血管内皮生长因子基因多态性与急性心肌梗死的相关性研究

分类号：五号宋体字 密级：五号宋体字 UDC：五号宋体字 学校代码：11065

指导教师姓名及专业技术职务四号宋体

四号宋体字 学科专业名称 论文提交日期 论文答辩日期 实际提交日期填写四号宋体字 评阅时可填待定时间或为空 评阅时此项若待定可为空

答辩委员会主席

（此封面模版只限答辩前论文评阅使用，通过答辩后修改定稿的学位论文，

请使用校学位办公室统一印制的封面装订）

血管内皮生长因子基因多态性与急性心肌梗死的相关性研究

摘 要

目的：急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI) 冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth faetor，VEGF)是对血管内皮细胞有高度特异性的有丝分裂原，高浓度的VEGF可有效促进血管内皮细胞生长、分化及迁移，诱导新生血管

形成，促进体内组织建立起丰富毛细血管网；并且可增加毛细血管后静脉和小静脉通透性，而且还与心肌梗死患者免疫功能低相关。VEGF基因具有高度多态性，目前至少发现了30多个单核昔酸多态性(SNP)位点。本研究通过检测入选的急性心肌梗死患者的VEG血清浓度、VEGF的SNPs、生化、血常规、尿常规等，进行如下分析：1．VEGF基因SNPs与AMI发病风险的关联分析；2.血浆VEGF浓度与VEGF基因SNPs的关系；3.VEGF血浆水平与MACCE发生率相关性；4．LV- remodling与VEGF浓度及多态性的相关性；5.心肌梗死面积分别与VEGF血清浓度及VEGF的SNP的相关性。为急性心肌梗死的研究提供更多的临床数据参考。

方法：采用基于医院的病例一对照研究方法，将入选的患者分为急性心肌梗死患者组（研究组）和对照组，检测入选的急性心肌梗死患者的VEGF血清浓度、VEGF的SNPs、生化、血常规、尿常规；检测随访6月后的左室功能（左室重塑）；AMI发生6个月后再行如下检查：a．研究对象随访观测MACCE；b.行核素心肌显像测定心肌面积；c.行超声心动图测定左室重构。通过记录6个月内的心血管事件发生率。对比和研究以下数据：1．VEGF基因SNPs与AMI发病风险的关联分析；2.血浆VEGF浓度与VEGF基因SNPs的关系；3.VEGF血浆水平与MACCE发生率相关性；4．LV-remodling与VEGF浓度及多态性的相关性；5.心肌梗死面积分别与VEGF血清浓度及VEGF的SNP的相关性。

结果：通过对比和研究以下数据：1．VEGF基因SNPs与AMI发病风险的关联分析，结果表明VEGF基因SNPs与急性心肌梗死正相关（r=0.312）；2.血浆VEGF浓度与VEGF基因SNPs的关系成正相关(r=0.573)；3.VEGF血浆水平与MACCE发生率相关性分析表明，VEGF血浆水平、多态性与MACCE正相关（r=0.618）；4．LV- remodling与VEGF浓度及多态性正相关(r=0.187)；5.心肌梗死面积分别与VEGF血清浓度及VEGF的SNP的相关性结果表明，心肌梗死面积与VEGF血清浓度成正相关（r=0.736），心肌梗死面积与VEGF的SNP成正相关（r=0.582）。

结论：血管内皮生长因子的检测数据与急性心肌梗死其他检测的数据相关性分析表明，各数据间均呈正相关，对急性心肌梗死的血管内皮生长因子的检测对急性心肌梗死的研究诊断具有重要意义。

关键词：血管内皮生长因子；急性心肌梗死；单核苷酸多态性；血管生成；易感性

Abstract

Objective：Acute myocardial infarction (acute myocardial infarction, AMI) coronary acute myocardial ischemia and hypoxia caused by persistent necrosis. After more than a clinically severe and persistent chest pain, rest and nitrates can not complete remission, accompanied by increased serum enzyme activity and sexual ECG changes, may be complicated by arrhythmias, shock or heart failure, and often life-threatening. Vascular endothelial growth factor (vascular endothelial growth faetor, VEGF) is a vascular endothelial cells have highly specific mitogen, a high concentration of VEGF can effectively promote vascular endothelial cell growth, differentiation and migration, induce angiogenesis, and promote the body organizations Since the rich capillary network; and after the increase permeability of capillaries and venules veins, but also associated with lower immune function in patients with myocardial infarction. VEGF gene is highly polymorphic, currently found at least more than 30 single-core Xi acid polymorphism (SNP) sites. In this study, serum concentrations of selected VEG detection of acute myocardial infarction, VEGF of SNPs, biochemistry, blood, urine, etc., make the following analysis: 1. VEGF gene SNPs associated with AMI risk analysis; 2 between plasma concentration of VEGF and VEGF gene SNPs in; 3.VEGF plasma levels correlated with the incidence of MACCE; 4. LV- remodling polymorphism and VEGF concentration and correlation; 5 infarct size, respectively, serum concentrations of VEGF and VEGF SNP correlation. Provide more clinical data reference for the study of acute myocardial infarction.

Methods：A case-control study of hospital-based approach, the patient will be enrolled into patients with acute myocardial infarction (study group) and the control group, the serum concentrations of VEGF selected patients with acute myocardial infarction, VEGF of SNPs, biochemistry, blood, urine; detection followed up for 6 months after left ventricular function (left ventricular remodeling); AMI occurred six months after check the following: a. Study follow-up observations MACCE;. B-line determination of cardiac radionuclide myocardial perfusion imaging area;. C echocardiography left ventricular remodeling. By recording the incidence of cardiovascular events within six months. Compare and study the following data: 1. VEGF gene SNPs associated with AMI risk analysis; 2 between plasma concentration of VEGF and VEGF gene SNPs in; 3.VEGF plasma levels correlated with the incidence of MACCE; 4. LV-remodling polymorphism and VEGF concentration and correlation; 5 infarct size, respectively, serum concentrations of VEGF and VEGF SNP correlation.

Results：By comparing and research the following data: 1. VEGF gene SNPs associated with the risk of AMI analysis showed that VEGF gene SNPs are associated with acute myocardial infarction (r = 0.312);. 2 plasma concentration of VEGF and VEGF gene SNPs in relation to a positive correlation (r = 0.573); 3.VEGF plasma levels and the incidence of MACCE correlation analysis showed that, VEGF plasma levels of polymorphism and MACCE positive correlation (r = 0.618); 4. LV- remodling positive correlation with VEGF concentration and polymorphism (r = 0.187);. 5 infarct size were serum concentrations of VEGF and VEGF SNP correlation results showed that the myocardial infarct size and serum VEGF concentrations were positively correlated (r = 0.736), myocardial infarct size and VEGF SNP positive correlation (r = 0.582).

Conclusions：Vascular endothelial growth factor correlation analysis of the data and testing data to other detection of acute myocardial infarction showed a positive correlation between the data, the detection of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction has important significance for the study of the diagnosis of acute myocardial infarction.

Key words: Vascular endothelial growth factor; acute myocardial infarction; single nucleotide polymorphism; angiogenesis; susceptibility

目 录

引 言............................................................................................................................ 1 第一章 研究对象与方法.............................................................................................. 5

1.1研究对象.......................................................................................................... 5 1.2研究对象血标本收集及DNA提取 ............................................................... 6 1.3 仪器与试剂..................................................................................................... 8

1.3.1实验仪器............................................................................................... 8 1.3.2实验试剂............................................................................................... 9 1.4 外周血白细胞DNA的提取 ........................................................................ 10 1.5 DNA纯度的测定 .......................................................................................... 10 1.6 血标本的采集及DNA的提取 .................................................................... 19 1.7 统计学分析方法........................................................................................... 22 第二章 实验结果........................................................................................................ 24

1 两组研究对象的一般特征.............................................................................. 24 2 VEGF-460 T/C和- 1154G/A单核苷酸多态性分布与急性心肌梗死发病风险相关性分析.......................................................................................................... 24 3 PEDF基因各SNP位点等位基因频率的组间比较 ...................................... 27 4 eNOS基因SNP位点等位基因频率的组间比较 .......................................... 29 5 Ang-2基因SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较 .......................... 30 6 相关SNP与ROP的logistic分析 ................................................................. 31 第三章 讨论................................................................................................................ 33

1 VEGF基因SNP与ROP发病的关联分析 .................................................... 33 2.本实验中釆用的研究方法和策略的探讨....................................................... 43 3 展望.................................................................................................................. 45 结论.............................................................................................................................. 56 参考文献...................................................................................................................... 57 综 述............................................................................................................................ 1 攻读学位期间的研究成果.......................................................................................... 19 致 谢.......................................................................................................................... 20

学位论文独创性声明.................................................................. 错误！未定义书签。

引 言

急性心肌梗死（AMI）是临床上常见的急危重症，随着社会老龄化，现代生活节奏的加快，饮食习惯的改变以及社会、心理等因素的影响。我国AMI的发病率也呈现逐年升高的趋势。根据流行病学调查显示，AMI的发病率各地报道不一，地区之间有很大差异。据国外资料显示，北美和欧洲各国AMI的发病率如下[1]：美国（508/100 000），加拿大（605/100 000），芬兰（82/100 000），英国（823/100 000），法国（31/100 000），意大利（270/100 000），澳大利（22/100 000）和日木（101/100 000）。尽管是在同一国家的不同地区，AMl的发病率也呈现有较大差异：西班牙吉普斯夸省的数据调查结果显示，其发病率为313/10万[2]。英国伍斯特市对1975年-2005年AMI的总体发病率作统计所得，每10万人就有66人发病[3]；在澳大利亚，原住民的发病率为4030/10万，高于非原住民[4]。我国急性心肌梗死的发病率为45/10万-55/10万。从上述流行病学调查结果来看，发达国家AMI的发病明显高于我国。这种差异的出现可能与种族、气候、生活水平、生活习惯、饮食习惯等不同有关。在美国，每年有96 000例小于65岁的女性患者被诊断为AMI，占全部女性AMI患者的20‰，而在ST段抬高型急性心肌梗死（Stelevation myocardial infarction，STEMI）患者中，女性的平均发病年龄为76岁，男性62岁，非ST段抬高型急性心肌梗死（non-Stelevation myocardial infarction，NSTEMI）女性平均发病年龄为76岁，男性为70岁[5]。国内研究显示，AMI在中青年（＜60岁）的发病率逐渐增加[6]，北京阜外心血管病医院对近15年11859例AMI患者年龄演变趋势作研究发现，首发和再发病例中男性平均年龄随年度增加总体呈下降趋势，再发病例中女性平均年龄则总体上升，且高峰发病年龄段1997年-2008年稳定在65岁-74岁[7]。在哈尔滨，男性发病高峰期为41岁-70岁，女性41岁-50岁进入发病期，高峰期为51岁-70岁，天津医科大学第二医院对1961例AMI患者调查显示，患者年龄分布呈负偏态分布，年龄跨度为74岁，平均发病年龄63.31岁[8]。我国AMI的发病年龄有年轻化的趋势，这与我国中青年精神压力大、饱餐、酗酒、过度疲劳[9]、吸烟、运动不足、肥胖、盐敏感性、血脂异常[10]等危险因素关系密切与≥60岁老年人相比。美国一项调查发现在235257例NSTEMI和126172例，STEMI患者中分别有女性102081例，占43%和17236例占37%[5]。西班牙吉普斯夸省的一项研究中，<60岁的女性

1

AMI患者首次发作后28 d的生存率比男性高，但≥60岁各年龄段首发心肌梗死后5年生存率则相反[2]。国外另有报道，女性患者心肌梗死后3个月的死亡率高于男性11:5。在欧洲，OPTIMAAI跨国公司在7个西欧国家（丹麦、芬兰、德国、爱尔兰、挪威、瑞典和英国）发起一个调查试验显示，AMI女性患者患病平均年龄和医院死亡率均高于男性[11]。在欧洲，女性AMI发病高峰年龄为61岁~70岁，发病的平均年龄比男性晚10岁[12]。在我国，山东大学附属齐鲁医院研究发现，AMI女性患者在院死亡率比男性高出5%。在安徽AMI男性发病率明显高于女性；男性发病有年轻化趋势，发病年龄小于女性，但女性绝经后AMI的患病例数明显升高[13]。在太原地区，AMl的男女发病比例接近3:1，年龄低于60岁者比例更高[14]。在天津市，男女患者的比例为2.03:1，但中数位年龄女性比男性大6岁，>60岁的女性患者构成比大于男性，部分年龄组绝对病例数甚至超过男性[8]。从流行病学资料中，我们发现60岁是AMI女性患者的年龄分水岭，60岁之前，男性的患病率远高于女性，一旦超过60岁，女性患病率和死亡率增幅大于男性，国内外研究其原因不尽相同，国外认为女性患者容易得急性高血压和缺少导管介入诊断[9]，女性患者接受溶栓治疗较少有关[11]；雌激素对心血管系统的保护作用，而老年患者绝经后卵巢合成和分泌雌激素的功能衰减，血中雌二醇水平明显降低[12, 15]。国内则认为，女性高血压、糖尿病、高脂血症的发病率，以及Killip，心功能分级均比男性高[11]，发病至入院时间、空腹血糖、严重心律失常和急性左心功能不全是预测女性急性心肌梗死患者近期死亡的独立预测因素[16]。瑞士心肌梗死注册中心研究显示，AMI再狭窄事件取决于距离上一次病发时间。但总体而言，尽管考虑其他不良因素，急性心肌梗死的再狭窄时间仍在不断下降[17]。在台湾有对银屑病患者跟踪随访5年的结果研究显示，银屑病可能会成为亚洲人AMI的独立危险因素[18]，美国以医疗系统为基础的队列研究显示，艾滋病患者的梗死率高于非感染艾滋病毒患者少[19]。由炎性细胞分泌的基质金属蛋白酶（matriXmctalloprotcinascs，MMPs）是降解细胞外基质的锌依赖性酶家族的成员[20]，其中MMP-1，MMP-3，MMP-8和MMP-9在动脉粥样硬化易损斑块的水平要比纤维斑块明显升高[21, 22]。炎症因子在冠心病的整个演变过程包括斑块的破裂都具有重要作用[23]，白介素-6（IL-6）更是被多番证实在急性冠脉综合征中有显著提高[24]。C反应蛋白（CRP），血浆脂蛋白-a（Lp-a）、同型半

2

肤氨酸（HCY）成为了AMI患者新危险因素的前三位[25]。陈连娣[26]对86例AMI患者进行回顾性分析，发现高水平的CRP是急性心肌梗死的危险因素，该检测因子可以有效地评估AMI的发生率及临床治疗观察。陈红英等[27]对136例AMI患者研究发现，AMI患者血浆Lp-a水平，与冠状动脉狭窄程度，梗死相关动脉（IRA）血流量、闭塞率及密切相关。据INTER-HEART研究显示，在我国，经过调整其他混杂因素，来源于工作、家庭以及经济的心理压力，泪丧的情绪，负性生活事件以及差强人意的生活环境都是增加急性心肌梗死的危险因素[28]。心理社会因素在AMI发生中的作用应予充分的重视，其中负性生活事件作为心理社会因素中较为客观的指标，预防负性生活事件的发生可减少l4.83%的AMI发生[25, 29]。

过去30年中，急性心肌梗死（AMI）病人的短期和长期病死率都有非常显著的降低，主要得益于药物治疗和介入治疗方案的不断完善。诸多随机临床试验证实，阿司匹林、β受体阻滞剂、溶栓治疗、他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和氯吡格雷等药物能够显著降低AMI病人的病死率或病残率，高危病人得益更多。另一方面，经皮冠状动脉介入治疗通过迅速开通闭塞的冠状动脉、挽救濒死心肌，进一步改善AMI病人的预后及生活质量。与介入治疗相比，强化的药物治疗方案不仅价格便宜，而且更容易推广实施。在我国，AMI 的介入治疗和药物治疗都远未达到最佳水平。冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）是严重危害人类健康的常见病和多发病，是许多微效累加基因和环境因素共同作用产生的多基因复杂疾病，遗传因素在CHD发生中起着重要的作用。在基因组中，不同个体的DNA序列上的单个碱基的差异被称作单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）。SNPs检测对于多基因疾病如冠心病的遗传易感性探讨起重要作用。相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单体型（haplotype）。在复杂性疾病研究中，由多个变异位点组合构成的单体型分析优于单个SNP的分析。少数的SNP是有功能性的变异:发生在基因调控区域能调控基因转录，发生在基因编码区则能影响蛋白质的功能。大多数不具有功能性的SNP则可以作为寻找致病基因的标志。因此在大规模的病

3

例对照关联研究中，当某些等位基因频率比正常人高时则可以提示这些SNPs可能与该疾病相关[30-32]。

总之，VEGF基因多态性几乎与全身各个系统都可能相关，是目前的研究热点和重点。分子靶向药物治疗已是当今急性心肌梗死综合治疗不可或缺的手段，VEGF基因多态性的检测有利于找到准确的靶向位点。尽管各国学者对VEGF基因多态性与急性心肌梗死的关系进行了大量深人的研究，但不容忽视的一个现实是:研究几乎是单中心、有明显的区域、国度以及种族的限制，基于此VEGF基因多态性的研究的结果无法全球共享，因此多中心、大样本量、跨区域、多种族的研究是很有必要的。

4

第一章 研究对象与方法

1.1研究对象

选取2013年3月到2014年3月期间于青岛大学医学院附属医院心内科病房住院的急性心肌梗死患者，釆用病例对照研究。

心肌梗死组：Ml组患者630例，其中男469例、女161例，平均年龄（63.02±9.78）岁。均选自2005年7月至2012年8月入住青岛大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，符合世界卫生组织关于缺血性心脏病的命名及诊断标准，其中急性心肌梗死391例，陈旧性心肌梗死239例。

对照组：对照组600例，其中男429例，女171例，平均年龄（62.03±10.05）岁。选自同期因疑似冠心病入住青岛大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，均无典型胸痛症状，经心电图、运动平板、心肌酵谱等排除冠心病诊断，所有入选者经冠脉造影证实其主要血管完全正常。

本研究所有受试者均排除了既往炎症相关疾病（包括哮喘、过敏史、关节炎、风湿性心脏病），癌症，慢性肝病，肾衰竭，辦膜性心脏病及其他心脏疾病。所有受试者均为中国青岛地区汉族人，个体之间无血缘关系。对照组与Ml组相比，年龄及性别构成差异均无统计学意义（P>0.05）。该研究在执行过程中严格符合赫尔辛基宣言并获得了医院的伦理委员会的批准。所有入选者均征得患者或其家属同意并签署知情同意书。

我们详细收集了所有研究对象的基本资料，主要包括年龄、性别、身高、体重、体重指数（body mass index，BMI）、吸烟史、高血压史、糖尿病史，以及血浆总胆固醇（total cholesterol，TC）水平、甘油三醋（triglyceride，TG）水平、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein- cholesterol，HDL-C）水平、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）水平。体重指数（BMI）=体重（kg）/ 身高（m2）吸烟史定义为：正在吸烟或既往有吸烟史，吸烟指数（吸烟时间，年X每天吸烟量，支）大于100。高血压诊断标准为:静息时收缩压（systolic blood pressure，SBP）大于140mmHg，或者舒张压（diastolic blood pressure，DBP）大于90minHg，和/或在行降血压治疗。糖尿病的诊断标准为：空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）大于7.8mmol/L和/或在行降血糖治疗。

5

1.2研究对象血标本收集及DNA提取 1.2.1 样品的收集管理

向每位研究对象收集血液（抗凝血）有形成分约4ml。从白细胞中提取DNA，完成相关基因型的鉴定。为保障课题样本釆集器械的安全质量，要求抽血时使用统一购置塑胶抗凝真空管（2ml， EDTAK3，标准紫色橡皮密封盖）;采血管上标明患者编号、姓名和病历号;采il前仔细核对研究对象编号和负压釆血真空管编号一致，确认空腹情况（确认是否饮食、饮食品种、数量和时间）。 1.2.2 DNA提取步骤（适用于10ml全血）

1. 登记血样及白细胞保留情况，有问题及时反馈。

2. 估计血样总量为4ml，加入全血血样3倍体积1×的红细胞裂解液至50ml离心管，贴好标签。

3. 用一次性吸管将血样全部吸取至50ml离心管中，并用少量红细胞裂解液清洗取血管2次，清洗液移入50ml离心管，注意样本标签和50ml离心管标签的一一对应，翻转混合多次，直至溶液由混油变澄清。

4. 3500g离心15分钟。（如果离心不彻底可以酌情增加转速或时间） 5. 小心取出离心管，将上清液（为破坏后的RBC碎片）缓慢倒入废液叙，将剩余沉淀充分震荡。

6. 用微量移液器向样品中加入浓度为20ug/ml蛋白酶K 32ul，白细胞裂解液5ml，充分震荡150秒混句至完全液化。

7. 充分混合后，置37℃水浴中孵化30~60分钟。

8. 从水浴锅中取出后，将样本放到-20℃冰箱中冷却5min至室温。 9. 拿出后，加入蛋白沉淀液（-20℃保存）2ml，高速震荡20秒至褐色沉淀出现。

10. 3500rpm离心10min。

11. 离心后，将上清液移至装有5ml异丙醇的管中，注意标签的一一对应，充分轻柔摇混至白色絮状物出现。

12. 3500rpm离心10分钟。

13. 离心后，倾出异丙醇及其他溶液，将离心管倒置在滤纸上大约10-15分钟至挥发干净。

6

14. 向其中加入75%酒精（-20℃保存）清洗DNA及脱盐，3500rpm离心10min。

15. 离心后倾出酒精，倒置于新滤纸上干燥15分钟。 16. 加入DNA储存液0.8ml，放置室温过夜。

17. 第二天测定DNA纯度与浓度并做记录，分装DNA保存于4°C或更低温度。

1.2.3 聚合酶链反应(PCR)扩增

各基因型检测的PCR引物序列已在之前的文献中详细介绍。引物在生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR扩增包含CCL5 rs 2107538位点，反应总体积为25ul，其中20μM的引物各lμl，Taq DNA聚合酶0.1μl，dNTP2μl，MgCh DNA模板Iμl，l0×PCR buffer 2.5μl补水至25μl。反应条件：95℃预变性2分钟，95℃变性40秒，50℃退火40秒，72℃延伸40秒，1个循环。95℃变性40秒，50℃退火40秒，72℃延伸40秒，34个循环。72℃延伸5分钟，保存于4℃。

PCR增包含CCL2rs024611位点，反应总体积为30μl，其中20μM的引物各1μl，TaqDNA聚合酵0.1ul，dNTP2ul，MgCl21.5μl，DNA模板Iμl，lOxPCRbuffer3III补水至30til。反应条件：95℃预变性5分钟，94℃变性40秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，1个循环。94°C变性40秒，52°C退火30秒，72°C延伸30秒，29个循环，72°C延伸10分钟，保存于4°C。PCR扩增包含rs333位点，反应总体积为25μl，其中20nM的引物各Iμl，TaqDNA聚合酶

dNTP2μ1，MgCb1.5μ1，DNA模板Iμl，补水至25μ1。反应条件:95°

C预变性2分钟，95℃变性20秒，62℃退火60秒，72°C延伸30秒，1个循环。95℃变性20秒，62℃退火60秒，72t:延伸30秒，31个循环。72°C延伸5分钟，保存于4°C。CCR5基因扩增的产物直接用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定分析，凝胶显像仪下观察、记录、拍照。电泳过程使用TaKaRa公司的DL500DNAMarker。其由50bp、500bp的DNA片段组成，第一条带的DNA片段长度为50bp，在50bp、200bp之间的每个DNA片段间相差50bp，在200bp~500bp之间的每个DNA片段间相差100bp。整个Marker梯度句称清晰。当纯合突变发

7

生32个碱基缺失时，则出现一个190 bp的片段。在本研究中所有受试者中均未发现CCR 532突变基因型。

PCR扩增包含CCR2 rsl 799864位点，反应总体积为25μl，其中20μM的引物各TaqDNA聚合0.1μl，MgCI2 1.5μl，DNA模板1μl，10×PCR buffer 2.5μl补氷至25μl。反应条件：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，57.3℃退火30秒，72℃延伸30秒，1个循环。94℃变性30秒，57.3℃退火30秒，72℃延伸30秒，34个循环，72℃延伸5分钟，保存于4℃。

琼脂糖凝胶的配置：在称量好琼脂糖粉末中加入适量的TAE缓冲液，微波炉加热煮满两次并摇匀，稍微冷却后以0.1μl/ml的浓度加入Gel Red染料，均匀倒入制胶架中，赶走气泡，待30分钟后凝胶凝固；将PCR扩增产物在此凝胶中跑胶，电压控制在100-120V，约40分钟后在Gel Doc 2000凝胶成像系统上观察实验结果。 1.3 仪器与试剂 1.3.1实验仪器

（1）常用的一般实验器材（北京百泰克生物技术有限公司）

（2）微量加样器（2.5 Hi、10 Hi、20 Hi、100 uU 500 n 1、1000wl）（德国 Eppendorf） （3）-80°C超低温冰箱（美国Thermo Forma） （4）-2℃冰箱（青岛海尔公司）

（5）漩祸混合器（上海医科大学仪器厂） （6）BACKMAN离心机（德国） （7）Sigma3kl5离心机（德国） （8）Sigina3k30离心机（德国）

（9）电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司DK-8D型） （10）DU800核酸蛋白分析仪（德国Beckman DU800） （11）超纯水系统（siMPLicnr）

（12）定量 PCR 仪（Applied Biosystemsl2720, USA） （13）Midea微波炉

（14）Bio-rad maxi电泳槽（北京六一仪器厂） （15）DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）

8

（16）UVP凝胶成像分析系统（北京赛宝奥科技有限公司） （17）202- ZA型电热恒温烤箱（上海阳光实验仪器公司） （18）MDF- U50V- 86e低温冰箱（日本三洋公司） （19）PeR扩增仪Mastereycler5333（德国Eppendorf公司） （20）DYY-HIZ稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂） （21）医用微波炉（上海中达医学应用研究所）

（22）Eppendorf Research移液器（德国Eppendorf公司） （23）DYY-III 28 A型电泳槽（北京六一仪器厂）

（24）凝胶成像分析仪Alphalanger 2200（美国Anlai公司） （25）SW-CJ- 2FD型净化工作台（苏州安泰空气技术公司） （26）离心机LXJ- 64- 01（北京医疗仪器修理厂） （27）台式离心机PQ- 1600A（上海培清科技有限公司） （28）电子天平PB3O22- S（瑞士Mettler公司） 1.3.2实验试剂

（1）Triton- X100 （Sigma） （2）三经甲基氨基烷(Tris) （Sigma） （3）乙二胺(EDTA) （Sigma） （4）十二烷基磺酸钠(SDs) （Sigma） （5）蛋白酶K （Merck，Germany） （6）10 mmol/L dNTPs （赛百盛生物有限公司） （7）琼脂糖 （Sigma） （8）溴化己锭 （Sigma） （9）100 bp DNA ladder （赛百盛生物有限公司） （10）Taq- DNA聚合酶 （赛百盛生物有限公司） 限制性内切酶：(Mnll，Bshl236x)

（11）Mnll （生工生物工程有限公司） （12）Bshl236I （生工生物工程有限公司） （13）引物合成 （赛百盛生物有限公司）

9

1.4 外周血白细胞DNA的提取

采集每位研究个体的静脉血5ml，经构椽酸钠抗凝，置4℃冰箱保存，并于采血后1周内提取外周血白细胞DNA。

DNA提取采用蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法。具方法：外周血5ml加冷蒸馏水至50ml，2500rpm室温离心10min，弃上清。重复2~3次至红细胞完全裂解。加入预冷的0.1% Triton-X 10045ml用以上方法再次离心去上清，并洗涤1~2次。于沉淀中加入3ml DNA提取液，充分混匀，悬浮白细胞，加10% SDS 150μl（终浓度0.5%）剧烈振荡至无凝块。加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml（1mg/ml约400ul），混匀，37℃消化过夜。然后，加入5mol/L的NaCl 1.2ml，剧烈振荡15s，2500rpm室温离心15min。将上清倒入另一离心管中，弃沉淀。上清液中加入100%乙醇8ml，颠倒混匀，挑出DNA至高压灭菌的Eppendorf管中，以70%乙醇洗涤1~2次，倒置Eppendorf管井使乙醇挥发干净。以200μl TE溶解DNA，4℃至少放置24h，彻底溶解后经电泳或测OD值定量。 1.5 DNA纯度的测定

紫外分光光度仪测量260nm和280nm两个波长处的吸光度，通过计算A260/280来检测各个样本DNA浓度和纯度。将各个样本DNA浓度调整一致，-20℃保存待用。

1.5.1 各基因SNP位点及引物

釆取候选基因策略，参考相关文献，选取候选基因及SNP位点，釆用PrimerPremier5.0软件，结合引物设计原则设计各多态性位点引物。 1.5.2 SNPs基因分型:

大部分的SNP基因分型由上海邃志生物技术公司使用美国西昆诺姆公司(Sequenom， Inc.)的MassARRAY实验平台提供检测服务，该平台主要是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的核心技术。通过PCR扩增，SAP酶处理，延伸引物弟碱基延伸，树脂除盐纯化，芯片点样，质谱检测等实验步骤，最终使用Typer4.0软件分析实验数据，获得基因分型结果。(1)原理:将念有目标SNP的DNA序列进行PCR扩增后，加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒(10-9S)强激光激发，由于基质分

10

子经福射后能吸收能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight，TOF)由检测器来检测，离子质量越小，就越快到达。理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的。 1.5.3 PCR反应

I.根据已抽提样品编制384孔反应表,注明每孔对应的DNA样品的编号和所用引物。II.按表在384孔板各孔中分别加入luLDNA模板,贴膜,2000 rpm / 10秒离心后备用。III.按下表配制PCR反应液:(以样本为例)

表 1 PCR反应液配方 Table 1 PCR reaction liquid formula

试剂名称 H2O

PCR Buffer(10×, 含15mM MgCl2) MgCl2 (25mM) dNTP(2.5 mM each) 引物使用液 Hotstar Taq(5U/μL) 终体积

1 rxn(μL) 0.95 0.625 0.325 1 1 0.1 4

384 rxn(μL) 380 250 130 400 400 40 1600

注:以上384孔反应液有4%过量。

IV.取一排12联管,每孔加入配置好的PCR反应液133μL,短暂离心后备用。 V.用10ul排枪取12联管中PCR反应液4ul,加入已有luLDNA的384孔板中,使各孔终体积为5ul。(注意枪头不要碰到384孔板中的DNA样品,如果碰到需调换枪头)

VI.将装有5ul反应液的384孔板短暂离心后放入PCR仪,运行名为“PCR\的反应程序。

VII. PCR反应程序结束后,将384孔板短暂离心后备用,可在4°C保存。 ③SAP处理I.配制SAP反应液按以下表次序配制SAP反应液(以样本为例)

11

表 2 SAP反应液配方 Table 2 SAP reaction liquid formula

试剂名称 H2O

SAP Buffer(10×) SAP酶(1U/μL ) 终体积

1 rxn(μL) 1.53 0.17 0.3 2

384 rxn(μL) 612 68 120 800

注:以上384孔反应液有4%过量。

II.取一排12联管,将SAP反应液以每孔66μL分装,短暂离心后,用lOul排枪分装于384孔PCR反应板,每孔加2μL,封膜、离心。

IIL将已加入SAP反应液的384孔板放入PCR仪中,运行名为\”的反应程序。SAP程序:37℃,40min→85℃, 5min→4℃, forever IV.反应结束,将384孔板取出短暂离心备用。 ④延伸反应

I.配制iPlex反应试剂

表 3 iPlex反应液配方 Table 3 iPlex reaction liquid formula

试剂名称 H2O

iPlex Buffer(10×) iplex Termination mix 引物使用液 iPlex enzyme 终体积

1 rxn(μL) 0.755 0.2 0.2 0.804 0.041 2

384 rxn(μL) 302 80 80 321.6 16.4 800

注:以上384孔反应液有4%过量。

II. 取一排12联管，将iPlex反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10uL排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2hL，封膜、离心。

III.将已加入iPlex反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“extension”的反应程序。

12

IV.反应结束，将384孔板取出短暂离心备用。

⑤.产物纯化I.取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min。II.将反应结束的384孔板lOOOrpm离心Imin，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜。III.以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20分钟，3500rpm、5分钟离心后备用。 ⑥检测I.

Nanodispenser SpectroCHIP 芯片点样将检测样品从384孔反应板转

移到表面覆盖基质的MassARRAY SpectroCHIP芯片。II. MassARRAY Analyzer Compac 质谱检测将样品转移到SpectroCHIP芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析。III.TYPER软件分析实验结果，获得分型数据。

1.5.4 PCR的电泳检测

ACEI/D多态性釆用PCR电泳法检测，在妇幼保健院中心实验室完成，方法如下: ⑴试剂 ①.6xloa(iing

buufer (上海莱枫)

②.琼脂糖(生工生物) ③.DL2000 Marker(上海莱枫) ④.dNTP

(上海莱枫)

⑤.rs4340引物(生工生物合成) ⑥.Taq酶(上海莱枫)

⑦.DL2000 Marker(上海莱枫) (2)仪器与设备 ①.电子分析天平 ②.SMA1000浓度测试仪 ③.电热恒温水浴锅 ④.台式离心机(Thermol) ⑤.96孔板离心机(Eppendorf) ⑥.电泳仪

⑦.凝胶成像仪(上海天呈)

13

⑶质检

① SMA 1000进行DNA浓度测定:

I 打开SMA1000软件,选择测量的样品种类为DNA。 II 测量前用去离子水对测量平台以及取样臂进行清洗2-3次。 III 以2μLDNA样品溶解溶液为空白对照。 IV 吸取2μL待测DNA样品进行样品测量。 V 记录测定数据,并进行保存。 ② PCR扩增rs4340引物验证:

I在96孔板中加入18nL PCR Master Mix反应液。再加入2nL DNA样本,终体 积为20μL。

表 4 PCR Master Mix反应液配方 Table 4 PCR Master Mix reaction liquid formula

试剂名称 H2O PGR Buffer dNTP(2.5 mM each) rs4340引物-F

CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT re4340引物-R GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT Taq 酶 终体积

1X(μL) 13.2 2 1.6 0.4 0.4 0.4 18

II将96孔板lOOOrpm离心1分钟后放入PCR仪,运行反应程序。

III将PCR产物进行凝胶电泳,查看扩增条带。PCR产物为490bp,判断基因型为插入型,PCR产物为190bp,判读为缺失型,PCR产物为190bp和490bp时,判断为插入和缺失的杂合型结果。 1.5.5 DNA测序实验

ND +597 C/A多态性釆用DNA测序法检测，在深圳市妇幼保健院中心实验室完成，方法如下：（1）实验伩器：PCR反应扩增仪（加拿大BBI公司）；3730测序列分析仪（美国ABI公司）；SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂）；DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；DYY-8型稳压稳流电泳

14

仪（上海琪特分析仪器有限公司）；YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；凝胶成像系统（Gene Genius公司）； 移液器（范围 100-1 000μl，20-200μ1， 0.5-10μ1）（加拿大 BBI公司)。 主要试剂

TaqDNA聚合酶、1 OxPCR Buffer（without Mg2+： 100 mM Tris-HCl pH 8.8 at 25。C；500 mM KCl， 0.8%（v/v）Nonidet ）； MgCh （25mM）、dNTP （lOmM）、Marker、6XDNA Loading Dye （生工）；PCR产物纯化回收试剂盒（生工SKU41）； lOxTAE（400mM Tris-acetate and lOmM EDTA， pH8.0）。（3） PCR反应体系（25ul体系）：ddH2018.75ul； dNTP Mixture（各2.5Mm） 2ul； lOxPCRbuffer（Mg2+plus）2.5ul； PF（lOuM） 0.3ul； PR（10uM）0.3ul；模板DNA（10ng/ul）lul；rTaq（5U/ul） O.lSuLPCR反应条件：95℃ 5min； 94℃ 30sec； 60℃ 30sec 35 cycles； 72℃ 30 sec； 72℃ 10min； 10℃ forever。1%琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察。（4）测序：PCR产物纯化回收试剂盒（生工SK1141），测序。 2.3.4实验室的质量控制

主要通过采取以下手段对实验室的检测结果予以控制: （1）釆取有效措施避免交又污染;

（2）在对模板进行分配时，采取双人操作，确保研究对象和样品之间的相对应; （3）每个位点分析结束，分别抽出5%_10%的样品进行重复检测，保证一致率在99%以上；

（4）基因型的检测均采用盲法操作。 2.3.5 试剂的配置

红细胞裂解液配置（10×原液，配置基数1000ml）

1. 室温下，秤量氯化铵（分析纯）82.9g、碳酸氢钾（分析纯）5g、乙二胺四乙酸二纳（分析纯）0.372g加入1000ml清洗干净的烧杯中，加入双蒸水约800ml；

2. 将烧杯放到在磁力槐拌器上搜拌，至溶液完全透明澄清，使用加热功能调节溶液温度至25摄氏度，调定溶液pH值至7.4，PH调整完毕，将烧杯中的溶

15

液转移入1000ml的容量瓶中，清洗烧杯三次，最后加入双蒸水定容至1000ml，颠倒混句；

3. 将配置好的溶液，用漏斗进行过滤，过滤后盛放在一个耐高压的玻璃瓶中，放入高压锅，经过0.15 Mpa消毒20分钟，待冷却后，封口，贴上标签、配制日期及配置者，稀释成1×工作液即可使用，室温放置。 2.3.6 白细胞裂解液配置（配置基数1000ml）

1. 室温下，种量氯化纳（分析纯）23.38g、Tris-base（分析纯）1.211g、乙二胺四乙酸二纳（分析纯）1.862g、SDS（分析纯）5g加入1000ml清洗干净的烧杯中，加入双蒸水约800ml；

2. 将烧杯放到在磁力搅拌器上搅拌，至溶液完全透明澄清，使用加热功能调节溶液温度至25摄氏度，调定溶液pH值至8.0，将烧杯中的溶液转移入1000ml的容量瓶中，清洗烧杯三次，最后加入双蒸水定容至1000ml，颠倒混匀；

3.将配置好的溶液，用漏斗进行过滤，过滤后盛放在一个耐高压的玻璃瓶中，放入高压锅，经过0.15 Mpa消毒20分钟，待冷却后，封口，贴上标签、配制曰期及配置者，室温放置。

2.3.7 蛋白沉淀液配置（配置基数1000ml）

1. 室温下，秤量醋酸铵500g，加入1000ml清洗干净的烧杯中，加入双蒸水约800ml；

2. 将烧杯放到在磁力揽拌器上挽拌，至溶液完全透明澄清，使用加热功能调节溶液温度至25摄氏度，调定溶液pH值至7.4，将烧杯中的溶液转移入1000ml的容量瓶中，清洗烧杯三次，最后加入双蒸水定容至1000ml，颜倒混匀；

3. 将配置好的溶液，用漏斗进行过滤，过滤后盛放在一个耐高压的玻璃瓶中，放入高压锅，经过0.15Mpa消毒20分钟，待冷却后，封口，贴上标签、配制曰期及配置者，-20摄氏度保存备用。 2.3.8 DNA储存液（配置基数1000ml）

1.室温下，秤量Tris-base（分析纯）1.21Ig、乙二胺四乙酸二纳（分析纯）0.372g加入1000mI清洗干净的烧杯中，加入双蒸水约800ml；

16

2.将烧杯放到在磁力搅拌器上挽拌，至溶液完全透明澄清，使用加热功能调节溶液温度至25摄氏度，调定溶液pH值至8.0，将烧杯中的溶液转移入1000ml的容量瓶中，清洗烧杯三次，最后加入双蒸水定容至1000ml，颠倒混句；

3.将配置好的溶液，用漏斗进行过滤，过滤后盛放在一个耐高压的玻璃瓶中，放入高压锅，经过0.15Mpa消毒20分钟，待冷却后，封口，贴上标签、配制曰期及配置者，室温保存。

2.3.9 75 %酒精配置（配置基数1000ml）

向清洗干净的1000ml量筒中加入750ml的无水酒精，然后加蒸馆水至满刻度，即为75%的酒精，用瓶装好，贴上标签、配制日期及配置者，-20摄氏度保存。蛋白酶K的配置（配制标准：20mg/ml）。

将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20摄氏度。电汰缓冲液：（5×TBE，配置基数1000ml）。

54g Tris减和27.5g硼酸溶于900 ml双蒸水，再加入0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）20 mL，定容至1000 mL，室温下存。 2.3.10 基因多态性检测

采用聚合酶链反应一限制性内切酶片段长度多态性（Polymerase chain reaction- restrietion fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法对VEGF- 460 T/C和-1154 G/A基因SNP进行基因分型。 2.3.10.1 VEGF- 460T/CSNP基因分型

VEGF- 460T/c基因型检测的PCR反应体系为20μl，其中模板DNA 100ng，10×PCR缓冲液（含MgCI2 15mmol/L） 1.6μl，染料2.0μl ，Taq DNA聚合酶1.0 U，10mmol/L dNTPs 0.4μl，上游引物(5’-TGTGCGTGTGGGGTTGAGCG-3’)和下游引物(5’-TACGTGCGGACAGGGCCTGA-3’)各250nM；PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃继续延伸7min。PCR扩增产物为175bp，PCR产物经限制性内切酶Bsh1236I于37℃酶切16h后，进行4%琼脂糖凝胶电泳。C/C基因型存在Bsh1236I的识别位点产生155bp和20bp两条DNA片段，而T/T基因型缺乏Bsh12361的

17

识别位点保持原有PCR后的175bp的片段，T/C基因型则显示为175bp、155bp和20bp 3条片段。

2.3.10.2 VEGF-1154G/A SNP基因分型

VEGF- 1154G/A基因型检测的PCR反应体系为20μl，其中模板DNA100ng，10×PCR缓冲液（含MgCl2 15mmol/L)1.6μl，染料2.0μl，Taq DNA聚合酶1.0U，10mmol/L dNTPs 0.4μl，上游引物(5’-TCCTGCTCCCTCCTCGCCAATG-3’)和下游引物(5’-GGCGGGGACAGGCGAGCATC-3’)各200nM；PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，61℃退火45s，72oC延伸45s，35个循环后，72℃继续延伸7min。扩增产物为206bp，PCR产物经限制性内切酶Mnll于37℃酶切16h后，进行4%琼脂糖凝胶电泳。A等位基因有一个Mnll内切位点，G等位基因有两个Mnll内切位点，因此A/A基因型产物为184bp和22bp两条片段，G/G基因型为150bp、34bp和22bp3条片段，G/A基因型为184bp、150bp、34bp和22bp4条片段。 2.3.10.3 实验质量控制

为避免细菌的污染及防止实验交叉污染，EP管、Tips等均为一次性，并于应用前严格消毒。并严格遵循实验操作规则。每一批PCR都以去离子水代替DNA模板进行扩增作为阴性对照。对每个多态性位点随机挑取10%的DNA标本进行重复分型分析，以证实分型方法的可靠性。 2.3.10.4 血管内皮功能测定

采用Celmajar首创的应用高分辨率超声测定肱动脉反应性充血前后血管内径的变化来评价血管内皮功能，采用仪器为Phlipis Agilent SONOS 5500彩色多普勒超声机，探头频率7.5MHz，探查深度4-5cm，患者测试前静卧10min，上肢外展15度，连接3导联心电图，将超声探头置于右臂肘上2-5cm，显示肱动脉长轴切面，获得清晰图像，在心电图显示R波时测肱动脉前后内膜之间的距离作为血管基础内径D1，并于探头测定位置做标记。后行反应性充血实验，将血压带在肘关节以下充气加压至300mmHg，持续5min后放气，60-90s内在同一标记位置测量肱动脉内径D2，所有数值均连续测量3个心动周期，然后取平均值。反应性充血后内径变化即血流介导的血管内皮舒张功能FMD=（D2-D1）

18

/D1x100%。血管内皮功能检测前12小时停止抽烟、喝咖啡，停用所有扩血管药、抗氧化剂，同时避开女性月经周期。 1.6 血标本的采集及DNA的提取 1.6.1 样品的收集管理

向每位研究对象收集血液（抗凝血）有形成分约4ml。从白细胞中提取DNA，完成相关基因型的鉴定。为保障课题样本釆集器械的安全质量，要求抽血时使用统一购置塑胶抗凝真空管（2ml，EDTAK3，标准紫色橡皮密封盖）；采血管上标明患者编号、姓名和病历号；采样前仔细核对研究对象编号和负压釆血真空管编号一致，确认空腹情况（确认是否饮食、饮食品种、数量和时间）。 1.6.2 DNA提取步骤（适用于10ml全血）

1. 登记血样及白细胞保留情况有问题及时反馈。

2. 估计血样总量为4ml加入全血血样3倍体积1×的红细胞裂解液至50ml离心管贴好标签。

3. 用一次性吸管将血样全部吸取至50ml离心管中并用少量红细胞裂解液清洗取血管2次清洗液移入50ml离心管注意样本标签和50ml离心管标签的一一对应翻转混合多次直至溶液由混油变澄清。

4. 3500g离心15分钟。（如果离心不彻底可以酌情增加转速或时间）。 5. 小心取出离心管将上清液（为破坏后的RBC碎片）缓慢倒入废液叙将剩余沉淀充分震荡。

6. 用微量移液器向样品中加入浓度为20ug/ml蛋白酶K32ul白细胞裂解液5ml充分震荡150秒混句至完全液化。

7. 充分混合后置37°C水洛中孵化30~60分钟。

8. 从水浴锅中取出后将样本放到-2℃冰箱中冷却5min至室温。

9. 拿出后加入蛋白沉淀液（-2℃保存）2inl高速震荡20秒至褐色沉淀出现。 10. 3500rpm离心10min。

11. 离心后将上清液移至装有5ml异丙醇的管中注意标签的一一对应充分轻柔摇混至白色絮状物出现。

12. 3500rpm离心10min。

19

13. 离心后倾出异丙醇及其他溶液将离心管倒置在滤纸上大约10-15分钟至挥发干净。

14. 向其中加入75%酒精（-2℃保存）清洗DNA及脱盐3500rpm离心10min。 15. 离心后倾出酒精倒置于新滤纸上干燥15分钟。 16. 加入DNA储存液0.8ml放置室温过夜。

17. 第二天测定DNA纯度与浓度并做记录分装DNA保存于4℃或更低温度。 1.6.3 引物的合成：

VEGF?1154G/A 多态特异性引物：

上游引物：5'-TCCTGCTCCCTCCTCGCCAATG-3' 下游引物：5'-GGCGGGGACAGGCGAGCATC-3' 236bp，GC%：70.76% VEGF+405G/C 多态特异性引物

上游引物：5'-ATTTATTTTTGCTTGCCATT-3' 下游引物：5'-GTCTGTCTGTCTGTCCGTCA-3' 234bp，GC%：61.97%

1.6.4 扩增 VEGF?1154G/A 和+405G/C 基因的反应体系：

灭菌的去离子水 9.95μl 10*PCR 缓冲液 1.5μl PCR 染料 1.5μl 上游引物（10pmol/ul） 0.25μl 下游引物（10pmol/ul） 0.25μl 10 mmol/L 脱氧核糖核苷酸（dNTPs） 0.3μl Taq 酶（5u/ul） 0.25μl 模板 DNA 1μl

上述步骤加液完成后轻摇混匀，以离心机短暂离心，使反应液集中于管底。 1.6.5 反应条件：

首先给予2min的94℃预变性处理，然后以94℃进行变性15s，55℃退火15s，在72℃下延伸25s，等完成35个完整循环后，再于72℃进行延伸3min。PCR

20

完成后，可在琼脂糖凝胶上以100bpDNAladder水平进行电泳，从而确定扩增片段长度。

1.6.6 制备琼脂糖凝胶

分别称取琼脂糖粉末 2 g、4 g，将粉末溶解于 100 ml 1×TAE 中，加入并混匀于椎形瓶中，在微波炉内加热至熔融状态，取出后加入 0.5μg/ml的溴化乙锭 10μl，混匀后将熔融的液体倒入胶板上使之冷却，以备后用。 1.6.7 对 PCR 产物的分析如下： 1 将胶板放于水平电泳槽之内。

2 将稀释后 1×TAE 液，置入电泳槽，以稍微高出于胶面为最宜。 3 吸取 3μl 扩增产物（其余的则置于 4℃保存备用）上样于琼脂糖凝胶 上电泳，必要时可以同时上样于阴性对照（即不加模板 DNA，而是用灭 菌的去离子水替代的 PCR 产物）和阳性对照（指经多次实验获得稳定 PCR 产物），同时选择 100bp DNAladder 给予水平电泳处理。 4 通电后稳压 100 V，将电泳时间设定为 10 分钟。

5 电泳结束的时候取出凝胶，在紫外灯下和 Marker 条带比较，判定扩 增片段的长度。 6 基因型分析

VEGF+405G/C的PCR产物的电泳条带长度是304bp。用BsmFI对PCR产物进行酶切，进行一下操作：在1个1.5ml灭菌Eppendorf管中按顺序加入以下所列试剂成分（反应体系为10μl）：10×Buffer0.5μl，BSA0.5μl，BsmFI0.5μl，PCR产物6μl，灭菌的石蜡油8μl。短暂离心上述混合液后置于65℃温箱中给予过夜消化。上述酶切反应结束之后，吸取全部已经消化的产物，上样于3%的琼脂糖凝胶，同时上样于阴性对照（同前）、阳性对照，同时选择合适分子量DNAMarker进行标记。通电，稳压100V，电泳时间为30-50分钟。待电泳结束后，取出凝胶，在凝胶成像仪下观察酶切结果。VEGF基因3′非编码区+405核苷酸位点处G为C所替代，从而产生一个BsmFI限制性酶切位点。C/C基因型经限制性内切酶消化后的片段为304bp，G/G基因型则为193bp和111bp，G/C杂合基因型为304bp、193bp和111bp三个碱基片段。

21

VEGF-1154G/A采用聚合酶链反应一限制性内切酶片段长度多态性(PCR—RFLP)方法进行基因分型分析。引物由赛百盛生物公司合成。基因型检测的PCR反应体系为20μl：模板DNA100ng，10×PCR缓冲液(含MgC1215mmol/L)1.6μl，染料2．0μl，TaqDNA聚合酶1.0U，10mmol/LdNTPs0.4μl，上下游引物各250nmol/L；PCR反应参数：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃继续延伸7min。VEG-1154G/A扩增产物为206bp，PCR产物经限制性内切酶MnlI于37℃酶切16h后，进行3％琼脂糖凝胶电泳。A等位基因有一个MnlI内切位点，G等位基因有两个MnlI内切位点，因此A/A基因型产物为184bp和22bp2条片段，G/G基因型为150、34和22bp3条片段，G/A基因型为184、150、34bp和22bp4条片段。 1.7 统计学分析方法

本研究所有资料均经过Microsoft Excel软件建立数据库，应用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析，检验水准a=0.05，即P<0.05说明具有统计学差异。所有的统计检验均为双侧概率检验。 1.5.1 —般资料的分析

采用独立样本t检验比较各组间胎龄、出生体重差异；采用卡方检验比较性别的组间差异。

1.5.2.Hardy- Weinberg平衡检验

本研究釆用χ2检验分析组间各SNP位点基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡，以判定样本的群体代表性。Hardy-Weinberg平衡实质是一种理想状态，我们很通过检测每一个体的基因型來获得一个很大的群体的等位基因频率，但可以通过从群体中随机抽取一定数量个体作为样本来估计群体中的等位基因频率。因此就必须要对所抽取的样本进行检验以确定所取样本的代表性。 1.5.3 SNP位点分析

对单个SNP位点，基因型与等位基因频率在病例组与对照组的统计学差异分析采用χ2检验。多组中的两两比较采用Bonferroni法校正检验水准。通过Logistic回归模式校正其它风险因素，并分析相关SNP各基因型对ROP发病风险程度的影响，计算比值比（Odds ratio，OR）和95%可信区间（confidence interval，CI）。

22

应用SPSS 19.0软件包进行统计学处理。釆用拟合优度检验进行Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。以χ2验和t检验比较人口学特征、冠心病危险因素和各基因型及等位基因在病例与对照之间分布的差异。比值比（oddsratios，OR）及其95%可信区限（confidence intervals，CI）表示相对风险度。通过非条件Logistic回归分析校正传统的冠心病危险因素（cardiovascular risk factors，CRF）后估算基因型与表型的相关性。未校正的OR值（crude OR）和校正后的OR值（adjusted OR）分别经单因素分析和多因素Logistic回归分析计算得出。应用Power and Sample Size Program进行检验效能（power）的估算。根据目前的样本含量，假设对照组中最小等位基因频率为17%而I型错误的概率为0.05，当OR=1.4时该研究具有90%的检验效能。应用Thesiasprogram进行连锁不平衡（linkage disequilibrium）的估计和单体型（haplotype）的构建，并进行单体型频率的计算和协变量校正后的单体型作用的分析。P<0.05表示差异无统计学意义。

23

第二章 实验结果

1 两组研究对象的一般特征

急性心肌梗死患者组及健康对照组的人口分布特征：心肌梗死组：Ml组患者630例，其中男469例、女161例，平均年龄（63.02±9.78）岁。均选自2005年7月至2012年8月入住青岛大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，符合世界卫生组织关于缺血性心脏病的命名及诊断标准，其中急性心肌梗死391例，陈旧性心肌梗死239例。对照组：对照组600例，其中男429例，女171例，平均年龄（62.03±10.05）岁。选自同期因疑似冠心病入住青岛大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，均无典型胸痛症状，经心电图、运动平板、心肌酵谱等排除冠心病诊断，所有入选者经冠脉造影证实其主要血管完全正常。两组患者的年龄构成比均无统计学意义（P＜0.05）。

2 VEGF-460 T/C和- 1154G/A单核苷酸多态性分布与急性心肌梗死发病风险相关性分析

所有研究对象的DNA标本均经PCR- RFLP方法成功检测了VEGF- 460 T/C和-1154G/A两位点的基因型，并且所有重复分型结果均与原始结果相符。 2.1 VEGF-460T/C单核营酸多态性分布与急性心肌梗死发病风险相关性分析

健康对照组中的VEGF-460T/C单核昔酸多态性的基因型分布均符合Hardy- Weinberg平衡（P>0.05），可以认为其具有良好群体代表性。急性心肌梗死患者组VEGF- 460T/ CSNPT和C等位基因频率分别为72.5%、27.5%；健康对照组中等位基因频率分别为79.9%、20.1%；急性心肌梗死组中C等位基因频率明显高于健康对照组，两组比较有统计学意义（χ2=6.109，P=0.013）。急性心肌梗死患者组和健康对照组的T/T、T/C和C/C基因型频率分别为52.5%、40.0%、7.5%；63.2%、33.3%和3.4%。由于C/C基因型频率较低，遂将T/C与C/C基因型合并。合并后急性心肌梗死患者组的T/T、T/C+C/C基因型频率分别为52.2%、47.5%；健康对照组基因型频率分别为63.2%、36.7%。两组间基因型分布有统计学意义（χ2=4.445，P=0.029）。与T/T基因型比较，携带C等位基因的基因型（T/C+C/C）可显著增加急性心肌梗死的发病风险，OR=1.692，95% CI=1.123-2.549。

24

根据个体吸烟状况分层分析发现，与T/T基因型相比，携带C等位基因的基因型（T/C+C/C），明显增加不吸烟个体急性心肌梗死的发病风险，经性别、年龄校正后的OR=2.457，95%Cl=1.357一4.45。根据急性心肌梗死病理类型进行分层分析发现，与T/T基因型相比，携带C等位基因的基因型（T/C+C/C），明显增加肺鳞状细胞癌及小细胞癌的发病风险，经性别、年龄及吸烟状况校正后的OR分别是1.867和2.092，95%CI分别是1.058-3.295和1.036-4.224。 2.2 VEGF-1154G/A单核普酸多态性分布与急性心肌梗死发病风险相关性分析

健康对照组中的VEGF-1154G/A单核营酸多态性的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），可以认为其具有良好群体代表性。急性心肌梗死患者组VEGF-1154G/A SNP G和A等位基因频率分别为77.8%、22.2%；在健康对照组中分别为73.0%、27.0%；急性心肌梗死患者组的A/A、G/A和G/G基因型频率分别为4.0%、36.5%、59.5%；健康对照组的A/A、G/A和G/G基因型频率分别为5.4%、43.1%和51.5%。由于A/A基因型频率较低，遂将G/A与A/A基因型合并，合并后急性心肌梗死患者组的G/G、G/A+A/A基因型频率分别为59.5%、40.5%；健康对照组基因型频率分别为51.5%、48.5%。VEGF- 1154G/A的等位基因和基因型频率分布在急性心肌梗死患者组和健康对照组之间无统计学意义（P>0.05）。与G/G基因型相比，携带A等位基因的基因型（G/A+A/A）与急性心肌梗死的发病风险无明显相关性，经性别!年龄及吸烟状况校正后的OR=0.738，95% Cl=0.494-1.103。

根据个体吸烟状况分层分析发现，与G/G基因型相比，携带A等位基因的基因型（G/A十A/A），可降低不吸烟个体急性心肌梗死的发病风险，经性别、年龄校正后的OR=0.412，95% Cl=0.228-0.746。根据急性心肌梗死病理类型进行分层分析，未发现VEGF-1154G/A多态性与急性心肌梗死发病风险的相关性。应用2LD软件对VEGF- 1154G/A与VEGF- 460T/C多态性位点进行联合分析显示：两多态性位点间不存在连锁不平衡（D，=0.370936）。 3 VEGF基因SNP位点等位基因频率的组间比较

对两组之间VEGF基因SNP位点各等位基因频率进行卡方检验，发现VEGF基因+405、+936等位基因频率在两组间有显著性差异(分别为P=0.000，P=0.002，

25

<0.05)；而-460、-2578等位基因频率在两组间无显著性差异(分别为P=0.990，P=0.429，<0.05)，见表。

表 5 VEGF基因各SNP位点等位基因—率的2组间比较

Table 5 Comparisons of VEGF SNP allele frequencies among the two groups

SNP位点 +405 -460 +936 -2578

等位基因 G C T C C T A C

研究组 72(60.8) 76(39.2) 116(78.4) 32(21.6) 121(81.8) 27(18.2) 37(25.0) 111(75.0)

对照组 100(58.8) 70(41.2) 134(78.8) 36(21.2) 147(86.5) 23(13.5) 40(23.5) 130(76.5)

χ2 18.360 0.021 12.875 0.429

P值 0.000 0.990 0.002 0.980

为明确VEGF基因+405、+936等位基因频率在两组之间的差异是否有统计学意义,再采用卡方检验进行组间两两比较。此时通过Bonfemmi校正法进行多重检验校正,校正后的检验水准为a=0.017(a/3),即P< 0.017时具有统计学差异。两两比较发现,+405等位基因频率在重症组与对照组比较、重症组与轻症组比较,有显著性差异(分别为P=0.000,P=0.015, <0.017) , C等位基因在重症ROP的比例明显高于对照组与轻症组;而轻症组与对照组无显著性差异(P=0.069, >0.017)。重症组与对照组间,相对于G等位基因,携带C等位基因发生重症ROP的风险度为2.711(OR:2.711,95%CI: 1.709-4.302);重症组与轻症组间,相对于G等位基因,携带C等位基因发生重症ROP风险度为1.798(OR: 1.798,95%CI: 1.121-2.885)。+936等位基因频率在重症组与对照组比较有显著性差异(P=0.001,<0.017) , T等位基因在重症ROP的比例明显高于对照组。相对于C等位基因,携带T等位基因发生重症ROP的风险度为2.684(OR:2.684,95%CI:1.521-4.739);在重症组与轻症组间、轻症组与对照组间均无显著性差异(分别为P=0.6l3,P=e.249, >0.017)。 2.3 PEDF基因SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较 2.3.1

PEDF基因SNP位点的HWE检验

26

对PEDF基因两个SNP位点在对照组、轻症组和重症组间的基因型频率分布进行HWE检验,结果显示中两个位点在3组间的基因型分布频率符合HWE (P>0.05),说明人群具有代表性,见表2-6。 2.3.2

PEDF基因SNP位点基因型的组间比较

对两组之间PEDF基因两个位点基因型频率进行卡方检验,发现PEDF基因-5376基因型频率在两组间有显著性差异(P=0.003,<0.05),而+311基因型频率在两组之间分布无显著差异(P=0.182,>0.05)。见表。

表 6 PEDF基因SNP位点基因型频率2组间比较 Table 6 Genetype frequency of PEDF SNP among the three groups

SNP位点 -5376 +311

基因型 CC CT TT HWE-P TT CT CC HWE-P

研究组 13(17.6) 35(47.3) 26(25.6) 0.83 8(10.8) 23(31.1) 43(58.1) 0.09

对照組 14(16.5) 48(56.5) 23(27.0) 0.18 12(14.1) 31(36.5) 42(49.4) 0.12

χ2值 16.408 6.233

P值 0.003 0.182

为明确两组之间的差异是否有统计学意义，再采用卡方检验对PEDF基因-5376基因型频率进行组间两两比较，此时通过Bonfeironi校正法进行多重检验校正，校正后的检验水准为α=0.017(a/3)，即P<0.017时具有统计学差异。发现重症组与对照组之间有显著差异(χ2=l5.222，P=0.000，<0.017)；而轻症组与对照组间(χ2=1.503，P=0.472，>0.017)、重症组与轻症组(χ2=7.455，P=0.24，>0.017)基因型频率分布无显著性差异。

3 PEDF基因各SNP位点等位基因频率的组间比较

对两组之间PEDF等位基因频率进行卡方检验，发现PEDF基因-5376等位基因频率在两组间有显著性差异(P=0.003，<0.05)，而+311等位基因频率组间无显著差异(P=0.383，>0.05)，见表。

27

表 7 PEDF基因SNP位点等位基因频率的2组间比较

Table 7 Comparisons of PEDF SNP allele frequencies among the two groups 10.5 -5376 +311

等位基因 C T T C

研究组 61(41.2) 87(58.8) 39(26.4) 109(73.6)

对照组 76(44.7) 94(55.2) 55(32.4) 115(67.6)

χ2 11.503 1.919

P值 0.003 0.383

为明确PEDF-5376等位基因频率在两组之间的差异是否有统计学意义，再采用卡方检验进行组间两两比较。此时通过Bonferroni校正法进行多重检验校正，校正后的检验水准为a=0.017(a/3)，即P< 0.017时具有统计学差异。两两比较发现，PEDF基因-5376等位基因频率在重症组与对照组比较、重症组与轻症组比较有显著性差异(分别为P=0.001， P=0.009， <0.017)，T等位基因在重症ROP的比例明显高于对照组与轻症组;而轻症组与对照组无显著性差异(P=0.531，>0.017)。重症组与对照组间，相对于C等位基因，携带T等位基因发生重症ROP的风险度为2.213(OR:2.213，95%CI: 1.371-3.572);重症组与轻症组间，相对于C等位基因，携带T等位基因发生重症ROP的风险度为1.919(OR:1.919，95% CI:1.170-2.883.1485)。见表8。

表 8 PEDF基因-5376等位基因频率组间两两比较

Table 8 Comparisons of PEDF -5376 SNP allele frequencies between the two

groups

χ2 P值 OR (95% CI)

PEDF -5376 C/T研究组vs对照组 0.393 0.531 1.153 (0.739-1.800)

eNOS基因SNP位点基因型及等位频率的组间比较2.3.1 eNOS基因SNP位点的HWE检验对eNOS基因两个SNP位点在对照组、轻症组和重症组间的基因型频率分布进行HWE检验，结果显示两个位点基因型分布频率符合HWE (P>0.05)，说明人群具有代表性，见表9。

28

eNOS基因SNP位点基因型的组间比较对两组之间eNOS基因两个SNP位点基因型分布频率进行卡方检验，发现eNOS基因-786、+894基因型频率在两组间无显著性差异(分别为P=0.590，P=0.834， >0.05)，见表9。

表 9 eNOS基因SNP位点基因型频率2组间比较

Table 9 Comparisons of eNOS SNP genotype frequencies among the two groups

SNP位点 -786 +894

基因型 CC CT TT HWE-P TT GT GG HWE-P

研究组n(%) 3(4.1) 17(23.0) 54(72.9) 0.28 4(5.4) 17(23.0) 53(71.6) 0.11

对照组n(%) 4(4.7) 23(27.1) 58(68.2) 0.39 7(8.2) 24(28.2) 54(63.5) 0.09

χ2 2.812 1.458

P值 0.590 0.834

4 eNOS基因SNP位点等位基因频率的组间比较

对两组之间eNOS基因两个位点等位基因频率进行卡方检验，未发现显著差异(分别为P=0.231，P=0.410，>0.05)，见表10。

表 10 eNOS基因SNP位点等位基因频率2组间比较

Table 10 Comparisons of eNOS SNP allele frequencies among the two groups

SNP位点 等位基因 研究组 -786 +894

C T T G

23(15.5)

对照组 31(18.2)

χ2 2.929

P值 0231 0.410

125(84.5) 139(81.8) 25(16.9)

38(22.4)

1.782

124(83.1) 132(77.6)

IGF-1R基因SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较 4.1 IGF-1R基因SNP位点的HWE检验

对IGF-1R基因+3174基因型频率在对照组、轻症组和重症组3组间的分布进行HWE检验，结果显示基因型分布频率符合HWE (P>0.05)，说明人群具有代表性。

29

4.2 IGF-1R基因SNP位点基因型的组间比较

对三组之间IGF-1R基因+3174基因型分布频率进行卡方检验,未发现显著性差异(P=0.25, >0.05)。

表 11 IGF-1R基因+3174等位基因频率2组间比较

Table 11 Comparisons of IGF-IR +3174 allele frequencies among the two groups SNP位点 +3174

等位基因 A G

研究组n(%) 对照组n(%) χ2 38(25.7) 110(74.3)

50(29.4) 120(70.6)

0.829

P值 0.661

5 Ang-2基因SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较 5.1 Ang-2基因SNP位点的HWE检验

对Ang-2基因+35基因型频率在对照组、轻症组和重症组3组间的分布进行HWE检验,结果显示基因型分布频率符合HWE (P>0.05),说明人群具有代表性。 5.2 Ang-2基因SNP位点基因型频率的组间比较

对三组之间Ang-2基因+35基因型频率进行卡方检验,未发现显著性差异(P=0.951, >0.05)。

表 12 Ang-2基因+35基闪??丨频率2組间比较

Table 12 Comparisons of of Ang-2 +35 genetype frequencies among the three groups

SNP位点 基因型 +35

GG GC CC HWE-P

研究组 4(4.1) 22(31.1) 48(64.8) 0.49

对照组 6(8.5) 20(28.2) 45(63.4) 0.10

χ2 0.700

P值 0.951

5.3 ACE基因SNP的HWE检验

对ACE基因I/D基因型频率在对照组、轻症组和重症组三组间的分布进行HWE检验，结果显示基因型分布频率符合HWE (P>0.05)，说明人群具有代表性，见表2-15。

5.4 ACE基因I/D基因型频率的组间比较

ACE基因16内含子目的片断经PCR扩增后可形成两种不同长度的DNA片断:即490bp的插入片断(I)和190bp的缺失片断(D)? PCR产物经凝胶电泳溴化乙

30

锭染色后，在紫外灯下可观察到三种条带，一为单一490bP条带，此为纯合子插入型(II基因型);二为单一 190bp条带，此为纯合子缺失型(DD基因型);三为490bp和190Pb两种条带，此为杂合子插入/缺失型(DI基因型)。见图2-2。对三组之间ACE基因I/D基因型分布频率进行卡方检验，未发现显著性差异(P=0.777， >0.05)。

6 相关SNP与ROP的logistic分析

6.1VEGF基因+405、+936多态性及PEDF基因-5376多态性与ROP的关联性分析

以上卡方检验中发现VEGF基因+405、+936基因型频率和PEDF基因-5376基因型频率在间有显著性差异，采用二分类logistic分析校正胎龄和出生体重后检测这3个位点多态性与重度ROP的相关性。由于重症组与对照组间胎龄、出生体重有统计学差异，校正胎龄、出生体重后结果显示:3个SNP与重症显著相关(P值分别为P=0.010；P=0.023；P-0.045，<0.05)。其中，VEGF基因+405GG基因型与CC基因型相比，患重症ROP的风险度为0.140(OR:0.140，95%CI:0.039-0.505)，有统计学意义(P=0.003；<0.05)；VEGF基因+936CT基因型与CC基因型相比，患重症ROP的风险度为3.281(OR:3.281，95%CI:1.272-8.462)，有统计学意义(P=0.014；<0.05)；PEDF基因-5376CT基因型与TT基因型相比，患重症ROP的风险度为0.315(OR:0.315，95%CI；0.121-0.817)，有统计学意义(P=0.018；<0.05)。

以上卡方检验中发现VEGF基因+405基因型频率在重症组与轻症组间有显著性差异，釆用二分类logistic分析检测位点多态性与重症ROP的相关性。校正胎龄和出生体重后结果显示，在重症组与轻症组间，该位点多态性与重症ROP显著关联(P=0.000，<0.05)。其中，VEGF基因+405GG、GC基因型与CC基因型相比，患重症ROP的风险度分别为0.088(OR:0.088，95%CI:0.028-0.279)和0.276(OR；0.276，95%CI:0.110-0.693)，有统计学意义(P值分别为P=0.000；P=0.006；<0.05)。

6.2 VEGF +405M60单倍型组合与ROP的关联性分析

VEGF基因+405G/C、-46001多态性位点间存在4种单倍型:^46007+4050:-460C/+405C；-460T/+405G；-460T/+405C，本次研究中共发现

31

6种单倍型组合，①.-TTAMOSCC；②.-46010/+40500:③.-460TT/+405CG；④.-460CC/+40500:⑤.-4601CC/+40500:⑥.-460TT+4050CG

首先对单倍型组合在三组间的分布进行卡方检验，发现各单倍型组合在三组间的分布有显著性差异(P=0.000，<0.05)，两两比较发现，单倍型组合在重症组与对照组、重症组与轻症组间的分布频率有显著差异(两组均为P=0.000，<0.017)，而在轻症组与对照组间分布无显著性差异(P=0.981，>0.017)；进一步采用二分类logistic分析校正胎龄和出生体重后，对VEGF -460/+405各单倍型组合在重症组与对照组间、重症组与轻症间的分布频率进行比较。具体方法如下:将②、③、④、⑤、⑥单倍型组合合并为“非①”，则可得到①与非①单倍型组合的比较结果。同理，可以得到②与非②、③与非③...⑥与非⑥单倍型组合在两组间的比较结果。结果发现，重症组与对照组、重症组与轻症组间，VEGF-460TT/+405CC单倍型组合(-460T/+405C纯合子)显著增加了患重症ROP的风险(OR：5.319，95%CI：2.034-13.904， P=0.001)和3.878(OR：3.878，95%CI： 1.693-8.885， P=0.001);在重症组与对照组、重症组与轻症组间，-460TT/+405GG单倍型组合(-460T/+405G纯合子)显著降低了患重症ROP的风险(OR：0.121， 95%CI：0.022-0.660， P=0.015)和0.289(OR：0.289，95%CI：0.123-0.680，P=0.019)。

通过对比和研究以下数据：1．VEGF基因SNPs与AMI发病风险的关联分析，结果表明VEGF基因SNPs与急性心肌梗死正相关（r=0.312）；2.血浆VEGF浓度与VEGF基因SNPs的关系成正相关(r=0.573)；3.VEGF血浆水平与MACCE发生率相关性分析表明，VEGF血浆水平、多态性与MACCE正相关（r=0.618）；4．LV- remodling与VEGF浓度及多态性正相关(r=0.187)；5.心肌梗死面积分别与VEGF血清浓度及VEGF的SNP的相关性结果表明，心肌梗死面积与VEGF血清浓度成正相关（r=0.736），心肌梗死面积与VEGF的SNP成正相关（r=0.582）。血管内皮生长因子的检测数据与急性心肌梗死其他检测的数据相关性分析表明，各数据间均呈正相关，对急性心肌梗死的血管内皮生长因子的检测对急性心肌梗死的研究诊断具有重要意义。

32

第三章 讨论

急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）具有发病急、并发症多、病死率高等特点。其病理改变是冠状动脉粥样硬化，致管腔变窄或冠脉痉挛，血栓梗塞，导致心肌缺血、缺氧、坏死。因心肌梗死的部位有前壁、下壁、右壁或多个部位梗塞，故出现病情轻重不同，轻者仅有胸闷隐痛，重者出现剧痛和并发症。急性心肌梗死属中医“真心痛’、“厥心痛”等范畴，为本虚标实证。一是正虚（如气虚、阳虚和阴虚，以心气虚或肾气虚为主，一是邪实（如血癖、痰湿、寒凝、气滞，血癖是重要病理特点）。多以心阳虚为本，痰浊阻络为标。 1 VEGF基因SNP与ROP发病的关联分析

视网膜新生血管的生成涉及多种血管调节因子，VEGF是目前发现的功能最强的血管源性及血管通透性因子，在视网膜病变中起着中心调控的作用，其它血管因子的作用都是通过VEGF的表达及生成作用而实现的。VEGF广泛分布于人和动物体内的脑、肾、肝、脾、肺、眼等多种器官中，正常眼视网膜色素上皮、血管内皮和周细胞均可产生较低水平的VEGF。VEGF属糖蛋白家族，分子量约为40kDa，包括胎盘生长因子(PIGF)与VEGF-A、B、C、D、E、F七种成员。VEGF对血管内皮细胞有高度的选择性，作为活性的内皮细胞丝裂原诱导血管生成，为血管内皮的强促分裂素，它可以在多种生物环境中影响细胞的增生、迁移、酶解、存活，从而刺激血管内皮的增生、迁移和毛细血管腔形成，最后生成新生血管。新生大鼠的视网膜在高氧环境培养，然后回到室内空气中，内核层中Miiller细胞(视网膜内最主要的神经胶质细胞)局部VEGF的mRNA表达增高。通过注射VEGF受体蛋白质溶液阻断VEGF活性，血管生长被抑制。证实了VEGF表达和新生血管形成之间有关联。VEGF的基因表达受到氧分压的调控，这一特点有助于组织根据需氧量调节血管数量。在正常氧分压条件下，视网膜细胞产生一定水平的VEGF供已有的血管生长。而在高氧情况下，VEGF表达下降，这在ROP发病的第一阶段中起了重要作用。相反，相对缺氧有上调VEGF基因表达的作用，增强转录水平的和VEGFmRNA的稳定性。短时间缺氧3h可使VEGF表达量增加3、4倍，而持续性缺氧15h可使VEGF表达量增加8、10倍。Young TL等对一例光凝手术后的3期ROP死亡患儿进行了尸检，在一只激光光凝手术

33

后的眼中，视网膜的手术区域内没有发现VEGF mRNA，激光疱痕区之间存在增高的VEGF mRNA，而在另一只尚未达到手术标准的眼中，发现VEGFmRNA在视网膜的无血管区域内明显升高。 2 PEDF基因SNP与ROP发病的关联分析

PEDF是一种分子量约为50KD的分泌性糖蛋白，含418个氨基酸[45]。属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，Serpin)超基因家族的产物，但不具备抗蛋白酶活性。主要来源于视网膜色素上皮、角膜和虹膜上皮以及大脑、肝、肾脏、胰腺以及肿瘤组织等身体其他组织细胞，生物功能主要为保护神经元、抑制血管生成和控制肿瘤生长和转移作用。PEDF在视网膜基质中以较高的浓度存在，有营养神经的作用，是视网膜正常发育所必需的营养因子;视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium， RPE)分泌的PEDF进入感光细胞的细胞间质，不仅能够影响视网膜的分化、发育和成熟，还对视网膜的机械损伤、光损伤和缺血性损伤有神经元保护作用。作为一种“天然新生血管抑制物”，近年来其作用机制和治疗潜力得到了广泛研究。正常玻璃体及房水中可以检测出高浓度的PEDF，房水中的PEDF含量的下降预示着糖尿病视网膜病变的进展，而VEGF的含量则没有这种预示价值。Gao等发现在氧诱导的视网膜新生血管大鼠模型中，视网膜组织VEGF含量较正常对照组升高了5倍，PEDF含量下降了2倍，而VEGF:PEDF的比值升高了10倍。VEGF：PEDF比值的改变程度与视网膜新生血管增生的程度呈正相关，这一发现充分证明PEDF作为血管抑制剂参与了视网膜新生血管形成的调节。Ogata等也在研究中发现PEDF与发挥血管刺激作用的VEGF协同，在生理性和病理性血管形成过程中起着关键作用。IH常情况下，两者的表达水平处于动态平衡，在病理损伤环境下，二者的平衡被破坏，可致血管异常生成[5?]。PEDF与血管内皮生长因子(VEGF)同样都受氧浓度的调节，但二者的调控方向相反。在低氧条件下，视网膜VEGF的表达水平会增高，PEDF表达水平下降，视网膜新生血管增加;反之，氧浓度过高时将导致视网膜低血管化。Dawson等报道，低氧使PEDF水平下降，促进血管生成;高氧使PEDF水平升高，抑制血管生长。Duh等研究也显示，PEDF浓度的升高可抑制VEGF诱导的视网膜内皮细胞生长和游走，从而抑制视网膜的新生血管形成。PEDF编码基因为位于染色体17pl3.1的单个基因，长约16kb，含有8个外显子和7个内含子。

34

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/1ymg.html