第二节蛋白质结构与功能的关系 - 图文

3.2 蛋白质分子结构与功能的关系

了解蛋白质的三维结构是理解蛋白质如何行使其功能的基础。蛋白质功能总是跟蛋白质与其它分子相互作用相联系，被蛋白质可逆结合的其它分子称为配体。蛋白质—配体相互作用的瞬时性质对生命至关重要，因为它允许生物体在内、外环境变化时，能迅速、可逆地作出反应。蛋白质上的配体结合部位与配体在大小、形状、电荷以及疏水或亲水性质等方面都是互补的。

3.2.1细胞色素的分子进化

1、细胞色素C的一级结构的种属差异和分子进化

从细菌到人，一切需氧的生物体内，都有细胞色素C的存在。细胞色素C是一个具有104~112个氨基酸组成的多肽分子，是一种在需氧细胞的代谢中担任重要角色的蛋白质，在蛋白质一级结构的种属差异研究的蛋白质中占有最重要的地位。这是因为，细胞色素C分子的结构比较简单，大小合适，容易纯化结晶，结构测定也比较容易，因此，是研究分子进化的最好材料。现在已对不同种属来源的细胞色素C，从一级结构，三维结构以及功能等各方面进行了系统的研究。

存在部位与作用：细胞色素C存在于细胞的线粒体中，是参加生物氧化的一种电子传递体，大约在十亿年前，生物进化到需要氧的阶段，即出现了生物氧化过程，于是就产生了细胞色素C，因此，细胞色素C是生物界广泛存在的一种古老的蛋白质。

细胞色素的残基数：脊椎动物的细胞色素C由104个氨基酸残基组成。少数103个，昆虫108个氨基酸残基，植物111－114个残基，一般为112个氨基酸残基。

不同生物与人的CytC的AA差异数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角饺 23 小蝇 25

蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44

以人的细胞色素C为标准进行比较，发现人与黑猩猩的细胞色素C的一级结构完全相同，与恒河猴只相差一个残基，与马相差12个残基。从细胞色素C的一级结构中的氨基酸残基的改变数的多少可以看出，生物从原核到真核，从单细胞生物到多细胞生物，从低等生物到高等生物的进化规律，反映了种属之间的亲缘关系。

2．细胞色素C三级结构活性部位的保守性

同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质，指由共同的祖先蛋白分子经过变异和自然选择而产生的功能上相同、相关并在结构上有某种程度相似性的不同蛋白质。

在进化过程中一级结构始终保持不变的氨基酸残基称为守恒氨基酸残基，在不同物种的细胞色素C一级结构中，则有35个位置的氨基酸残基是完全不变的，因此叫做不变残基或叫做守恒残基，这些守恒残基分散在多肽链的各个部位，在分子进化过程中，细胞色素C的一级结构虽然有很大的变化，但三级结构基本上保持不变。三维结构的关键部位是守恒的，尤其是活性部位的氨基酸残基及其三维排布，均不会发生改变。这是蛋白质发挥其生物功能的基本条件。蛋白质分子的三维结构不能因为变异而受到严重影响。由于分子内部的氨基酸残基通常对维系三维结构比较重要，因此，变异较多地发生在蛋白质分子表面上。 血红素是细胞色素C分子的电子传递中心，在生物进化过程中保持不变。其它不变的氨基酸残基有的是为了保证血红素在蛋白质分子中正确的立体位置，保持多肽的构象形成一个疏水性的狭缝，狭缝的结构严格地决定着整个细胞色素C分子的三维结构，不同物种的细胞色素C的狭缝区域，其疏水性残基一般是保守的，或者是可以保守性取代的残基，脯氨酸在拐角处，甘氨酸没有侧链，体积小，也在拐角处。

保守性取代：指化学性质相似的氨基酸残基之间有相互置换的现象，例如：Leu 与Ile、 Phe 与Tyr、 Asp与Glu之间都能互相替换。

Rossman等人研究了各种蛋白质结构与功能的相似性之后指出，在生物进化的过程中，蛋白质的二级结构、超二级结构以及三级结构存在很大的保守性，同源蛋白质的一级结构允许有种属差异，但生物功能所要求的特定构象不能改变。不同生物的细胞色素C的氨基酸组成是有一些置换，但它们的生理功能却

是相同的。 3．系统树：

根据蛋白质中氨基酸残基的变化情况与古生物学测定生物进化年代相比较，可以发现各种蛋白质分子进化都有其本身的进化速率，称为单位进化周期。

单位进化周期是指蛋白质在进化过程中每一个残基上的变异所需时间。据此分析出细胞色素C的单位进化周期是2640万年，不同蛋白质的单位进化周期是不同的，血红蛋白仅为580万年。

系统树是用计算机分析细胞色素C序列并找出连接分支的最小残基数的方法构建起来的，用其它计算机方法可推断出系统树分支点处的潜在祖先序列。根据系统树不仅可以研究从单细胞生物到多细胞生物的生物进化过程，还可以粗略估计现存的各类物种的分支时间 (图3-34) 。

3.2.2 肌红蛋白的结构与功能 3.2.2.1 肌红蛋白的分子结构

肌红蛋白(myoglobin)存在于肌肉中，能贮藏O2，供生物氧化之用。抹香鲸肌红蛋白是第一个经X-射线晶体衍射测定出精确三维结构的球蛋白，它的分子包括一条153个氨基酸残基组成的多肽链和一个血红素，其多肽链的氨基酸序列。

肌红蛋白多肽链中的残基75~80％处于α-螺旋中，其余为无规卷曲，整个肽链有8个长短不一的螺旋段，即A.B.C.D.E.F.G.H，在侧链基团相互作用下盘曲形成4.3nm×3.5nm×2.3nm扁园的球体。绝大多数亲水残基分布在分子表面，使肌红蛋白可溶于水；疏水残基则埋藏于分子内部，血红素结合于E与F螺旋之间的裂隙内(图3-35)。

图3-35肌红蛋白的三级结构

图3-34 生物进化的系统树

肌红蛋白分子表面有一狭缝，E螺旋和F螺旋位于狭缝两侧，形成一个疏水微环境。肌红蛋白的辅基血红素就结合在这个狭缝内。血红素的侧链丙酸基伸到分子表面，在生理pH下，它们带负电荷，Fe2+与卟啉环四个吡咯N原子配位(图3-36A)，F8-His残基咪唑环N-3占据第五个配位位置，Fe2+在邻接His(F8)一侧，距离卟啉平面约0.03nm。O2占据第六配位位置，在卟啉平面另一侧与血红素可逆地结合。脱氧肌红蛋白中第六配位空置：而在高铁(Fe3+)肌红蛋白中H2O占据这个位置。在狭缝另一边E7His并未与血红素结合，称为远侧组氨酸，靠近第六配位位置(图3-36B)。

图3-36血红素辅基的结构

肌红蛋白由3个外显子编码：外显子Ⅰ编码1至30(NA1到B2)，外显子Ⅱ编码31至105(B3至G6)，外显子Ⅲ编码106至153(G7至HC5)（图3-32）。研究表明，39至139(C4到H14)的片段与血红素结合关系密切。有人用蛋白酶从脱辅基肌红蛋白N-端和C-端各切去一段，制备出相当于32至139的多肽，加入血红素后构成微型肌红蛋白，在体外系统能可逆地与O2结合，与天然肌红蛋白相似。就氧合功能而言，1-31和140-153贡献不大，但不排除这些片段在稳定分子结构、促进合成、折叠和运输以及种系发生等方面可能的作用。

图3-37 血红蛋白β-亚基的形成

3.2.2.2 肌红蛋白的功能

血红素在水中可以短暂地氧合，然后形成血红素-O2-血红素夹层中间物，很快产生不能氧合的高铁血红素。虽然肌红蛋白中真正与O2结合的是血红素，但是肽链起着围篱作用。由于血红素结合在肽链绕成的疏水狭缝中，远侧His的位阻效应防止了夹层复合物的形成，避免了Fe2+氧化或流失，使血红素可以长时间可逆的氧合-放氧，完成O2载体的使命。同样是血红素辅基，在细胞色素中它是电子载体，在过氧化氢酶中参与过氧化氢分解为水和氧的催化过程。可见辅基的功能在一定程度上依赖于它所结合的多肽链提供的微环境。

为了给肌红蛋白肽链的围篱作用提供实验支持，James和Collman合成了围篱铁卟啉复合物，在铁卟啉平面一侧，有一个咪唑衍生物占据Fe2+第五个配位位置，另一侧有疏水侧链基团形成保护O2结合的围篱(图3-38)，它对O2的亲和力与肌红蛋白相仿。

CO是许多含碳物质不完全燃烧的产物，也是血红素在体内降解的产物之一。游离血红素对CO的亲和力比对O2的亲和力大25000倍：而肌红蛋白对CO的亲和力仅比对O2的亲和力大200倍。这是因为游离血红素与CO结合时，C-Fe2+键与C≡O键在一条直线上；而血红素与O2结合时Fe2+-O键与O=O键之间形成121°的夹角。在肌红蛋白中，远侧His(E7)的存在对其与CO的结合显然会产生更大的位阻效应，结果大大降低了对CO的亲和力和CO中毒的危险，保证在生理条件下肌红蛋白能有效地履行贮藏和输送O2的功能(图1.37)。

脱氧肌红蛋白中α-螺旋含量约60％，三维结构比较松散，稳定性下降。与血红素结合后，构象发生变化，α-螺旋含量恢复至75％，分子结构比较紧凑，

稳定性也明显提高。这说明血红素辅基对肽链折叠也有影响。 3.2.3 血红蛋白的结构与功能

血红蛋白(hemoglobin, Hb)存在于脊椎动物红细胞中，是运输O2和CO2的工具。Hb是第一个得到X-射线衍射结构分析初步结果的蛋白质，还是第一个与生理功能相联系的蛋白质。从异常血红蛋白一级结构研究中提出了分子病的概念，从Hb与O2结合中发现了协同效应。从而成为迄今认识蛋白质结构与功能关系最好的范例。

3.2.3.1 血红蛋白分子结构

血红蛋白由四个亚基组成(α2β2)，每个亚基含一条多肽链和1个血红素辅基。α亚基多肽有141个氨基酸残基，β亚基多肽链有146个氨基酸残基，二者有60个相同，约占42％，其中有23个残基与Mb相同。Hb的亚基与Mb的氨基酸序列虽有明显不同，但血红素结合部却非常保守，而且它们的二、三级结构也十分相似，仔细对比也有一些差异(表3-5)。

表3-5 血红蛋白α-和β-链与肌红蛋白二、三级结构的异同

肽链区段 A螺旋 AB非螺旋 B螺旋 BC螺旋 C螺旋 CD螺旋 D螺旋 E螺旋 EF螺旋 F螺旋 FG螺旋 G螺旋 GH螺旋 H螺旋 HC螺旋 残基总数

肌红蛋白（Mb） α-螺旋 非螺旋 α-螺旋 非螺旋 α-螺旋 无规卷曲 α-螺旋 α-螺旋 无规卷曲 α-螺旋 无规卷曲 α-螺旋 无规卷曲

α-链（α） =Mb A16-B1不同 =Mb =Mb 有310螺旋 都不同于Mb 不存在 无规卷曲 EF2~5不同于Mb =Mb =Mb

G1~3为310螺旋 ≈Mb

β-链（β） =Mb 少2个残基 =Mb =Mb 有310螺旋 CD5~7不同于Mb =Mb

E18~20为无规卷曲 (α=β) =Mb =Mb (α=β)

GH1~3不同于Mb (α=β) (α=β) 146

α-螺旋基(24个残基) 含20个残基 含5个残基 153

含3个残基 141

血红蛋白的四个亚基按四面体排布，亚基间凹凸互补，构成一个6.5×5.5×5nm的四面体。两个α与两个β亚基按双重对称轴排布，沿X或Y轴旋转180°，外形相似；沿Y轴两个α与两个β亚基间均有空隙，形成中心空穴(图1.38)。

α1/β1或α2/β2之间接触面较大，包括G10~H9之间以及B、D螺旋的34个残基，由17~19个氢键将其缔合成稳定的二聚体(α1/β1和α2/β2)，不受血红素和O2结合的影响。α1/β1或α2/β2之间接触面较小，涉及α1的CD和β2的FG非螺区中19个残基，将两个二聚体缔合为四聚体，此种结合易受O2和血红素结合的影响。

脱氧血红蛋白中,亚基间的静电相互作用（图1.39），以及分子中心空穴周围两个β链的N-端-NH3+、Lys-82（EF6）、His-2和His143（HCl）共8个正电荷与空穴中的效应剂分子2，3-二磷酸甘油酸（BPG）之间静电相互作用（图1.40）对稳定脱氧血红蛋白的四级结构发挥着重要作用。这些静电相互作用在血红蛋白氧合后不复存在。

3.2.3.2 血红蛋白的变构效应

Mb和Hb均为储藏和运输O2的载体，Mb是单体，Hb为四聚体，在氧分压较低时Mb对O2的亲和力远大于Hb，如以P50表示一半结合部位被O2饱和时的氧分压，Hb的P50=26Torr，Mb的P50=1Torr。

Mb+O2 MbO2

设K为MbO2解离常数，则K?[Mb][O2]MbO2；若Y为Mb氧饱和度，则

Y?[O2][O2]?KY?；用pO2代替[O2]，P0代替K，上式改写为：

，是一个典型的双曲线方程

pO2pO2?P50

对Hb来说，Hb+nO2 Hb（O2）。

?pO2???，或Y??nn?P?1?Y[pO2]?(P50)?50?Y[pO2]nYn

取对数，olg

1?Y=nlogpO2-nlogP50

上式即Hill方程，是一个直线方程，Y=0.5时n(斜率)值即为Hill系数。Mb的n=l，Hb的n=2.8，表明Hb与O2结合存在协同效应(或变构效应)，即先结合的O2影响同一分子中空闲的O2结合部位对后续O2的亲和力(详见别构酶一节)。若以纵坐标表示Y，横坐标表示pO2，Mb的氧合曲线为双曲线，Hb的是S型曲线(图1.41)。

Hb的氧合曲线反映了HbO2的解离特征：即在氧分压较高的区间，只有很少HbO2解离，表现为S型曲线上段：在氧分压很低时，只剩下不多的HbO2缓慢地

解离，表现为S型曲线下段；只有在S型曲线中段相应的氧分压区间，HbO2随pO2下降快速解离。如果肺泡中pO2=100Torr，活动肌肉毛细血管中pO2=20Torr，P50=30Torr，n=2.8，在肺泡中Y=0.97，在活动肌肉毛细血管中Y=0.25，二者之差△Y=0.72，即在此条件下血液从肺泡流到活动肌肉中将释放所携带的72％的O2假如没有协同效应，即n=l，其他条件不变，那么Y肺泡=0.77，Y毛细血管=0.41，△Y=0.36，可见在同样条件下协同效应使Hb的O2释放量增加一倍。实际测算表明，pO2从100降至20Torr，MbO2只释放10％的O2。显然，血红蛋白适合于从肺泡到组织的O2运输，肌红蛋白则适合于通过组织间液从血液接受O2，

将它储藏在细胞内备用。

人体的血红蛋白除HbA(α2β2)外，还有HbA2(α2δ2)和HbF(α2γ2)。β、γ、δ链的一级结构仅有个别氨基酸不同，二、三级结构十分相似。成人血液中HbA2仅占2％，HbF不到1％，而胎儿血液中HbF是主要血红蛋白，在足月的新生儿血液中HbF占70—80％。在生理条件下，HbF对O2的亲和力大于HbA，使得胎儿通过胎盘循环从母体得到O2(图1.42)。

Hb对O2的亲和力对pH和[CO2]的变化敏感，pH值下降时，Hb对氧的亲和力降低，HbO2解离曲线右移，S型渐趋双曲线型。实际上血液pH变化很小，而[CO2]增大同样导致Hb对O2的亲和力下降。Hbα链N-端氨基可逆地与CO2结合。在代谢活跃的组织中，[CO2]增大或pH下降促进HbO2放O2，而O2的释放又促进Hb与CO2结合，这种现象称为Bohr效应(图1.43)。

1967年，Reinhold Benesch和Ruth Benesch发现2，3-二磷酸甘油酸(BPG)是血红蛋白的别构效应剂。在成熟的人红细胞中[Hb]≈[BPG]，每个Hb在其中央空穴结合一分子BPG，通过与周围正电荷集团的相互作用使Hb的四级结构更趋稳定(见图1.39)。如果没有BPG，Hb的氧合就不存在协同效应，在生理条件下，BPG的结合使Hb对O2的亲和力下降到1/26。在某些内外因素影响下净输氧量下降时，机体可通过调整BPG浓度进行补偿。例如肺气肿病人因支气管气流受阻，Hb不能充分氧合，动脉血pO2仅为50Torr，只有正常值的一半。由于BPG浓度从4.5升至8.0mmol/L，使P50从26升至31Torr，动脉O2饱和度从0.86变到0.82，静脉O2饱和度从0.60变为0.49，因此净输O2量△Y从0.26增至0.33。又如一个人从海拔0米到海拔4500米时，48小时内他的红细胞中[BPG]从4.0增至7.5mmol/L，净输O2量相应增大(图1.44)。由于γ亚基HCl是Ser而不是His，不能与BPG形成盐键，致使胎儿血红蛋白HbF(α2γ2)对BPG的结合力小于HbA(α2β2)，因此对O2亲和力较高。 3.2.3.3 血红蛋白别构效应的分子机制

Hbα-亚基的单体具有对O2的高亲和力，氧合曲线为双曲线，与Mb极为相似。孤立的β亚基易形成四聚体，β

4

被称为HbH，没有HbA的变构效应。因

此，血红蛋白的别构性质来源于亚基间的相互作用。

(1)氧合中血红素铁原子的变化：在脱氧血红蛋白中，由于连接血红素F8His咪唑环与血红素卟啉环间的位阻斥力，以及血红素铁外层电子处于高自旋状态，半径较大，不能进入卟啉环中央小孔，而离开卟啉平面约0.06nm：同时血红素向F8His方向稍微隆起，呈现圆顶形(图1.45)。在氧合过程中，铁外层电子变成低自旋状态，半径缩小了13％，移动0.06nm，进入卟啉平面中央小孔，血红素完全呈平面状态。血红素的状态既受O2结合的影响，又依赖于Hb整体的四级

结构。

(2)亚基三级结构的变化：在血红蛋白亚基中，血红素及F8His与邻近的15个侧链基团有紧密的联系。因此，氧合过程中铁原子的位移牵动F8His位移以及F螺旋、EF和FG片段等的位移(图1.46)。F螺旋向H螺旋移动二者之间的空隙变小，迫使HC2的Tyr侧链从隙中移开，导致链间盐键的断裂。这样，血红素上氧合引起的变化，触发亚基内部的构象改变，导致亚基交界面上的结构改变。 (3)四级结构的变化：氧合引发的构象变化传递到亚基界面上，促使两个原体(α1β1)与(α2β2)相对旋转15°，平移0.08nm(图1.47)。脱氧状态时α1亚基C7Tyr-42酚基与β2亚基G1Asp99羧基间的氢键，在氧合引起的亚基位移中被破坏，而在α1亚基G1Asp9的羧基与β2亚基G4Asn102酰胺基间产生一个新的氢键(图1.48)。

氧合过程中亚基的旋转和位移，使维持四级结构的盐键断裂，两个β亚基的铁原子间的距离从3.99减为3.31nm，分子中央空穴变小以致容纳不下BPG，盐键的断裂也引起β亚基的构象改变，如E11Val侧链移开，解除了O2结合的空间位阻。按照序变模型，上述血红蛋白氧合过程变构效应的机制概括于图1.49。

3.2.2.4 异常血红蛋白

编码血红蛋白多肽链的基因发生突变，导致个别氨基酸取代、缺失、肽段融合，延长甚至整个肽链的缺失，形成300种以上的异常血红蛋白。由于取代发生的位置、范围、性质各不相同，对血红蛋白结构和正常功能的影响也就有所不同，有的异常血红蛋白结构和功能均无重大改变，有些异常血红蛋白的结构发生显著变化而导致疾病，因此，对于阐明蛋白质结构与功能的联系极有参考价值。根据变异的性质，可将异常血红蛋白分为以上四类。

(1)分子表面发生变异的Hb：分子表面发生取代的异常Hb已发现一百多种，绝大多数不影响Hb的稳定性和功能，在临床上是无害的。但有少数可引起临床症状，尤其是镰刀状红细胞贫血症，患者红细胞含异常的HbS，红细胞呈镰刀形，易破碎，寿命短，从而导致严重的贫血，甚至危及生命。现已查明，镰刀状红细胞贫血患者编码珠蛋白β链的基因有一个碱基突变(T→A)结果β6(A3)的Glu被Val取代，致使HbS比HbA少2~4个负电荷，pI从6.68增至6.91，在脱氧状态下溶解度仅为HbA的1/25。Val取代Glu使HbS每个亚基外侧产生一个粘斑，而脱氧HbS还有与粘斑互的部位，互相粘结，形成细长的脱氧HbS聚合体(图1.50)。几股这样的聚合体盘旋缠绕，形成在电镜下可见的直径为17nm和21.5nm的两种纤维。直径21.5nm的螺旋纤维更常见，有14股螺旋纤维。这些纤维使红细胞变成易碎的镰刀形。红细胞破碎后释放出HbS纤维，使血液粘度增大，血流不畅，小血管阻塞，造成供O2不足又恶性循环地导致形成更多的镰刀形红细

(3)．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于—80℃。勿反复冻融已制备好的样品。

(4)．通过超速离心清除所有的杂质。

(5)．加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白。 3．细胞裂解的方法 (1)温和的裂解方法

1)渗透裂解：主要应用于血细胞、组织培养细胞；通常用低渗溶液悬浮细胞。 2)冻融裂解：常用于细菌、组织培养细胞；通常用液氮迅速冷冻细胞，随后在37℃融化，反复几次。

3)去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜、裂解细胞，释放其内容物；常用于组织细胞；通常用含有去污剂的裂解液重悬细胞，也可以直接用样品裂解液或重泡胀溶液进行裂解。另外，如果阴离子去污剂SDS用于裂解细胞，可以用含有兼性离子去污剂、非离子去污剂的裂解液稀释样品，也可以用丙酮沉淀以分离出SDS。

4)酶裂解法：某些细胞含有细胞壁，需要首先用酶来消化细胞壁。例如：用溶菌酶(1ysozyme)来消化细菌的细胞壁；用纤维素酶(cellulase)和果胶酶(pectinase)消化植物；用溶细胞酶(1yticase)消化酵母细胞壁。此法常用于植物、细菌和真菌。通常这些酶在等渗溶液中处理细胞。 (2)剧烈的蛋白裂解

1)超声裂解法：超声仪可产生超声波，通过切应力来裂解细胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果，但需注意应最大可能减少热量和气泡的产生。此法常用于细胞样品。通常用迅速的超声重悬细胞，并在冰上冷却。

2)弗氏压碎器(French Pressurecell)：在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞。此法常用于含有细胞壁的微生物，如细菌、酵母和藻类。通常将细胞悬液置于预冷弗氏压碎器中，加压后收集粗提液。

3)研磨法：用研钵或研杵研磨细胞，此法常用于固体组织、微生物。组织和细胞通常冻存于液氮中，随后研磨成粉状。可加少量石英砂研磨。

4)机械匀浆法：常用于固体组织。匀浆器可用于破碎细胞或一些软组织；而混合器或一些研磨设备用于一些较大的组织。通常将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液(3～5倍于组织体积)，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液。

5)玻璃珠匀浆法：通常剧烈振荡的玻璃珠可以打破细胞壁，释放细胞内容物。此法常用于细胞悬液或微生物。用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置于结实的管子里。每克细胞(湿重)加入1~3g玻璃珠，剧烈振荡1 min，冰浴1min。重复上述步骤得到蛋白质样品。

4．用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解

1)PMSF(苯甲基磺酰氟)：是一种不可逆抑制剂，常用浓度为1 mmol/L，灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于可在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇(DTT)或者β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减少，因此，在晚些时候可加入含巯基的试剂。

2) 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸(EDTA、EGTA）：通常应用1mmol／L的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。

3) 肽蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽(1eupeptin)，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A，(pepstatin)，抑制天冬氨酸蛋白酶(如酸性蛋白酶)的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin)，抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin)，抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在pH=9的时候不能抑制蛋白酶。

4) 甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(TLCK），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK)：通常作用浓度在0.1~0.15mmol/L，这些柑同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。

5．蛋白质的分步提取技术 具体操作步聚如下：

第一步：水溶液的提取：约5~15 mg细胞加入2ml裂解液I（40mmol/L Tris）。反复冻融3~4个循环，加入适量的Dnase I和Rnase A，振荡混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提取物。

第二步：含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取：向第一步的沉淀中加入500μl的裂解液II（8mol/L Urea, 4% CHAPS, 100mmol/L DTT,40 mmol/L Tris，0.5% Pharmalyte 3-10，20μg/ml Dnase I和5μg/ml RnaseA）。剧烈振荡混匀，离心收集上清即为第二步提取物。

第三步：含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取：将上一步所余的沉淀用40mmol/L Tris清洗后，加入200μl裂解液III（5 mol/L Urea, 2mol/L thiourea, 2%SB3-10， 2mmol/L TBP, 40L Tris，0.5% Phar-malyte 3-10，20μg/ml DNase I和5μg/ml RNase A）。强裂振荡混匀，离心后收集上清，保存于-70℃。

分步提取法所采用裂解液的溶解性能是逐渐增加的。第一步裂解液成分是40mmol/L Tris的无离子水溶液，有效溶解亲水性的蛋白质。

3.3.2.2二维电泳与细胞蛋白质的分离

聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，PAG)是通过丙烯酰胺(acrylamide)单体和交联剂N，N—甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene bisacry—lamide，常称甲叉双丙烯酰胺)按一定比例混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合而形成的交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应从而发生交联，形成网状结构。如图3- 所示。

图3- 聚丙烯酰胺凝胶的单体结构和网状结构

Smithies和Poulikt(1956)最早引入了二维电泳技术，他们将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合来分离血清蛋白质。随后二维电泳技术经历了更多的发展，并将聚丙烯酰胺介质引入应用，特别是等电聚焦技术在一向的应用，使基于蛋白质电荷属性的一向分离成为可能。目前所应用的二维电泳体系是由O’Farrell等首先于1975

年发明，其原理是根据蛋白质等电点和相对分子质量的特异性，将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离(等电聚焦)，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离(十二烷基硫酸钠—聚丙唏酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE)(图4-2)。在最好状态下，传统等电聚焦技术和SDS-PAGE在20 cm左右长度的凝胶中可在各自方向上分辨出100个不同的蛋白质条带，因此，理论上的二维电泳分辨能力可达到10 000个点。目前已有实验室在30cm×40cm的大胶上获得这一分离效果。利用特殊的样品制备方法可大大提高二维电泳的分辨能力。

Bio-Rad公司的PROTEAN IEF(图4-4)，其编程自动化及高至8000V或10 000V的电压使得IEF在一个晚上即可完成，大大缩短了2-DE的进程。

3.3.2.3图像分析与细胞蛋白谱的建立

二维电泳分离后的蛋白质点经显色方法如考马斯亮蓝染色、酸性银染、碱性银染、负性染色、荧光染色或放射性标记等染色处理后；通过图像扫描存档，最后呈现出来的是在二维方向排列的呈“满天星“状排列的小圆点，其中每一个点代表一个蛋白质。从该图谱可以初步得到该细胞内蛋白质的分布范围(偏酸性或偏碱性)、表达蛋白质的个数(凝胶点的数目)、蛋白质的大概相对分子质量、等电点（通过相对分子质量和等电点分析校正）、蛋白质相对表达丰度(点的灰度值)。需要说明的是，由于在电泳过程中涉及到亚基内或亚基间二硫键的还原和烷基化处理，亦即高级结构的去除，因此，通过二维电泳分离所得到的实质上是构成蛋白质的各个亚基，而非完整的功能蛋白质。

蛋白质组学研究工作流程

双向电泳→蛋白质染色→蛋白质图谱影像对比 →蛋白质鉴定→纲络上资料库搜寻和整理 蛋白质组分析的基本方法和技术

(一)双向凝胶电泳（Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DGE)蛋白质组技术的核心。 第一向：等电聚焦(Isoelectrifocusing gel electrophoresis,IEF）电泳 IEF电泳原理

蛋白质是两性物质，在不同pＨ溶液下所带净电荷不同，当其净电荷为零时的pＨ值即为该蛋白的等电点pＩ。蛋白质在具有pＨ梯度的电场中，当pＨpＩ时，向正极移动。随着移动，蛋白质的净电荷逐渐减小，直至为零，此时pＨ＝pＩ，蛋白质不再移动而被聚焦。

由此可知，等电聚焦是利用具有不同等电点的蛋白质在线形pＨ梯度下泳动，并聚焦于其pＩ值相同的pＨ位置，达到蛋白质混合物分离的方法。

1966年瑞典学者vesterberg和Svensson合成了两性电解质，并成功地用于肌红蛋白的分离，其后瑞典LKB厂生产两性载体，商品名为Amphaline以及成套电聚焦设备 1、线形pＨ梯度的形成:

1) .载体两性电解质pＨ梯度

常用两性电解质Ampholine,是一种多氨基多羧基两性化合物的混合物。ＭＷ：300—1000Da,直流电场下，从正极→负极连续pＨ梯度，分辨率可达0.01pH单位（图示原理）

当将两性电解质Ampholine放入槽中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正电，在阴极的碱性介质中就会失去质子而带负电，这样就会受附近的电极所排斥而向相反方向移动，即可形成一个由阴极向阳极逐步升高的pH梯度

2) .固相pＨ梯度

固相pＨ梯度：Immobiline由7种丙烯酰胺衍生物组成，可与丙烯酰胺和甲叉双丙烯

酰胺共同聚合，使pH梯度固定于凝胶中→Immobiline干胶条→IPG（Immobilized pH gradients）.分辨率可达0.001pH单位

2、等电聚焦的优点

有很高的分辨力：蛋白质的等电点仅相差0.02pH单位， 电聚焦的作用抵消了扩散作用，区带越走越窄。

第二向：SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)

SDS-PAGE原理

SDS与蛋白质的疏水部分结合，破坏蛋白质的折叠结构，因此，蛋白质亚基的电泳迁移取决于亚基分子量的大小，而电荷因素已被忽略，由于分子筛作用，按蛋白质分子量大小进行分离。

等电聚焦操作步骤、SDS-PAGE电泳程序将在生物化学研究法中介绍 3.3.2.1二维电泳蛋白质提取与样品制备

3.3.2.2二维电泳与细胞蛋白质的分离

3.3.3.3图像分析与细胞蛋白谱的建立

3.4生物体内蛋白质的降解

3.4.1蛋白质的酶促降解

生物体内蛋白质的降解是在一系列蛋白水解酶的作用下加水使肽键断裂生成氨基酸的过程。蛋白水解酶又叫做蛋白酶，也叫肽酶。根据酶对蛋白质分子的作用部位不同，将肽酶分为肽链内切酶（endopeptidase）、肽链外切酶(exopeptidase)和二肽酶三类。如图10-1所示

图10-1蛋白水解酶作用示意图

1．肽链内切酶和外切酶

肽链内切酶可以水解蛋白质内部的一些肽键，如胰蛋白酶（trypsin）水解精氨酸、赖氨酸等残基的肽键，胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸等残基组成的肽键，胃蛋白酶（pepsin）专一性水解芳香族氨基酸的氨基形成的肽键，弹性蛋白酶(elastase)的专一性差，可以水解各种脂肪族氨基酸组成的肽键。蛋白质在各种蛋白酶的作用下分解为许多小肽，暴露出许多末端，然后在肽链外切酶的作用下，进一步水解成各种氨基酸。肽链外切酶主要有氨肽酶和羧肽酶。氨肽酶(aminopeptidase)作用于肽链

氨基端的第一个肽键，每次分解出一个氨基酸或一个二肽。二肽酶(dipeptidase)可以水解所有的二肽成为两个氨基酸。

氨肽酶胃蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰蛋白酶羧肽酶H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOHCH2CHCH3CH3OHRCH2（CH2）　CH2　NH2　CH2　SHR

图3-12 蛋白质水解酶的专一性

羧肽酶(carboxypeptidase) 的作用是水解肽链羧基末端的肽键，对不同氨基酸组成的肽键也有一定的专一性。如羧肽酶A优先作用于中性氨基酸为羧基端的肽键；羧肽酶B水解以碱性氨基酸为羧基端的肽键。 2．蛋白酶的分类

生物体内的蛋白酶按其活性部位的结构特征可以分为下列四种类型：

①丝氨酸蛋白酶类（serine proteinase）(EC3.4.2.1):活性部位含有组氨酸和丝氨酸残基，受异丙基氟磷酸(DIFP)的强烈抑制。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等均属此类。

②半胱氨酸蛋白酶（cyseine proteinase）(EC3.4.2.2)：活性部位含有半胱氨酸残基，对于碘乙酸、对羟基汞苯甲酸等抑制剂十分敏感。一些植物蛋白酶如无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等均属于此类。

③酸性蛋白酶(acid proteinase)(EC3.4.2.3)：活性部位含有天冬氨酸残基，最适pH在5以下。抑胃肽(pepstatin)专一地抑制这类酸性蛋白酶。胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶属于此类。

④金属蛋白酶(metalloproteinase)(EC3.4.2.4)：含有Zn2+、Mg2+等金属离子，受金属螯合剂EDTA等的抑制。嗜热菌蛋白酶、信号肽酶以及氨肽酶、羧肽酶等属于这一类。

由于一些蛋白酶的专一性，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶常用在蛋白质一级结构的测定中。 3.4.2蛋白质的选择性降解 1.胞内蛋白质降解的意义

生物细胞的组分在不断地更新。像细胞其它组分一样，蛋白质也在不断地降解和更新，蛋白质的生命周期短至几分钟，长至几星期或更长的时间。如表10－1所示。

一般情况下，生物细胞不断地将氨基酸合成蛋白质，又不断地将蛋白质分解成氨基酸，这种看似浪费的过程实际上有着非常重要的功能：第一，以蛋白质的形式贮存养分，并在代谢需要时将之降解，以便为代谢过程提供必需的营养物质；第二，去除对细胞有害的异常蛋白。例如生物体内由于基因突变、生物合成误差、自发变性、自由基破坏以及环境胁迫和疾病可能会导致异常蛋白的产生，及时将之降解，以免干扰正常的生命活动；第三，去除多余的酶和调节蛋白。细胞内蛋白质的降解速度与合成速度受到严格的调控，半衰期短的蛋白虽

然不到总蛋白的10％，但却包括许多代谢途径的限速酶。例如：控制细胞周期、细胞分化和细胞增殖的蛋白质，调节基因表达的转录因子等。由于它们的半衰期很短，便于通过基因表达和降解对其含量进行精确、快速的调控，以便对表达产物进行控制；第四，维持体内氨基酸代谢库。以体重70kg的健康成人为例，体内约有组织蛋白14000g，每日分解和重新合成的蛋白质约300～500g，由食物提供的氨基酸约70～100g，自己合成的氨基酸约30～40g，血液和组织内的氨基酸（代谢库）约300～700g。另外，为了有效地利用转基因技术生产有价值的蛋白质，也需要了解细胞内蛋白质降解机制，以免这些外来蛋白被转基因生物破坏。

表10－1鼠肝中某些酶的半衰期

酶

短半衰期

鸟氨酸脱羧酶 RNA聚合酶I 酪氨酸氨基转移酶 丝氨酸脱水酶 PEP羧化酶

长半衰期

醛缩酶 3-磷酸甘油醛脱氢酶

细胞色素b 细胞色素c

2．胞内蛋白质降解系统：

半衰期/h 0.2 1.3 2.0 4.0 5.0 118 130 130 150

溶酶体系统（酸性系统）：溶酶体含有约50种水解酶，其中有一系列的蛋白酶。溶酶体维持其内部pH约为5左右，其所含酶类的最适pH值均为酸性，因此又称为酸性系统。溶酶体可以降解细胞通过胞吞作用摄取的物质。它们也可回收细胞内的组分，这些胞内组分被包裹在液泡中，并与溶酶体融合。在营养丰富的细胞中，溶酶体的蛋白质降解是没有选择性的。但是在饥饿细胞中，这种降解会消耗必需的酶和调节蛋白，因此溶酶体也具有一种选择途径，即引入和降解含有5肽Lys-Phe-Glu-Arg-Gln或密切相关序列的胞内蛋白质，这种选择途径只有在长时间禁食后才被激活。在对禁食做出衰退反应的器官中对此5肽蛋白进行有选择的丢失（例如肝脏和肾），而在对禁食不作此反应的器官中则不会丢失（例如脑和睾丸）。许多正常和病理过程都伴有溶酶体活性的增加。例如在分娩后出现的子宫回缩，这个肌肉型器官的重量在9天内从2kg减少到50g ，就是这一过程的明显例子。许多引起炎症的慢性疾病，如风湿性关节炎就涉及到溶酶体酶的释放，从而降解周围组织。 蛋白质降解的泛肽途径（碱性系统）：蛋白质降解的泛肽（ubiquition）途径是在pH7.2的胞液中起作用，因此又称为碱性系统，主要水解短寿命的蛋白质和异常蛋白。泛肽是一个由76个氨基酸残基组成的小分子蛋白质，因其广泛存在且含量丰富而得名。它是目前所知的高度保守的真核生物蛋白之一。 蛋白质通过与泛肽共价相连而携带了降解标记。

Avram Hershiko将此过程用3个步骤进行阐述（图10-3），说明泛肽化涉及的反应：

(1)经过一个需要ATP的反应，泛肽的末端羧基通过硫酯键与泛肽激活酶(ubiqutin-activating enzyme，E1)共价相连。 (2)然后，在泛肽结合酶（ubiqutin—conjugation enzyme ，E2）的作用下泛肽转移到几种小蛋白质中

图12-3 蛋白质降解的泛肽途径

的某一小蛋白质的巯基上，形成活化的泛肽。

(3)泛肽－蛋白连接酶（ubiqutin-protein ligase，E3）将活化的泛肽从E2转移到待降解的蛋白质即被选定的蛋白质上，使其C－端羧基与底物蛋白中赖氨酸残基的ε－氨基形成异肽键（isopeptide bond）。通常几个泛肽分子一起连接到某个待降解的蛋白质上，有50个或更多的泛肽分子可形成一个多泛肽链与待降解的蛋白相连，其中每一个泛肽分子的48位Lys的ε－氨基与后一个泛肽分子的C末端羧基形成异肽键，完成对底物蛋白的多泛肽化标记。某些蛋白质必须进行多泛肽化标记才能降解，当不需要降解时，蛋白质上的多泛肽化分子在泛肽异构酶的催化下可以去除。E1、E2、E3负责识别不同类型的短寿命蛋白和异常蛋白。此外还有一类泛肽C－端水解酶，负责校正错误的泛肽化以及把成串的泛肽水解成单体以重复利用。被多泛肽化标记的靶蛋白由26S蛋白酶体（proteasome）迅速降解成小的肽段，再由其它肽酶水解成游离氨基酸。

26S蛋白酶体由一个20S蛋白酶体的中空圆筒形核心组成，两端各覆盖一个19S的“帽子”。Robert Huber

利用X－射线测定了20S蛋白酶体的结构，显示该蛋白质复合体由6182个氨基酸残基组成，分子量为700kDa，包含14个α－型亚基和14个β－型亚基，构成4个7聚体（α7β7β7α7）叠成的空桶状结构。两端的α7构成了底物进入和产物逸出的通道及19S调节亚基结合部位，中部的β7β7具有多种蛋白酶活性。如图10－4所示。19S调节亚基至少含有18种蛋白组分，在ATP存在下与20S组成有活性的26S蛋白酶体。虽然α亚基和β亚基在结构上十分相似，但是只有β亚基有蛋白水解酶活性。结合X－射线结构和酶学研究发现，β亚基通过一种尚未完全了解的机制催化肽键水解，这一机制不同于其它已知的蛋白水解机制，它涉及β亚基的N末端Thr残基的参与。其活性位点位于20S蛋白酶体的圆筒之内，20S蛋白酶体将其多肽底物切割成约8个残基的片段，随后这些片段扩散到蛋白酶体外。细胞质中的肽酶再将这些小肽降解成氨基酸。但是连接在靶蛋白上的泛肽分子并不被降解，而是重新回到细胞中再次利用。

图10-4 酵母20S蛋白酶体的X射线结构

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