植物生理指标检测方法

植物组织中可溶性糖含量的测定

在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为 NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。

Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖

一、原理

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。

糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物鲜样或干样。 （二）试剂 1. 80 ％乙醇。

2. 葡萄糖标准溶液（ 100 μg/mL ）：准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至 100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 μg/mL ）。

3 ．蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 ～ 3 周。 （三）仪器设备

分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（ 5 、 1 、 0.5 mL ），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。 三、实验步骤

1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品 0.5 ～ 1.0 g （或干样粉末 5 ～ 100 mg ），放入大试管中，加入 15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸 20 min ，取出冷却，过滤入 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。

2. 标准曲线制作取 6 支大试管，从 0 ～ 5 分别编号，按表 24-1 加入各试剂。

表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量

试剂 100 μg/mL 葡萄糖溶液（ mL ） 蒸馏水（ mL ） 蒽酮试剂（ mL ） 葡萄糖量（ μg ） 管号 0 0 1.0 5.0 0 1 0.2 0.8 5.0 20 2 0.4 0.6 5.0 40 3 0.6 0.4 5.0 60 4 0.8 0.2 5.0 80 5 1.0 0 5.0 100 将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ μg ）为横坐标绘制标准曲线。

3 ．样品测定取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。 四、结果计算

溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100

式中： C ——从标准曲线查得葡萄糖量， μg 。 V T ——样品提取液总体积 , mL 。 V 1 ——显色时取样品液量， mL 。 W ——样品重（ g ）。

植物体内可溶性蛋白质含量的测定

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位/mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。

1．考马斯亮蓝法 一、 实验原理

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465 nm，后者在595 nm。在一定蛋白质浓度范围内（0-100 μg/mL），蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1 h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

二、 实验材料、仪器和试剂

1. 材料

小麦叶片或其他植物组织

2. 仪器设备

分光光度计，离心机，研钵，25 mL容量瓶1个，刻度吸管0.5 mL 2支，2 mL 1支，10 mL试管3支。 3. 试剂

(1) 牛血清白蛋白配成1000 μg/mL和100 μg/mL。

(2) 考马斯亮蓝G-250：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸

100 mL，最后用蒸馏水定容至1000 mL。此溶液在常温下可放置一个月。 (3) 90%乙醇

(4) 磷酸（85%，W/V）

三、 实验步骤：

1. 可溶性蛋白的提取

称取新鲜植物叶片0.5 g置于研钵中，加入5 mL 4oC下预冷的浓度为50 mmol/L，pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10 mL离心管中，在4 oC冰箱中静置10 min，于15000 rpm/min下冷冻离心25 min，上清液即为过氧化物粗提液。4 oC下保存备用。

2. 标准曲线的绘制

(1) 0-100 μg/mL标准曲线的制作

取6支试管，按下表数据配制0-100 μg/mL血清白蛋白液各1 mL。准确吸取所配各管溶液0.1 mL，分别放入10 mL具塞试管中，加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2 min后，在595 nm下比色，绘制标准曲线。

配制0-100 μg/mL血清白蛋白液

管号

1

2

3

4

5

6

100 μg/mL牛血清蛋白量(mL) 蒸馏水量(mL) 蛋白质含量(mg)

(2) 0-1000 μg/mL标准曲线的制作

0 1.0 0

0.2 0.8 0.02

0.4 0.6 0.04

0.6 0.4 0.06

0.8 0.2 0.08

1.0 0 0.10

另取6支试管，按表10-2数据配制0-1000 μg/mL牛血清白蛋白溶液各1 mL。与步骤（1）操作相同，绘出0-1000 μg/mL的标准曲线。 配制0-1000 μg/mL血清蛋白血液

管号

1000 μg/mL牛血清白蛋白（mL） 蒸馏水量(mL) 蛋白质含量(mg)

7 0 1.0 0

8 0.2 0.8 0.2

9 0.4 0.6 0.4

10 0.6 0.4 0.6

11 0.8 0.2 0.8

12 1.0 0 1.0

3. 样品提取液中蛋白质浓度的测定

吸取样品提取液0.1 mL（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595 nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。

四、 结果计算与分析

C?样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=

VaW式中 C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；

V－提取液总体积（mL）； a－测定所取提取液体积（mL）； W－取样量（g）。

叶绿素测定方法

1、 称取剪碎叶片0.2g，放入容量瓶。 2、 加50ml 95%的乙醇。

3、 遮光浸提48-72小时，中间摇晃一次。（保证各批次浸提时间一致） 4、 分光光度计测吸光值，三波长（649，665，470），分别对应叶绿素a、b和其他。空白为95%乙醇。

计算公式如下： CA=13.95*D665-6.88*D649 CB=24.96*D649-7.32*D665 C其他=(1000*D470-2.05*CA-114.8CB)/245 C 单位：mg/L 叶绿素a=CA*0.05/2 叶绿素b=CB*0.05/2 叶绿素其他=C其他*0.05/2 叶绿总叶绿素含量为三者之和。 一般叶绿素a/b为3：1至4：1

选择的波长不一样，计算公式就不一样，网上也有其他的波长方法，计算公式里的系数响应也有差异。

淀粉含量的测定

原理

淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量

(C6H12O6 )n → ( C6H10O5) n + nH2O

糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。在 625 nm 波长下的OD值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色 仪器用具和试剂

1. 仪器用具：移液枪、10ml离心管、试管、50ml容量瓶、试管架、棕色瓶（>=500ml）、螺口瓶（>=500ml）、

烧杯、移液管（连续加样器）、离心机、分光光度计； 2. 试剂：

葡萄糖标准液Ⅰ：精确称取0.1000g蔗糖（分析纯），于小烧杯中加水溶解，定容至100ml，加2-3滴浓H2S04，该溶液可长期保存；

葡萄糖标准液Ⅱ:准确吸取1mg/ml的蔗糖标准液5ml，加水定容量50ml，得到浓度为0.1mg/ml蔗糖标准液；

蒽酮溶液：100mg蒽酮溶于50ml浓H2S04（化学纯）中，避光保存，当天配制当天使用； 3mol/L NaOH溶液：12g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水； 3mol/L Hcl溶液：25ml浓盐酸与75ml蒸馏水混匀。 测定方法

1. 植物淀粉相关溶液的提取：向测可溶性糖所剩残渣中加入7ml 3mol/L的盐酸，在沸水浴中煮沸45分

钟，取出冷却，4000转/分离心15分钟，取上清到50ml容量瓶中，加入7ml 3mol/L NaOH，用蒸馏水定容到50ml，作为待测样品。

2. 标准曲线的配制：吸取0.1mg/ml葡萄糖标准液按下表加入至11支试管： 0.1mg/ml 葡糖(ml) 蒸馏水(ml) 葡糖浓度（mg/ml） 蒽酮试剂(ml) 0 0 2 0 8.0 1 0.1 0.9 0.01 4.0 2 0.2 0.8 0.02 4.0 3 0.3 0.7 0.03 4.0 4 0.4 0.6 0.04 4.0 5 0.5 0.5 0.05 4.0 6 0.6 0.4 0.06 4.0 7 0.7 0.3 0.07 4.0 8 0.8 0.2 0.08 4.0 9 0.9 0.1 0.09 4.0 10 1.0 0 0.1 4.0 45℃水浴中显色10~15分钟，625 nm 处测OD值 3. 准确吸取待测液1.0ml，加蒽酮4.0ml，在45℃水浴中显色10-15分钟，各管在加入蒽酮试剂时要迅速，

加完后用力振荡混匀。

4. 取出后避光冷却，在 625 nm处测OD值，从标准曲线上得到提取液中可溶性总糖含量。 结果计算

葡萄糖糖含量（%）=标准曲线对应含糖量×定容体积×100／（样品质量×显色吸取液体积×103） 粗淀粉含量（%）=葡萄糖含量×0.9 强酸溶液，注意安全

超氧化物歧化酶(SOD)的测定 一、 实验原理

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC 1.15.1.1)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基O2·ˉ，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm处有最大吸收。而SOD可清除O2·ˉ，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性的大小。

二、 实验材料、仪器和试剂：

1. 材料

小麦叶片或其他植物组织

2. 仪器设备

高速离心机；分光分度计；微量进样器；荧光灯(反应试管处理度为4000 Lx)；试管或指形管数支。 3. 试剂

(1) 1.50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)。

(2) 2.130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399 g Met用磷酸缓冲液定容至100 mL。

(3) 3.750 μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.06133 g NBT用磷酸缓冲液定容至100 mL，避光保存。 (4) 4. 100 μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721 g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至 1000 mL。 (5) 5. 20 μmol/L核黄素溶液：称取0.0753 g核黄素用蒸馏水定容至1000 mL避光存。

三、 实验步骤：

1. 显色反应

取5 mL指形管数支，测定管数目依据处理而定，另4支为对照管，按表2依次加入下列各溶液对照管用缓冲液代替酶液，蒸馏水0.25 mL。将其中2支对照管置于暗处，其它置于4000 Lx日光下反应20 min左右，主要看颜色的变化，全部变成灰色，对照可能较浅。

2. 测定

待反应结束，以不照光的对照管做空白，依次测定其它各管的吸光值。 表2 各溶液显色反应用量

试剂(酶) 0.05 mol/L磷酸缓冲液 130 mmol/L Met溶液 750 μmol/L NBT溶液 100 μmol/L EDTA – Na2液 20 μmol/L核黄素 酶液 /缓冲液（对照） 蒸馏水 总体积 用量(mL) 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 0.2 3.0 终浓度(比色时) 13 mmol/L 75 μmol/L 10 μmol/L 2.0 μmol/L 对照管以缓冲液代替酶液 四、 结果计算与分析

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性 SOD比活力

(Ack?AE)?VT[u/g(FW)]?0.5?Ack?W?VtSOD总活性[u/mg(蛋白)]?蛋白质含量式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 Ack —照光对照管的吸光度。 AE —样品管的吸光度。 VT —样品液总体积，mL。 Vt —测定时样品用量，mL。 W —样品鲜重，g。

蛋白质含量单位为mg/g。

五、 注意事项

1. 配好的Met溶液须在4℃冰箱中保存备用，以防止Met活性损失。

2. 配好的NBT溶液须放入棕色试剂瓶，并在4℃冰箱中保存备用，以防止NBT见光分解。 3. 配好的核黄素溶液须放入棕色试剂瓶避光保存。

六、 思考题

1. 在 SOD 测定中为什么设照光和暗中两个对照管 ? 2. 影响本实验准确性的因素是什么 ? 应如何克服 ?

实验六植物抗氧化酶活性的测定

酶液的提取

称取新鲜植物叶片0.5 g置于研钵中，加入5 mL 4oC下预冷的浓度为50 mmol/L，pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10 mL离心管中，在4 oC冰箱中静置10 min，于15000 rpm/min下冷冻离心25 min，上清液即为过氧化物粗提液。4 oC下保存备用。

1．过氧化氢酶(CAT)的活性测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而导致H2O2累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内的核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除植物体内的H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。

一、 实验原理

H2O2在240 nm波长下有强吸收，过氧化氢酶(Catalase, CAT, EC 1.11.1.6)能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

二、 实验材料、仪器和试剂

1. 材料

小麦叶片或其他植物组织

2. 仪器设备

紫外分光光度计，离心机，研钵，25 mL容量瓶1个，刻度吸管0.5 mL 2支，2 mL 1支，10 mL试管3支，恒温水浴锅。 3. 试剂

(1) 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮)。 (2) 0.1 mol/L H2O2 (用0.1 mol/L高锰酸钾标定)。

三、 实验步骤：

取10 mL试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管(将酶液煮死)，按表1顺序加入试剂。

表1 紫外吸收待测样品测定液配制表

试剂(酶) 粗酶液(mL) pH 7.8磷酸缓冲液(mL) 蒸馏水(mL) 管号 S0 0.2 1.5 1.0 S1 0.2 1.5 1.0 S2 0.2 1.5 1.0 25 oC预热后，逐管加入0.3 mL 0.1 mol/L的 H2O2，每加完1管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240 nm下测定吸光度，每隔l min读数1次，共测4 min，待3支管全部测定完后，计算酶活性。

四、 结果计算与分析

以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(μ)。

过氧化氢酶活性

式中： ΔA240 —— AS0 –(AS1+AS2)/2。 AS0 ——加入煮死酶液的对照管吸光度。 AS1、AS2 ——样品管吸光度。 Vt ——粗酶提取液总体积(mL)。 V1 ——测定用粗酶液体积(mL)。 FW ——样品鲜重(g)。

0.1 —— A240每下降 0.1为 1 个酶活单位(μ)。 t ——加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

注意：凡在 240 nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

?A240?VT[u/(g?min)]?0.1?V1?t?FW五、 注意事项

1. 试剂中的H2O2的浓度对测定结果影响较大，要注意标定的准确性。

2. 缓冲液中必须加PVP，以防止酶活性降低。

六、 思考题

1. 影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？

2. 超氧化物歧化酶(SOD)的测定 七、 实验原理

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC 1.15.1.1)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基O2·ˉ，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm处有最大吸收。而SOD可清除O2·ˉ，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性的大小。

八、 实验材料、仪器和试剂：

1. 材料

小麦叶片或其他植物组织

2. 仪器设备

高速离心机；分光分度计；微量进样器；荧光灯(反应试管处理度为4000 Lx)；试管或指形管数支。 3. 试剂

(6) 1.50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)。

(7) 2.130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399 g Met用磷酸缓冲液定容至100 mL。

(8) 3.750 μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.06133 g NBT用磷酸缓冲液定容至100 mL，避光保存。 (9) 4. 100 μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721 g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至 1000 mL。 (10) 5. 20 μmol/L核黄素溶液：称取0.0753 g核黄素用蒸馏水定容至1000 mL避光存。

九、 实验步骤：

植物组织游离脯氨酸含量的测定

原理：植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。

材料、仪器设备及试剂 1．材料：植物叶片 2．仪器设备：分光光度计；水浴锅：漏斗：大试管(20m1)；具塞刻度试管(20m1) 注射器或滴管(5～lOml)。 3．试剂：(1)3％磺基水杨酸溶液(2)甲苯；(3)2.5％酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mo1.L-l磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3天有效(4)脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100ug.mL-l。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至lOOml，即成10μg．mL-1的脯氨酸标准液。 1．标准曲线制作（1）取7支具塞刻度试管按表9.2-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。(2)取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色。（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程 9．2．1各试管中试剂加入量

试管 0 1 2 3 4 5 6

脯氨酸标准溶液(m1) 0 0．2 0．4 0．8 1．2 1．6 2．0 水(m1) 2 1．8 1．6 1．2 0．8 0．4 0 冰乙酸(m1) 2 2 2 2 2 2 2 茚三酮显色液(m1) 3 3 3 3 3 3 3 样品测定

（1）脯氨酸提取：取不同处理的剪碎混匀植物叶片0．2～0．5g(干样根据水分含量酌减)，分别置于大试管中，加入5m1 3％磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。 (2)取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2m1，加2m1冰乙酸和3m1显色液，于沸水浴中加热40min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色）。

(3)结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度 脯氨酸含量的百分数。 脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)](C．V)·(a·W)－1

式中：C一提取液中脯氨酸浓度(PS)，由标准曲线求得： V － 提取液总体积（ml） A --- 测定时所吸取得体积（ml） W----- 样品重（g）

实验一植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）

一、 实验目的

学习植物激素的ELISA测定原理，掌握激素测定技术和样品提取方法。

二、 实验原理

免疫测定的方法是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性高且快速、简便、成本低廉、无放射性污染等特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。目前，几大类植物激素IAA、ABA、GA3、GA4、iPA、ZR和DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。

ELISA是建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即抗原和抗体反应的高度专一性和敏感性；酶的高效催化特性。ELISA把这而这有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。

ELISA根据均相、非均相以及竞争与非竞争可分为非竞争固相免疫测定、非竞争均相免疫测定、竞争均相、竞争固相测定。常用的免疫测定均为非竞争固相和竞争固相免疫测定统称为酶联免疫吸附测定。所用的吸附载体为聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯酶联板以及硝酸纤维素膜（dot-ELISA）等。目前植物激素的酶联免疫检测方法有三种形式（见下图）：直接法，间接法和简化的间接法。

直接法是在固相载体上直接包被抗体（或先包被二抗，再加一抗。此为直接包被抗体的一种变通形式），利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。 Ab+H+HE=AbH+AbHE

其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HE表示酶标抗原。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HE的量确定时，游离H越多， AbH形成的就越多，而AbHE形成的就越少，即结合在板上的酶标抗原就越少；反之游离H越少， AbH形成的就越少，而AbHE形成的就越多，即结合在板上的酶标抗原就越多。通过检测酶的活性，就可以确定游离H量的多少。

间接法和简化的间接法是包被抗原（间接法）。利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。间接法是竞争后，再加入二抗标记的酶，而简化的间接法是在竞争的同时就加入二抗标记的酶。 Ab+H+HP=AbH+AbHP

其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少；游离H越少，AbH形成的就越少，而AbHP形成的就越多，即结合在板上的抗体就越多。而板上的抗体可以与二抗标记的酶结合，检测酶的活性，就可以确定游离H量的多少。

间接法直接法简化间接法

三、 实验材料、仪器和试剂

1. 材料

新鲜植物材料

2. 仪器设备

研钵，冷冻离心机，氮气吹干装置，酶联免疫检测仪，吸水纸，恒温箱，冰箱，96孔酶标板，可调微量液体加样器（10 μL，40 μL，200 μL，1000 μL），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。

3. 试剂

(1) 包被缓冲液：称取1.5 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3, 0.2 g NaN（可不加）, 用量筒加1000 mL蒸馏水，3

pH为9.6。

(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0 g NaCl, 0.2 g KH2PO4, 2.96 g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1000 mL蒸

馏水，pH为7.5。

(3) 样品稀释液：500 mL PBS中加0.1 mL Tween-20，0.5 g明胶（稍加热溶解）。

(4) 底物缓冲液：称取5.10 g C6H8O7·H2O（柠檬酸）， 18.43 g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1000 mL蒸馏

水溶解，再加1 mL Tween-20，pH为5.0。 (5) 洗涤液：1000 mL PBS加1 mL Tween-20。 (6) 终止液：2 mol/L 硫酸。

(7) 提取液：80％甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚为抗氧化剂，先用100%甲醇溶解BHT，

再配成80%的浓度。否则BHT 难溶解)。

(8) 各激素包被抗原、各激素抗体、激素标准物和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（间接和简化间接

酶免疫测定用试剂）。各激素抗体、激素标准物和各激素酶标物（直接酶免疫测定用试剂）。

四、 实验步骤

1. 样品中激素的提取

(1) 称取0.5-1.0 g新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20℃的低温冰箱中），

加2 mL样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10 mL试管，再用2 mL提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。

(2) 4℃下提取4 h，1000 g离心15 min(实验中离心机型号LDZ5-2，约4000 rpm), 取上清液。沉淀中加1 mL

提取液，搅匀，置4℃下再提取1 h，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。

(3) 上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是： 80%甲醇（1 mL）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后

用100%甲醇（5 mL）洗柱→100%乙醚（5 mL）洗柱→100%甲醇（5 mL）洗柱→循环。

(4) 将过柱后的样品转入5 mL塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样

品稀释液定容（一般0.5 g鲜重用1.5-3.0 mL左右样品稀释液定容）。

2. 样品测定

(1) 包被：在10 mL包被缓冲液中加入一定量的包被抗原（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀，在酶标

板每小孔中加100 μL。然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置于37℃下3 h。

(2) 洗板：将包被好的板取出，放在室温下平衡。然后甩掉包被液，将下口瓶内的洗涤液通过乳胶管均匀

加入板上，使每孔充满洗涤液，放置约0.5 min,再甩掉洗涤液。重复3次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。

(3) 竞争：即加标准物、待测样和抗体。

a) 加标样及待测样：取样品稀释液0.98 mL，内加20 μL激素的标样试剂（100 μg/mL）,即为2000

ng/mL标准液，然后再依次稀释1000 ng/mL, 500 ng/mL,250 ng/mL,125 ng/mL,62.5 ng/mL，31.25 ng/mL，15.625 ng/mL，0 ng/mL。将系列标准样加入96孔酶标板的前三行，每个浓度加3孔，每

孔50 μL，其余孔加待测样，每个样品重复三孔，每孔50 μL。

b) 加抗体：在5 mL样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签）,混匀后每孔加

50 μL，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。 c) 竞争条件37℃左右0.5 h。

(4) 洗板：方法同包被之后的洗板。但要注意第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。目

的是防止各孔的相互干扰。

(5) 加二抗：将一定量的酶标二抗，加入10 mL样品稀释液中（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀后，

在酶标板每孔加100 μL，然后将其放入湿盒内，置37℃下，温育0.5 h。 (6) 洗板：方法同竞争之后的洗板（步骤4），洗五次，

(7) 加底物显色：称取10-20 mg邻苯二胺（OPD）溶于10 mL底物缓冲液中（小心勿用手接触OPD），完

全溶解后加2-4 μL 30% H202。混匀，在每孔中加100 μL（在暗处操作），然后放入湿盒内，当显色适当后（即0 ng/mL孔与2000 ng/mL孔的OD差值约为1.0左右时），每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。

(8) 比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品492 nm处的OD值。

五、 结果计算与分析

1. 标准曲线

用于ELISA结果计算最方便的是logit曲线。曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/mL ）的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。Logit值的计算方法如下： B/B0 B Logit（B/B0）=ln———— =ln———— 1-B/B0 B0-B

其中B0是0 ng/mL孔的显色值，B是其它浓度的显色值。作出的logit曲线在检测范围内应是直线。待测样品可根据其显色值的logit值从标准曲线计算出所含激素浓度（ng/mL）的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度（ng/mL）。

2. 含量计算

求得样品中激素的浓度后，样品中激素的含量（ng/g·fw）可用下式计算： N·V2·V3·B

A = ————— V1·W

其中，A表示激素的含量（ng/g·fw）； V2表示提取样品后，上清液的总体积；

V1表示进行真空浓缩干燥的上清液体积；（当提取的上清液全部进行真空浓缩干燥时V1与V2的体积是相等的）

V3表示真空浓缩后用样品稀释液定容的体积； W表示样品的鲜重；

N表示样品中激素的浓度（ng/mL）；

B表示样品的稀释倍数（样品稀释液定容以后的稀释倍数）。

无菌技术与微生物分离培养

一、

实验室的主要仪器和常用器皿介绍

1．主要仪器

天平、光学显微镜、干热灭菌用电烘箱、高压蒸气灭菌锅、培养箱、冰箱、摇床、离心机、分光光度计、pH计、水浴锅、细菌过滤器、磁力搅拌器等。 2．常用玻璃器皿

试管、培养皿、三角瓶、吸管、量筒、漏斗、烧杯、烧瓶、试剂瓶、滴瓶、干燥器、载玻片、盖玻片 3.其它器具

接种环、接种针、接种钩、试管架、铝锅、染色缸、玻璃刮刀、洗瓶、注射器、酒精灯、硅胶塞、滤纸、pH试纸、纱布、棉花、包扎绳。 二、

普通光学显微镜观看细胞示范

光学显微镜可分辨大于0.2um的物体，有一定的适用范围。如果有更高的实验要求可以选择扫描电子显微镜、透射电子显微镜、扫描隧道显微镜。 （附观察到的细胞视野图片） 三、

器具洗涤与干燥

1、洗涤剂

a.肥皂、洗洁精、洗衣粉是很好的去污剂，用于除去器皿上沾有的少量油脂。

去污粉含有碳酸钠、碳酸镁，具有起泡和除油垢作用；硼砂增加了摩擦作用，使去污能力增强。

b.重铬酸盐洗涤液，是一种强氧化剂，去污能力很强，常用来洗去玻璃和瓷质器皿上的有机物。 c.酸碱洗涤剂

1) 稀释3倍的盐酸。除去铁锈、碳酸钡、钙盐及其他金属氧化物污污痕。

2) 稀释3倍的硝酸。用于塑料器皿和沾污硝酸银器皿的洗涤。

3) 5.0g乙二酸溶于100mL10%的硫酸溶液，经加热可洗去盛过高锰酸钾的容器内壁上的

棕色二氧化锰。

4) 碱性乙醇溶液。用30%氢氧化钠和等体积乙醇配制而成，用于清洗有油垢的玻璃器皿

和瓷质器皿。具有强腐蚀性，使用时小心。 d.其他有机洗涤剂

常用的有汽油、丙酮、乙醇、乙醚、苯、松节油、四氯化碳，可用于洗脱油脂、树脂、脂溶性染料等。二甲苯可洗脱油漆。

洗涤剂的种类很多，根据要求或污染物的性质选择有效的洗涤剂。 四、

器皿的干燥

常用干燥方法有室温晾干、烘箱烘干、吹干。

五、

器具的灭菌方法

灭菌前准备：a.玻璃器皿用报纸包扎。b.离心管、小试管等装入大烧杯，用报纸封口橡皮条扎口。c.三角瓶用封口纸封口包扎。d.培养基在三角瓶或蓝盖瓶内配制好封口。 注意：1、液体在蓝盖瓶中灭菌时，用锡铂纸包住瓶口。灭菌前把瓶盖稍稍拧开。2、与菌接确过的器皿，要先灭菌再清洗。且灭菌时不可与其它器具一起灭菌，需要单独灭菌。 1.火焰灭菌：简单地将接种针、镊子、试管口等用具直接利用火焰把微生物灼烧而死的方法。

2.干热灭菌：在电烘箱中利用干热的空气进行灭菌的方法。微生物细胞内的蛋白质，在无水时于160℃开始凝固变性而达到灭菌的目的。水分含量越高，蛋白质凝固越快，反之，

越慢。所需温度是160-170℃，时间约2h，但是，不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞会烧焦，甚至引起燃烧。

3.高压蒸气灭菌：将待灭菌的物品放在密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使锅隔层间的水沸腾成为蒸汽，随着灭菌锅内蒸汽压力的升高，使沸点增高，温度也升高。最终使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

注意：1、一般培养基用121℃，20-30min即可达到彻底灭菌的目的。2、有些培养基，如牛乳、明胶等，因温度过高会变质。采用115℃，15-20min即可。3、一些含有糖的培养基用112℃，以免温度过高引起糖的炭化或分解。4、土壤灭菌比较困难，需铺成薄层，121℃ 2h,或135℃ 1h。总之，灭菌条件依具体情况而定 3.过滤除菌法：对于含热不稳定的物质，如血清、维生素、糖类等，可用过滤方法得到无菌的滤液。所用滤器叫到细菌过滤器，是由孔径极小、能阻挡细菌通过的特制多孔介质，如陶瓷、硅藻土、石棉、玻璃砂等制成。

4.辐射灭菌法：紫外线、X射线、γ射线在一定剂量下可以杀死微生物。X射线、γ射线的穿透力强，主要用于药物和食品的灭菌。由于对人体有害，操作时要有一定的防护措施。 六、培养基

1、按营养划分：天然培养基、半合成培养基、合成培养基。

2、按状态划分：液体培养基，不加凝固剂；半固体培养基，液体培养基中加入少量琼脂（0.3-0.6%）；固体培养基，加入凝固剂。

3、按用途划分：基础培养基，营养要求相似的微生物所需要的物质接近，除少数几种外，绝大多数物质是相同的；选择培养基，在一定的培养基中加入某些物质或除去某些营养物质以阻止一般腐生性微生物的生长，而只满足一个类群或某一种微生物的生长； 七、土壤中固氮菌和解钾细菌的分离培养

牛肉膏蛋白冻培养基：牛肉膏3.0g, 蛋白冻10.0 g, NaCl5.0 g, 水1000 mL,

pH7.0-7.2。

解钾细菌培养基：蔗糖5.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，

FeCl3·6H2O 0.005 g，CaCO3 0.1 g，钾长石矿粉 1.0 g，琼脂 18.0 g，水 1000 mL，pH 7.0-7.5。 *钾长石矿粉单独灭菌

瓦克斯曼77号培养基：葡萄糖 10.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 0.5 g，

MnSO4·4H2O 1%溶液2滴，NaCl 0.2 g，FeCl3·6H2O 1%溶液2滴，1%刚果红 5.0 mL，琼脂 18 g，水 1000 mL，pH 7.0。 *1%刚果红溶液过滤除菌后加入培养液。

土壤中固氮菌和解钾细菌的分离操作步骤：

1).称取10.0 g土壤，用100 mL蒸馏水溶解，磁力搅拌器搅拌10min，取上清液，即土壤浸提物的稀释倍数为10-1。

2).把土壤上清液稀释成系列梯度：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7. 10-1 5 mL 10-2 4.5 mL 10-3 4.5 mL 10-4 4.5 mL 10-5 4.5 mL 10-6 4.5 mL 10-7 4.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 3).取相应稀释倍数的上清液各100uL，加入到固体培养皿（提前制备好，备用）中，再用玻璃刀抹均匀。

4）.固体培养皿放在25℃培养箱中培养一周，观察菌落。

5）.挑目标菌斑，用接种针划线到另一个固体培养皿中，培养一周得到单克隆菌落。即完成了土壤中特定细菌的分离培养。

6）.用牛肉膏蛋白冻液体培养基扩大培养，摇菌到OD600值在0.6时，用40%甘油1：1混均，-80℃保存。 作业要求：

1、实验报告一份。

2、附观察到的细胞视野图片。

3、附分离得到的细菌固体培养皿菌斑图片。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/1xf3.html