实时荧光定量PCR技术

天为时代核酸系列讲座之院

华中科技大学同济医学

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)北京天为时代科技有限公司 欧阳志荃 2005-05-20

讲 座 提 纲

实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用

实时荧光定量PCR定义

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法

实时荧光定量PCR 原理常 规 PCR技术：

实时原理

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析

实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量？

定量原理

通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析

介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值

实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线

荧光基团

荧光检测元件

扩增曲线图：横坐标：扩增循环数(Cycle);纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集

实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值荧光信号阈值 (threshold ): 前15个循环信号作为荧光本底信号

(baseline),即样本的荧光背景值和阴 性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3~15个循环的 荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽 量选择进入指数期的最初阶段，并且保证 回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值

实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈 值时所经过的扩增循环次数

C(t) value

实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性

纵 轴 ： 荧 光 信 号 量

横轴：PCR反映循环数

Ct值的特点：

相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性

实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n:扩增反应的循环次数 X:第n次循环后的产物量 X0:初始模板量 Ex:扩增效率

实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct

(2)

整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的 循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量

实时荧光定量PCR 原理 --------- 标准曲线

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小

Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模 板量

实时荧光定量PCR原理

绝对定量

确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量

Sample

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讲 座 提 纲

实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用

实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记 非特异性荧光标记：1、 SYBR Green

特异性荧光标记：2、TaqMan

3、Molecular BeaconQ Q

4、Amplisensor

R

实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法

SYBR Green

SYBR Green 法

工作机理

SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位

SYBR Green SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光

复性和延伸时，形成双链DNA, SYBR Green 发荧光，在 此阶段采集荧光信号。

实时荧光定量PCR原理Excitation

SYBR Green I 工作原理3’No Emission

5’

SG SG SG

SG5’

3’Excitation

SG5’ 3’ SG

SGSG

SGSG

SG3’ 5’

Emission

实时荧光定量PCR原理

SYBR Green I 熔解曲线分析

荧光强度

Tm

温度

Tm值：DNA解链一半时的温度

实时荧光定量PCR原理

SYBR Green I 熔解曲线分析

-dI dT

Tm

将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)

SYBR Green 法

融解曲线分析融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确

非特异性产物

融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确

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