化大鼠体内。通过检测羟脯氨酸及I型胶原含量评价肝硬化程度，血清AI，T及白蛋白水平评价肝功能。研究发现，MSC可定植于受体的肝脏，且肝脏的l型胶原的表达及羟脯氨酸的含量较未移植MSC组明显下降。血清白蛋白水平明显升高。而ALT改善不显著。可见。MSC除了可自身分化为肝细胞外，还有抗纤维化的作用。Oyagi Sf”1发现，加入肝细胞生长因子(HGF)培养MSC 2周后，甲胎蛋白及自蛋白mRNA阳性，将这些MSC移植入ccL4引起的肝脏损伤的大鼠体内，血清白蛋白水平上升，转氨酶下降．减轻肝脏纤维化程度。

四、骨髓干细胞移植治疗肝硬化的临床应用情况

近年来有更多的临床应用报道。日本的Terai S等在患者全麻下从髂骨抽出400 ml骨髓，分离单个核细胞(MNC)，外周静脉输入，观察24周，白蛋白及总蛋白水平明显升高。Child评分及血清PIilP水平改善，血清肝细胞生长因子水平轻度升高。在肝活检组织检测AFP及增殖细胞核抗原(PCNA)明最增高，整个治疗过程未发生严重不良反应。另外，有文献报道用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员骨髓干细胞。Yannaki E报道2例3次G-CSF动员收集骨髓干细胞再经外周静脉回输，追踪发现。患者Child及MEI。D评分改善。在随后34周随访中，未再因肝硬化而住院。肝内血管形成增多，为肝细胞再生提供支持条件。英国的Madhava Pal治疗9例组织学确诊的肝硬化，通过G-CSF动员骨髓，分离自身CD34+细胞体外扩增后，通过肝动脉移植。治疗过程耐受性好。未见治疗有关不良反应或毒性反应发生，在移植后的4、8、12周，血清胆红素明显下降，转氨酶水平F降。血清白蛋白水平改善，但无统计学意义，7例患者Child评分改善，5例患者腹水改善。除了临床症状及肝功能改善外，文献报道骨髓干细胞移植还有抗肝纤维化的作用。体外实验表明，非接触性培养骨髓间充质干细胞及肝星状细胞，可诱导活化的肝星状细胞凋亡，明显减少胶原沉积。MSC主要通过旁分泌IL-10及TNF-a起作用]。有研究采用绿色荧光蛋白(EGFP)标记的骨髓干细胞重建全身放射后的小鼠骨髓系统，然后注射入CCI，。制作小鼠肝硬化模型。实验发现在纤维化形成的高峰，大量EGFP+

肝硬化是一种常见的,由不同病因引起的肝脏慢性、进行性、弥漫性病变,引起肝硬化的病因在国内以病毒性肝炎多见,目前对肝硬化的治疗主要是保护肝功能及对症支持疗法,疗效欠佳。终末期肝病最后考虑肝移植,但供肝来源越来越少,肝移植费用昂贵。手术并发症。且术后出现的移植排斥等问题困扰患者终生,近来兴起的骨髓干细胞移植治疗肝硬化具有操作简单、可莺复进行、免疫源性弱、治疗费用低等优点,国内外有多处报道骨髓干细胞移植

细胞定植于肝脏，一部分表达基质金属蛋白酶(MMP)-13(一种间质胶原酶)及MMP-9，促进纤维条索的溶解而发挥抗纤维作用。使用GCSF动员骨髓后，使更多的骨髓干细胞定植，表达更多的MMP一9，抗纤维化作用更强(肝脏纤维化范围缩小)。Sakaida亦认为，骨髓干细胞迁移至肝脏纤维条索周围，分泌MMP-2、9、14增多，细胞外基质及胶原条索降解增多，有利于肝功改善。

国内也有多家医院开展骨髓干细胞移植治疗肝病的技术，并取得町喜成果。北京军区总医院姚鹏等抽取患者自体骨髓30～50 ml，Percoll分离液分离出骨髓干细胞。经股动脉穿刺插管。先行选择性肝固有动脉造影，将含有骨髓干细胞的生理盐水稀释至50 ml后经导管缓慢注入。结果发现骨髓干细胞移植治疗后，患者临床症状好转，肝功能、凝血机制及Child评分改善。生存率提高，住院时间缩短。解放军第四六三医院王娟等术前12 h肌肉注射G-CSF 300 mg，动员骨髓干细胞产生后进行骨髓采集。髂后上棘抽取骨髓100～200 ml，Percoll分离液分离骨髓干细胞，股动脉插管达肝固有动脉，将分离后的骨髓干细胞悬液缓慢注入肝内。治疗后肝功能、凝血机制及临床症状改善。解放军第一八○医院肝病中心潘兴南等同样用PercoU分离液分离骨髓干细胞，经肝动脉移植治疗24例终末期肝病患者。移植后12周，患者肝功前清蛋白、清蛋白、总胆红素及总胆汁酸水平，凝血酶原时间和纤维蛋白原水平均有显著性改善，其中以清蛋白及凝血酶原时间最显著。术后12周有10例患者复查肝脏CT，其门脉一级分支平面面积(cm2)为(128．48-t-45．98)对(95．11±32．37)。该断面肝脏面积显著增大。沈阳军区总医院郭晓钟等对40例肝硬化失代偿期患者进行骨髓干细胞移植治疗。移植前2 d给予患者集落细胞刺激因子皮下注射。连续2 d；从髂后上棘抽取骨髓150～200 ml，在体外分离纯化骨髓源性干细胞。其单个核细胞计数为3．6×108／ml～1．8×10”／ml，采用流式细胞仪技术检测CD34+的干细胞数为106／ml～109／ml。经肝动脉将上述干细胞悬液移植入脏．移植后第4周血浆自蛋白明显升高，AI。T、AsT下降。总胆红素水平在移植前后无显著性变化。PT逐渐下降。食欲改善、体力好转37例(92．5％)，腹胀减轻33例(82．5％)，腹水减少、下肢浮肿减轻35例(87．5％)。中山三院高志良等对28例终末期肝病患者进行自体骨髓间充质干细胞(MScs)移植：抽取骨髓分离后经肝同有动脉介入移植，AI，T、TBil明显降，ALB、PTA上升，有不同程度的食欲改善、体力好转、腹胀减轻。

五、展望

综上所述。经过国内外学者的探讨及实践，证明骨髓干细胞移植治疗肝硬化患者可行。并有成效。患者的临床症状得到不同程度好转．肝功能的生化指标如白蛋白、胆红素、转氨酶，凝皿酶原时间，Child-Pugh评分改善，目前应用经肝动脉自体骨髓干细胞移植仅作为疗肝硬化的一种新途径加以探索。由于开展此项工作不久，尚有待完善的方向：建市标准化、

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