DNA甲基化检测方法研究进展

河南农业科学

ＤＮＡ甲基化检测方法研究进展

邢宝松１，郭启祥２，马

强１，阎祥洲１，白红杰１

（１．河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州４５０００２；２．河南省进出境检验检疫局，河南郑州４５０００３）

中图分类号：Ｑ７５文献标识码：Ｂ文章编号：１００４—３２６８（２００７）１１—００１７—０３

分离与杂种优势有关的基因提供一些新的思路。因此，ＤＮＡ甲基化的研究逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。因此，探讨甲基化形成与改变的可能机制，建立准确性高，灵敏度高，操作简单的ＤＮＡ甲基化检测方法，对探讨甲基化调控规律，提高哺乳动物体细胞核移植效率、揭示杂种优势的表观遗传学基础意义重大。

１１．１

ＤＮＡ甲基化是一种重要的遗传外修饰，是表观遗传学（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）的重要组成部分［１］。它参与了动物胚胎发育、基因印迹和Ｘ染色体失活等过程，在基因表达的调控中具有重要作用，异常甲基化可以导致肿瘤的形成。ＤＮＡ甲基化与组蛋白去乙酰化协同调节基因的表达。ＤＮＡ甲基化可以随着外界环境因素的变化而改变。在哺乳动物胚胎移植和体细胞核移植（ＳＣＮＴ）过程中，人工操作会引起ＤＮＡ甲基化修饰改变，从而影响成功率。２００３年，继人类基因组计划结束后，人类表观基因组协会（ＨＥＣ）宣布开始投资和实施人类表观基因组计划（ＨＥＰ）ｃ２１。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱。在农业方面，已经将ＤＮＡ甲基化作为一种分子标记应用于农作物以及家畜动物杂交育种相关理论研究［３￣５］，通过分析亲子代ＣｐＧ岛甲基化的变化差异及其对杂种表现的影响，从表观遗传学角度揭示杂种优势的生物学基础，为提高农作物以及畜禽生产力提供新的途径，也为鉴定和

ＤＮＡ甲基化的研究方法甲基化敏感限制酶方法

甲基化敏感限制酶方法是经典的甲基化分析方

法，主要根据一些限制性内切酶不能切开甲基化的ＤＮＡ序列。由于在真核ＤＮＡ或者哺乳动物ＤＮＡ中，只有ＣＧ相连的胞嘧啶能够被甲基化，因此，在酶切位点内包含ＣＧ序列的限制性内切酶就会遇到问题。这种方法所使用的两个经典酶对是ＨｐａⅡ

一ＭｓｐＩ（ＣＣＧＧ）和ＳｍａＩ—ＸｍａＩ（ＣＣＣＧＧＧ）。

收稿日期：２００７一０７—２０

作者简介：邢宝松（１９６９一），男，河南新密人，助理研究员，博士，主要从事动物遗传育种研究。

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１７

２００７年第１１期

由于第二对限制酶识别序列非常罕见，所以一般都用Ｈ户口ＩＩ—ＭｓｐＩ（ＣＣＧＧ）。两个酶都识别ＣＣＧＧ序列，而当其中的胞嘧啶甲基化时，ＨｐａⅡ不能够将

啶的氨基，在此反应中除ｍＳＣ外其余胞嘧啶均可被转变为尿嘧啶。然后将这些靶序列用特异引物扩增，经过扩增的ＤＮＡ，所有尿嘧啶均转化为可检测的胸腺嘧啶，只有ｍ５Ｃ以胞嘧啶形式被扩增。这种方法是目前所使用的在给定基因组靶序列中分析ｍ５Ｃ最常用的方法。可以检测到每个ＣｐＧ位点的甲基化情况。基于此原理，发展出亚硫酸氢盐去氨基反应后，结合ＰＣＲ扩增的快速方法来检测ｍ５Ｃ，称为甲基化特异ＰＣＲ（ＭＳＰ），这种ＭＳＰ方法运用特别设计的针对甲基化的和非甲基化序列的引物，从而得到特异扩增的甲基化或非甲基化靶序列。目前已经被广泛应用到ＣｐＧ岛甲基化检测。此方法适用范围很广，可以检测包括已知的、接近ＰＣＲ引物的及限制性酶切范围的ＣｐＧ双核苷酸序列的甲基化状况［１

０’。

其切开，这就使得Ｈ加Ⅱ一ＭｓｐＩ能够作为快速甲

基化分析的工具。但是这个方法有些不足：首先，并不是所有的ＣＧ都位于ＣＣＧＧ序列内，意味着一些可能的甲基化位点没有被检测到；另外一个问题是必须用复杂的ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ杂交。这种方法还要求有高分子量ＤＮＡ及有较多甲基化的等位基因，而且仅能检测到限制性内切酶能够识别的ＣｐＧ序列［６］。尽管如此，甲基化敏感限制酶法仍然是甲基化分析的首选方法。

１．２

限制性酶及ＰＣＲ的方法

Ｈｅｒｍａｎ等［７］１９９６年在使用重亚硫酸盐处理的

基础上新建的一种方法。即用限制性内切酶（对甲基化不敏感与敏感的同裂酶）切割后，再用含有酶切位点序列的引物进行ＰＣＲ扩增。检测甲基化敏感酶的ＰＣＲ扩增产物，如果用针对处理后甲基化ＤＮＡ链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对处理后的非甲基化ＤＮＡ链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。这种方法虽然可以提高ＤＮＡ量少时检测的敏感性，但它同样存在不足，比如在限制性酶消化不完全情况下会出现假阳性结果。１．３直接测序法

直接测序法之一是基因组直接测序法。基因组ＤＮＡ经Ｍａｘａｍ－－Ｇｉｌｂｅｒｔ化学裂解法进行处理，并以连接接头介导的ＰＣＲ（１ｉｎｋｅｒ

ｍｅｄｉａｔｅｄＰＣＲ，ＬＭ

１．５其他甲基化分析方法

前面４种方法以及络合物介导ＰＣＲ／肼反应／高锰酸盐反应、原位ＭＳＰ杂交法、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

ｓｉｎｇｌｅ

ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，Ｍｓ—ＳｎｕＰＥ）、结合重

亚硫酸盐的限制性内切酶法（ｃｏｍｂｉｎｅｄｂｉｓｕｌｆｉｔｅ

ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ

ｒｅ－

ａｎａｌｙｓｉｓ，ＣＯＢＲＡ）以及甲基化敏感性单链

构象分析法（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉｎｇｌｅ—ｓｔｒａｎｄ

ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ，ＭＳ—ＳＳＣＡ）等主要应用于

单基因序列特异性甲基化分析和特异性位点ＤＮＡ甲基化分析；目前应用于全基因组序列特异性甲基化分析的方法有：甲基化差异性杂交显示（ｄｉｆｆｅｒｅｎ—

ｔｉｍｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＤＭＨ）、寡核苷酸微

－－ＰＣＲ）对信号强度进行放大，可以增加甲基化检测的敏感性，这是过去一直沿用的研究ＤＮＡ甲基化方法。这种方法的缺点是技术要求较高，而且容易出现假阳性及假阴性。另外一种是由Ｆｒｏｍｍｅｒ等提出的研究ＤＮＡ甲基化方法Ｅ８１。其过程是：重亚硫酸盐使ＤＮＡ中未发生甲基化的胞嘧啶（Ｃ）脱氨基转变成尿嘧啶（Ｕ），而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行ＰＣＲ扩增所需片段后，尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶（Ｔ），最后对ＰＣＲ产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断ＣｐＧ位点是否发生甲基化。这种方法的可靠性及精确度都很高，能检测到目的片段中每一个ＣｐＧ位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，费用也比较高［口］。

１．４

阵列法、基因组限制性酶切扫描法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌａｎｄ－

ｍａｒｋｇｅｎｏｍｅｓｃａｎｎｉｎｇ，ＲＬＧＳ）［‘Ｊ、ＭＢＤ（ｍｅｔｈｙｌ－－ＣｐＧｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｃｏｌｕｍｎ

ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，甲基

化结合区）柱层析法［１１１、联合甲基化敏感性限制性内切酶的ＭＢＤ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ

ｏｆｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ—ＤＮＡ

ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｎｄｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ

ｅｎｚｙｍｅｓ，ＣＯＭＰＡＲＥ－－ＭＳ）Ｃ１２１。

研究甲基化的方法之多，一方面说明了甲基化研究难度大，另一个方面也说明这些方法都存在着一定的限制。面对具体问题，选择最合适的解决方法就显得尤为重要。首先，根据研究目的选择合适方法。应该明确是研究整体水平的甲基化还是特定位点的甲基化，或是要发现全基因组中新的甲基化位点；其次，根据客观条件筛选方法，如：目标序列是否已知，是定量研究还是定性研究，样本来源及数量如何，是否需要高通量的样本检测方法Ｉ最后，全面

甲基化特异性ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ亚硫酸氢盐可以氧化去除基因组ＤＮＡ中胞嘧

ＰＣＲ，ＭＳＰ）

１８．

河南农业科学

分析，选取敏感、可靠、经济、简便的方法，以达到理想的效果。２问题与展望

ＤＮＡ甲基化在哺乳动物中起着重要的调节作用。有充分证据说明ＤＮＡ甲基化在发育和细胞分化过程中对特异基因的表达或者沉默起重要作用。ＤＮＡ甲基化的选择性调节在临床上可以用来预防和治疗癌症。要制定安全有效的针对改变ＤＮＡ甲基化的治疗策略，必须彻底搞清楚对甲基化和去甲基化过程起特异性调节作用的因素。同样，搞清楚参与ＤＮＡ甲基化诱导基因沉默的因素可以使试图选择性调节基因表达的努力变得更为容易。最近的研究已经将ＤＮＡ甲基化和组蛋白去乙酰化作用两种整体机制联系起来，但仍须对ＤＮＡ甲基转移酶、去甲基酶、甲基胞嘧啶结合蛋白、组蛋白去乙酰化作用以及基因转录静止之间的复杂联系作进一步研究。随着甲基化研究的不断深入，甲基化分析技术将逐步完善。完善的研究技术将提供强有力的技术支持，必将探寻到更多的新甲基化位点，从而为表观遗传、胚胎发育、基因印迹及肿瘤研究提供一些新的思路，也为动植物育种提供新一代的分子标记奠定基础。

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ｆａｃｔｏｒｓｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄｔｒａｉｔｓｏｆ

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本刊常用单位符号及换算

依据国家标准，本刊在刊发稿件中一律使用法定计量单位，为便于读者阅读，现将本刊常用单位符号及其换算方法介绍如下：

１长度单位：ｋｍ＝公里，千米，ｍ＝米。ｃｒｆｌ一－－＝－厘米，ｎ－ｌｎ－ｉ＝毫米，换算：１

ｋｍ＝１０００ｍ，１ｍ＝１００ｃｒｎ＝３尺，１哪＝１０ｒｆｔｍ

２重量单位：ｔ＝吨或１０００ｋｇ。ｋｇ＝公斤、千克。ｇ＝克，ｍｇ＝毫克ｌ换算：１ｔ＝１０００ｋｇ．１ｋｇ＝１０００９，１９＝１０００ｍｇ，

５００９＝１市斤，５０９＝１两

３面积单位：ｍ２＝平方米，ｈｍ２＝公顷，ｃｍ。＝平方厘米Ｉ换算：１ｈｍ２＝１００００ｍ２＝１５亩，１亩＝６６７ｍ２４浓度单位ｌ

１

ｒａｇ／ｋｇ。ｍｇ／Ｌ或ｍｇ ｋｇ－１，ｍｇ Ｌ－１．一 Ｌ－１；１×１０１；１ｐｐｒｎ，即百万分之一，不用ｐｐｍ和１Ｘ１铲表示

５时间单位；。天、小时、分钟、秒”分别用“ｄ，ｈ，ｒａｉｎ，Ｓ”表示

（本刊编辑部）

１９

DNA甲基化检测方法研究进展

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

邢宝松， 郭启祥， 马强， 阎祥洲， 白红杰

邢宝松,马强,阎祥洲,白红杰(河南省农业科学院,畜牧兽医研究所,河南,郑州450002)， 郭启祥(河南省进出境检验检疫局,河南,郑州,450003)河南农业科学

JOURNAL OF HENAN AGRICULTURAL SCIENCES2007(11)1次

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