真菌药用_固体发酵_上游工程建设基本研究方法

真菌药用_固体发酵_上游工程建设基本研究方法

中国食用菌２００９，２８（４）：８—９，１４

ＥＤＩＢＬＥＦＵＮＧＩＯＦＣＨＩＮＡ

ＣＮ５３－１０５４／Ｑ

ＩＳＳＮ１００３—８３１０

真菌药用“固体发酵＂上游工程建设基本研究方法

庄

毅１，２

（１．南京中医药大学，南京２１００２９；２．江西中医学院菌物药研究中心，江苏南昌３３００２９）

摘要：真茵药用“固体发酵”是中药传统范畴内仅有的，也是历史上诞生最早的一类生物制药技术，并已发展走向“固体发酵系列工程”。固体发酵的上游工程建设，特别是发酵组合的优选、发酵工艺的制定等，对决定所产“茵质”的性效有重要影响。据研发槐耳、槐芪、灵雷３种“茵质”的经验、体会。提出几项基本研究方法，供业内各方参用、改进，以使达规范化。

关键词：固体发酵；真茵药物；回选试验；比较茵质；目标茵质

中图分类号：￥６４６．９文献标识码：Ａ文章编号：ｌ００３—鼬１０（２伽眵）０４－１１００８．由３

现代生物制药内涵丰富，如细胞工程、基因工程、发酵工程等都有重要作用。但生物制药技术在有几千年历史的中医药传统范畴内。曾被应用、发展的唯有真菌药用的“固体发酵工程”一项（液体发酵属近代引进工艺）。它在中国古代可统称为“制曲工艺”。是用各种植物性材料在适宜条件下经自然或引导真菌等生长、发酵后产品供药用，唐《药性论》记“神曲”，由北魏时期已开始制作，用麦麸、赤小豆、杏仁（去皮）、面粉等碎粉与鲜辣蓼、青蒿、苍耳等浆汁碎屑混合后．经酵母菌等多菌种自然发酵而成，味甘辛、性温、归脾胃经，功能清食消积健脾胃．沿用至今已ｌ５００余年历史．应是历史上最早的生物制药，其后较长时期内又曾制作了“红曲”

（元）、酱

制成真菌药物，将成为“菌物药”的重要支柱。

任何“固体发酵”上游工程，都由发酵菌种与发酵基质共同构成“发酵组合”，在一定环境条件下进行发酵的工程，除尚在探索的特困发酵外，其它固体发酵的发酵条件通常是适宜的温度、光照等，大多属于真菌生态的常规需要，其中有生命活动的发酵菌种常占主导。不同性质与配比的发酵基质是影响菌质性效的重要基础，因此，优选合理、有效的发酵组合是研发目标菌质的工作前提。

当发酵组合与发酵条件被确定后．还要研究能阐明发酵周期（时间）与正确判断其发酵终点的方法，这都需要进行多项预备性试验研究。与引进工艺“液体发酵”相比较，“固体发酵”除采用固态基质外，目前仍应用分散的发酵瓶内发酵的生产方式，它有发酵速度较慢、周期较长等特点，研究工作有一定困难。为此探索试验了有关建设其上游工程的几种常用研究方法。被试用于研发槐芪菌质昂嘲与是雷菌质【日等，取得较佳效果，应继续完善，以使规范化。

（梁）、酒酿（清）等品种，其发酵菌种与材料渐趋于单一。延伸至近代，由上世纪五十年代末进入“固体培养”时期。将一种特定真菌接种在发酵瓶内．即已经过灭菌处理的由农副产品组成的培养基（料）上，经培养生长大量菌丝体．称为“培养物”．一般被认为它与同种子实体有相同的药效作用。其生产工艺已有明显改进并已有初步的下游工程，产品如猴头菌片等。

发展到上世纪九十年代初，进入“固体发酵＂ｎＩ】时期。初期是真菌在由农副产品组成的“营养基质”上进行“普通发酵”产生“药用菌质”．它较适用于研发新品种的真菌药物。曾研发了槐耳菌质与槐耳颗粒（抗癌）闭。此后又为研制真菌类药材新资源开创了“双向发酵”１３１．在发酵基质中应用或掺用具有活性成分的中药材为“药性基质”。发酵后产生“药性菌质”，如槐芪菌质Ｂ（抗病毒）、灵雷菌质（免疫抑制等）等。２１世纪又开始探索“多菌发酵”、“特因发酵”等，应用不同生产工艺产生各类“菌质”．研

ｌ发酵组合三层优选法（３＋１优选法）

研制槐苠菌质Ｒ：以槐耳ＴｒａｍｅｔｅｓｒｏｂｉｎｉｏｐｈｉｌａＭｕｒｒ为发酵菌种，作为药性基质的初选药材多达１０１种，而“灵雷菌质”的发酵基质已定为雷公藤．其供初选的发酵菌种也有２２种，应用“发酵组合ｉ层优选法”能较迅速、正确的选定有效发酵组合。１．１第一层初选

以组合的发酵性状为指标．由供选菌种或基质。与已确定的另一方所构成的不同组合。在适宜条件下进行试验，如能正常发酵，并在适当时间内产生合格“菌质”，即双方能相互适应，此发酵组合即通过初选，否则即被淘

作者简介：庄毅，研究员，现任中国药学会天然药物分会药用真菌专业组顾问、中国菌物学会药用真菌专业委员会顾问等。收稿日期：２００９－０５—１３

万方数据

真菌药用_固体发酵_上游工程建设基本研究方法

第２８卷第４期庄毅：真菌药用“固体发酵”上游工程建设基本研究方法

９

汰。应注意观察纪录，如各试验组菌种和基质的种类、来源、生长年限与性状、品质等各种基本资料．在生长发酵后菌丝体色泽、生长速度、长势、生长达到半瓶期及全瓶期时所需的天数及日期等，以资比较。研发槐芪菌质Ｂ初选汰除率达２５％，灵雷菌质达２８％．即还有１６种菌种的菌质进入复选，其菌丝体生长的全瓶期最短１３ｄ一１７ｄ．。旺盛度３＋；最长１６ｄ～加ｄ，旺盛度ｌ＋，平均２６ｄ。由本项试验看来。大多数情况下菌丝体生长速度与旺盛度呈正相关趋势，如３号、４号菌种的全瓶期都是２０ｄ，菌丝体旺盛度３＋。对入选组合的菌质要计算、记录它们由基质发酵成为菌质的转化率、消耗率及干燥处理后的折干率等。

１．２第二层复选

主要根据各种有关成分的分析试验方法，分析比较各参选菌质的化学成分．如采用薄层色谱法等对各组菌质提取物进行分析比较．根据所显示的斑点、色泽、位置及Ｒ厂值等的异同情况对各组菌质进行分型归类。

雷公藤除ｌ号一１６号共１６组复选菌质外．又增设对照组ＣＫ。（雷公藤药材）：分析结果表明ＣＫ，色谱显示６个斑点，只有１６号菌质色谱与ＣＫ，相似，可能与其发酵

性状最差有关。其它１５种按其斑点色泽、位置及Ⅳ值等

与ＣＫ，比较后，可基本归纳出Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ４种类型。每种类型都包含了３个一５个试样。

根据各种真菌的作用及发酵性状等．从４种类型中各

选一种为代表。即Ａ４号、Ｂ一８号、Ｃ—１０号、Ｄ—１４号，

经重复及其它辅助试验确认其差异后，此４组菌质（复选菌质的１／４）进入决选。复选采用的化学成分比较法应根据样品性质试验决定。１．３第三层决选

一般情况下．决选多以与临床治疗目标紧密相关又较方便的药效试验为指标，例如优选抗慢性乙肝药物，可试用以血清ＩＦＮ诱生为指标等，然而用双向发酵进行雷公藤解毒持效研究。却要求菌质的安全性与有效性并重，因此在决选中安全性以急毒预试ＬＤ∞为主，结合ＨＰＬＣ检测雷公藤甲素含量变化，而有效性因雷公藤有多个药效方向，决定先从第一方向免疫抑制人手。另根据需要增设ＣＫ２（已经灭菌处理的雷公藤药性基质）。试验结果为毒性以ＣＫ。最强，小鼠死亡率达１００％，毒性稍大于ＣＫ２，其它供试各组的毒性都有下降，其强弱顺序为８号＞１４号＞１０号＞４号．４号灵芝菌种组菌质的小鼠死亡率最低，３个剂量组均为０．ＨＰＬＣ测定雷公藤甲素下降规律与毒性下降情况相应。各组供试材料进行免疫试验，各试验组都有不同程度免疫抑制倾向。其不同剂量组间有差别，从体液免疫抑制与细胞免疫抑制等全局来看，４号灵雷菌质的作用全面、良好，灵芝就成为首选菌种。ＩＡ回选试验

为确保优选可靠．决选后还需再加１次回选，故又称３＋１试验，即从首选菌种所产菌质（４号）所属同一类型（Ａ型）中再选择另一组“比较菌质”，即与３号所用的槐耳菌与４号灵芝进行比较试验，结果二者的作用基本相

万方数据

同，说明优选正确，又经反复比较。３号槐雷菌质在“解毒”方面、４号灵雷菌质在“持效”方面各稍占优势．最后参照其它有关冈素选定灵芝作为发酵菌种。比较菌质也可选用１种已被充分证实有效的菌种．于同样基质上发酵所产生的菌质．如曾用云芝Ｃｏｒｉｄｕｓｖｅｕｉｃｏｌｏｒ代替槐耳与含黄芪的全性基质组合发酵成“云苠菌质Ｂ”，作为“比较菌质”与槐芪菌质￡进行比较后，确认槐芪菌质Ｅ被优选。

综观３＋１优选法．初选是基础。复选是核心。决选是关键。回选是保证，都有重要作用而意义有所不同。目前看来它对发酵组合的优选是有益的．但在此基础上更待改进完善。

２复方基质成分配比用量标准优化法

对应用复合成分（由多种不同材料组成）的营养基质、药性基质或全性基质。其配方中的各种材料成分的配比、用量等需进行合理优化．例如研制“槐芪菌质Ｅ”对其全性基质的配方，优化方法是根据槐耳菌质已知的适宜临床剂量，推算出其营养基质的用量，即在其中添加中药黄芪的常规用量（如每人每日１５ｇ），同时扣除等量营养基质就成为全性基质供试配方的标准组，根据此再设立黄芪的半量组、倍量组等不同梯级组，接种槐耳菌种并在一、定条件下进行固体发酵。对各组菌质进行药效、成分比较，从而选定其全性基质的最佳成份、含量配比，才能成为此发酵基质（全性基质）的标准配方。可参照此法用以制定各类有关发酵基质的标准配方。发酵组合才完全优选成功。

３

固体发酵过程基质、菌质成分药效动态比较

在发酵组合优选及优化基质配方成功的基础上。需建

要立一套科学的产品生产工艺。能阐明发酵周期和正确判断发酵终点的标准和方法。可试用“发酵过程动态比较法”。

以灭菌后的基质作为发酵０ｄ．以接种发酵菌种的当天起至菌丝体长满全瓶（全部基质）作为菌丝体生长期，其时间因菌种类别、接种体与基质性状、环境条件等不同而有所不同，如有时即使在看似相同条件下。同一组合的不同发酵瓶间菌丝体的全瓶期也会有差异，就有可能会影响瓶问菌丝体的菌龄和以后同期出料菌质的性效．因此在产品研发时期．发酵周期的计算不宜由真菌在接种后开始生长起计算．而更适宜从菌丝体长满全瓶基质时开始计算．即从全瓶期也即生长期结束起作为发酵的第ｌ天，因此各试验瓶间的发酵起始Ｅｌ期有所不同．这使它们虽有相同的发酵周期，但到达发酵终点的日期仍有不同，直到预设的发酵终点期为止，在此全程内定期（一般隔５ｄ～１０ｄ左右），对瓶内经过不同生长或发酵时间的基质（菌质）无菌操作出样，进行成分与药效检测。以掌握其动态变化规律，可以阐明最合理的发酵周期、正确的发酵终点及其判断方法。在产品投产工艺已稳定后，也可将菌丝体生长期＋发酵期作为总发酵期．比较方便实用。总发酵期满后菌质经出样检验合格即可全面出料、应用。

（下转第１４页）

３．１发酵周期

真菌药用_固体发酵_上游工程建设基本研究方法

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中国食用菌

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Ｖ０１．２８Ｎｏ．４

上。畦间行距为４０ｃｍ，便于采菇操作。经５ｄ一８ｄ休整后熟培养使断裂菌丝得以恢复，生物酶活性增强；８ｄ后开袋．挖掉菌袋袋口两头老化菌种，并进行搔菌，把菌袋朝上的料面梳理整平。保持菇棚相对湿度８０％～８５％，温度为１８℃．２０℃。’前期需氧量不是太大，每天适度通风ｌｈ即可：当菌袋袋口菌丝较为浓密时。进入催蕾管理，此阶段菇棚的空气相对湿度８５％～９０％，温度８℃～１８℃为宜，实施变温刺激，一般温差为１０℃为宜，可促进原基形成，此时加强通风，每天适度通风３ｈ左右；１周后当幼菇蕾长

到１ｃｍ左右．此时空气相对湿度８５％一９０％，温度保持在

害。低温时，喷雾到菇面。高温时，只向空气中喷雾化水．原则上少量多次。当菇体长大时，菇柄长３ｃｍ。茹柄粗ｌ

ｃｍ～２

ｃｍ一８

ｃｍ时，菇体已达八分熟。一手握菌

柄，一手抓住菌袋，轻轻旋转即可采下。第一潮菇采后，停止喷水１ｄ一２ｄ。一般情况下每袋可采３潮一４潮菇．生物学效率可达８５％。

【参考文献１

【１】刘月廉，谭树明．野生洛巴伊口蘑菌株分离与鉴定【Ｊ】．食用菌学

报．２００１，８（２）：１９—２３．

【２】王琛．鸡腿菇ＷＰ菌丝生物学特性研究咖．食用菌，２００８。

２２—２４．

１５℃。１８℃．进行育菇期培养。高温育出的菇菇质较差，贮藏时间短，低温反之；应依据菇体生长情况，及时掌控通风量，菌盖太小，菌柄粗短，说明通风太少；菌盖太大．菌柄细，说明通风太强。一般每日２ｈ，．菇棚内的光照强度以能看报纸为宜。菇棚湿度太大则易引发细菌性病

（４）：

【３】华秀红，宋金娣，刘超．棕色蘑菇的栽培特性阴．中国食用菌，

２００８，２７（１）：２５—２６．

（上接第９页）

３．２成分测定

此外应注意研究．发酵过程成分药效动态变化与菌质的生物量变化间的关系，探索其适用方式与应用价值。４结语

’

发酵过程中基质一菌质成分的测定．最好用其有效成分含量的变化，如灵雷菌质的雷公藤甲素的含量变化，或用发酵后新产生的一种特异性成分变化为指标进行测定。槐耳菌质发酵过程成分的动态变化，是根据糖与蛋白的含量变化【ｑ．要掌握有关成分的消长变化规律。３．３药效试验

药效动态变化是根据临床目标而确定，如槐芪菌质Ｂ系用血清ＩＦＮ诱生、槐耳菌质采用对小鼠Ｓ１帅的抑瘤率。在取得全部数据后以成分含量、药效作用为纵坐标，发酵时间为横坐标画出成分与药效的波动曲线，可基本确定发酵周期及终点。如槐耳菌质，其营养基质的多糖含量大于

８０ＩＩｌｇ ｇ一。而蛋白质含量约为２００ｍｇ ｇ一，从接种槐耳菌

现代各类生物制药Ｔ程中唯有真菌药用“同体发酵工程”的历史悠久，其在中药传统范畴内始于北魏时期，以“制曲工艺”制作中药“神曲”起沿用发展至今已有ｌ５００余年，并延伸发展经“固体培养”时期进入“固体发酵”时期。现已从“普通发酵”、“双向发酵”走向“固体发酵系列工程”，道路宽广、前景良好，固体发酵所产菌质的性质、效果．首先决定于其上游工程所采用发酵组合的优选、确定和合理生产工艺的建设，根据研制槐耳（药用）和槐芪、灵雷（药性）３种菌质的经验，试提出一套用于固体发酵上游工程建设的基本研究方法。希望能继续完善，以求能规范化。加速菌物药的发展。

起菌丝体生长期约２０ｄ一２５ｄ．试验设定到发酵终止总计

１００

ｄ。经按时出样测定，发现前期４５ｄ内因发酵时间的

【参考文献】

【ｌ】庄毅．药用真菌的固体发酵【Ｊ】．中国药学杂志，１９９１。２６（２）：

８０—８２．

延长，其多糖含量明显下降。蛋白质含量上升，其抑瘤率由０起也相应提高。当总发酵期达到４５ｄ左右，蛋白质与多糖的升降均已达顶点，其多糖含量小于１３ｍｇ ｇ－１、蛋白质大于３５０ｍｇ ｇ～．而抑瘤率高达５４％。此后各项指标均开始稳定下降，到１００ｄ时多糖含量已约１０Ｉｌｌｇ ｇ＿Ｉ，蛋白质也降至小于３００ｍｇ ｇ一，抑瘤率下降到２ｌ％。注意到由接种起到４５ｄ左右（总发酵期）。也是菌丝体由营养生长转向生殖生长的阶段，因此在一定条件下，槐耳菌质合理的总发酵周期（即从接种后开始计算）应在４５ｄ左右，而发酵期如从菌丝体生长期过后（即已达全瓶期）开始计算应约２５ｄ。如药理试验也证实多糖蛋白ＰＳＴ是槐耳菌质的有效成分之一．可根据其含量变化等制订槐耳菌质的发酵质量监控指标，判定菌质的发酵终点，也是所产药品质量标准的重要依据。

【２ｌ庄毅．抗癌新药槐耳冲剂的研究【Ｊ】．中国药学杂志，１９９８，８

（１２）：５４０－５４３．

【３】庄毅．药用真菌新型（双向性）固体发酵工程们．中国食用菌，

２００２，２１（４）：３．６．

【４】庄毅．药用真菌发酵工程与槐芪菌质Ｅ的研发叨．中国药学杂志，

２００４，３（２９）：１７５—１７８．

【５】庄毅．药用真菌双向发酵的起源、发展及其优势与潜力【Ｊ】．中国

食用菌．２００７，２６（２）：３．６．

【６】庄毅．真菌抗癌药物槐耳颗粒的研制叨．中国肿瘤，１９９８，８（１２）：

５“卜５４３．

万方数据

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