核酸分子杂交及PCR技术

核酸的分子杂交技术

一、核酸分子杂交

用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。

二、核酸分子杂交的分类

液相杂交

核算分子杂交 印记杂交

固相杂交

原位杂交

1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。 2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。

常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭

缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。

三、核酸分子杂交的基本原理 1、变性：

在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。

﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 ﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。

﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。

增色效应： DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。 DNA热变性现象

双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。 增色效应和减色效应

当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。

1

A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。 Tm=（G+C）%×0.41+69.3

Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。 2、复性

在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。 在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。 ﹡复性过程：

第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链，这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基不能配对就会重新解离，一旦找到正确的互补区，则其局部双链形成核（成核反应），然后核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子。 ﹡影响复性的因素

① 单链核酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接影响单链分子碰撞的几率，浓度

越高，复性越快。 ② 核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形成配对的难度也大，复性也慢。 ③ 核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列的总长度，复杂性越高，形成正

确配对的难度也越大，复性越慢。 ④ 温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不

易解离。适宜的复性温度是比Tm低25℃。 ⑤ 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减

少双链间的静电斥力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。

3、杂交

﹡来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。 ﹡杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA之间的杂交。

﹡核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA或RNA片段上带上可检测的标记，可用来检测样品中未知的核酸序列。 ﹡影响核酸分子杂交的因素：

- 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。

- 离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形成。 - 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进行杂交。

- 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。

- 杂交条件的严谨性：指杂交反应体系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。它主要与杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。实际操作时，一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率，以较高严谨性洗膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针，以提高特异性。 4、预杂交

为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂前的这些处理过程称为预杂交。 ﹡常用于预杂交的封闭物：

2

﹡变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在杂交反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。 ﹡高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。 四、核酸探针

1、定义： 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。 为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。

﹡分子杂交技术的应用

利用核酸探针，可以：

? 通过同源性比较,研究不同物种或个体DNA之间的亲缘关系； ? 通过杂交的严紧性,发现基因的缺失或突变；

? 通过标记信号的强度,测定某种遗传信息量的多少；

? 证明某种疾病(如肿瘤)是否与某种基因(如病毒基因)有关。 2、探针的制备方法

探针长度一般以50-300bp为宜。 制备方法：

1）利用DNA重组技术 2）PCR扩增 3）化学合成

3、探针的分类：

据制备方法及核酸性质不同，可分为：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针

（1）寡核苷酸探针：

由实验者设计、经核苷酸合成仪合成。目前的合成仪均可合成70-100bp长的寡核苷酸，但一般常用的寡核苷酸针长18-30bp。 优点：

① 制备方便，实验者可根据需要自行设计，避免了天然核酸探针存在的高度重复序列。 ② 由于大多数寡核苷酸探针长度只有15-30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响

其熔解温度。因此它特别适用于基因点突变分析。

③ 比活度高，适用于大多数杂交，如DNA序列测定、Sounthern、Northern原位杂交等。

缺点：探针短，与靶序列形成的杂交体稳定性差，对杂交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大；探针特异性差，背景噪音也大。 （2）基因组DNA探针：

利用机械剪切或限制性内切酶消化基因组DNA制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库，进而进入文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足够量的基因片段，经适当的标记后，即可作为探针使用。PCR方法也可制备DNA探针。在选择此类探针时要特别注意真核基因组中存在的高度重复序列。要尽可能使用基因的编码序列（外显子）作为探针，而避免使用内含子及其它非编码顺序，否则探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性。

基因组DNA探针 从基因组DNA文库中选取某一基因片段

↓

3

与载体连接（质粒、噬菌体）

↓

克隆(PCR扩增)

↓ 酶切

优点：①无性繁殖、制备方法简单；②不易降解（与RNA比较）；③标记方法成熟。 （3）cDNA探针：

由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的cDNA插入到适当的载体中，构建cDNA文库，然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及纯化该cDNA片段即可。

优点：双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针

高，杂交信号强。

缺点：由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现象。 cDNA探针（complementary DNA）

通过逆转录

↓ 双链cDNA

↓ S1核酸酶切平两端 加接头

↓ 限制酶

粘性末端 ↓ 载体连接 ↓ 克隆

（4）RNA探针：

以双链DNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶于体外转录而成。 优点：①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。 ②单链，不存在变性和自我复性。 ③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。 ④杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。 缺点：RNA容易降解。

4、探针所携带的标记物应具备的条件：

﹡标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。

﹡标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。 ﹡稳定性好、环境污染少、价廉。 5、常用的探针标记物：

﹡放射性同位素：3H、32P、35S、125I等。

﹡非放射性同位素：地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。 6、探针的标记方法 （1）缺口平移法 （2）随机引物标记法 （3）末端标记法

4

（4）生物素光照标记法 ﹡缺口平移法的原理

- 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。

- 首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 - 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。

切口移位（平移）法

﹡随机引物标记法原理

用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。

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﹡末端标记法原理

（1）一种是在5`末端加成标记法：

先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5`-OH上。

（2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。

﹡生物素光照标记法

光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针。 7、探针的纯化

1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质

2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离

子及寡核苷酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50

3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化

探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针 习题1 DNA分子受热变性时，其特征是( ) Ａ．碱基间的二酯键断裂 Ｂ．形成超螺旋

Ｃ．熔点温度随G—C碱基对的含量增加而升高 Ｄ．在２６０ｎｍ处的光吸收降低

习题2 (2002年全国生物学联赛试题) 热变性的DNA分子，在适当条件下可以复性，条件之一是( )

Ａ．浓缩 Ｂ．加入无机盐 Ｃ．骤然冷却 Ｄ．缓慢冷却

习题3 下列关于核酸的描述，不正确的是（ ）

Ａ．核酸既有酸性基因又有碱性基因，所以是两性电解质，因磷酸的酸性强，通常表现为酸性

Ｂ．核酸变性后会发生减色效应，而复性时会发生增色效应 Ｃ．核酸的最高紫外吸收峰值接近260ｎｍ

Ｄ．G—C对的含量愈高，介质的离子强度越高，核酸的Ｔｍ值就越高 习题4 (2002年全国生物学联赛试题) 在有核酸的两个制剂D和E中，D的Ａ２６０／Ａ２８０＝２．０；Ｅ的Ａ２６０／Ａ２８０＝１．０。因此判断制剂D比制剂E要纯（ ）

6

四、核酸分子杂交技术

Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、组织原位杂交等。 （一）Southern 印迹杂交

此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。

纯化的待测DNA样品

↓限制性内切酶酶切后（EDTA，65℃灭活限制酶）

琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段

↓变性液（碱变性） 凝胶上DNA变性

↓Tris缓冲液 中和

↓高盐下 DNA转印至NC膜

↓烘干、固定 预杂交 ↓ 杂交 ↓

放射自显影

↓

结果分析

Southern杂交

1．预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点。预杂交液为不含DNA探针的杂交液

2．杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交。双链DNA探针需加热变性为单链，

再杂交

3．洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA 杂交结果检测

1．放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2．比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针 Southern杂交在医学中的应用 1．酶切图谱分析

2．特定基因定性和定量 3．基因突变分析

4．限制性片段长度多态性的分析 （二）Northern印迹杂交

与Southern杂交类似。检测目的RNA的存在与否及含量。 Northern印迹杂交

1．基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2．鉴别RNA

3．探针可用DNA或RNA片段 4．待测样品为总RNA或mRNA

Northern印迹与Southern 印迹的不同点

1．变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变 性状态，DNA电泳前

和电泳中不变性；

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2．转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及

中和处理；

3．靶核酸为RNA；

用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。 (三）原位杂交 in situ hybridization

又分为菌落杂交或噬菌斑、以及真核细胞原位杂交。 直接用探针与细胞或组织切片中的核酸杂交。 应用：1）观察基因在组织中的表达 2）确定基因在染色体中的定位

对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。

需要目的基因的探针。 五、蛋白杂交

（一）蛋白质的免疫印迹（western)

场所：硝酸纤维素膜 待检分子：蛋白 探针：抗体

杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用 特定的抗体与蛋白

杂交，检测特定的蛋白。

（二）所用抗体

1．一抗：针对待测分子的抗体

2．二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性同位素或生物素 （三）操作过程

蛋白的制备 -----→ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质

杂交（一抗与特定蛋白结合）

↓

漂洗去除多余的一抗

↓

二抗与一抗结合

↓

漂洗去多余的二抗

↓ 结果检测

六、生物芯片

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生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。

Biochips

DNA Chips Protein Chips Lab Chips

﹡DNA芯片技术的基本原理

DNA芯片技术的基本原理是分子识别，与Southern杂交和Northern杂交同出一理，即DNA的碱基互补配对和序列互补原理。

第四节 基因扩增技术——PCR

一、基因扩增（gene amplification)

指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式： 环境诱发扩增

基因的程序性扩增 基因组进化扩增 基因工程扩增 PCR扩增 1. 环境诱发扩增

在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。

2. 基因的程序性扩增

在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。

3. 基因组进化扩增

生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。 4. 基因工程扩增

载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。 5. PCR扩增

应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。

二、PCR技术 Polymerase Chain Reaction 1. PCR的发明

（1）1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。

当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。 （2）1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。

Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。 （3）Taq DNA 聚合酶

1986年 H.A. Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。

1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中。使 PCR自动循环仪成为可能。

（4）PCR 仪

1988年 Cetus公司发明自动热循环仪。 三、PCR的原理

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PCR基本原理

在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 变性(denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 退火(annealing)：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。

延伸(extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在条件下，5?→3?的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 （1）DNA模板变性 95℃

双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。 （2）DNA模板与引物复性 40-65℃

引物（primer）：人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。

（3）DNA链的延伸 72℃

DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。 PCR的过程

（1）第一步：变性（denature）

94-95 oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。 （2）第二步：复性（anneal）

50-60 oC下1分钟，引物优先与模板复性。 ① 引物的浓度高， ② 引物的链短。

（3）第三步：延伸（extend）

72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3?端上加上核苷酸。 （4）第四步：变性（denature）

94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。 （5）第五步：重复（repeat） 二、常规PCR操作 ﹡试剂：

引物：根椐待扩增的DNA片段，设计其特异的上、下游引物。 耐热DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶。 10×PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl(pH 8.4，20℃)，150mmol/L MgCl2 ，

1mg/ml明胶。

2mmol/L dNTP贮备液：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4种脱氧核苷酸。 ﹡操作程序

PCR反应体系：

10×PCR buffer 10μl dNTP mix 各200μmol/L 引物1 1μmol/L 引物2 1μmol/L DNA模板 50ng-1 μg Taq 酶 2U 加双蒸水至总体积为100μl PCR扩增条件：94℃, 300S ↓

10

94℃, 60S 55℃, 60S 30 cycle 72℃, 60S

↓ 72℃, 10 min

PCR扩增AIV M基因片断

5’-

301 gttctacact ctgatcacag cgtttttgat cggcgtacag gcagaaccgt acacagagat 361 caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct 421 ctgacacagcc ctacgcagag cccgcagtgc ccctgctgaa ccaatagctg cccgtgtgac 481 agggacgacc cgcaacatca ctgtggaccc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc 541 accccgcgtg ctgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc

-3’

Perim 1: (5?) gat cgg cgt aca ggc aga ac (3?) 328-347 Perim 2: (3?) cgc ggg gtg aac gga gtc tc (5?) 529-548

预期扩增长度：220bp

﹡PCR的特点

（1）特异性强

① PCR使用专门合成的DNA引物。 ② 延伸过程是在高温下进行。

这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。 （2）敏感性高

需要的模板量极低。

理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！ （3）快速

整个PCR过程约4小时即可完成。 （4）简便

对模板的纯度要求低。

不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。 （5）可以扩增mRNA

RT-PCR：先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。 ﹡影响 PCR的因素

（1）Taq DNA聚合酶

自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。 ① 热稳定性

Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。 ② 最适温度高

最适温度： 75-80 oC

延伸速度： 约35-150nt/s.酶分子 最长延伸长度：6.7kb ③ Taq酶的功能缺点：具有5??3?聚合酶活性和5??3?外切酶活性，但没有3??5?外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！

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合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。 ④ Taq DNA聚合酶的激活剂

金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。 50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。 （2）其它耐热的 DNA聚合酶 ①Tth DNA聚合酶

无3? ? 5?DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。 ②VENT DNA聚合酶

有3??5?外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100oC高温。 ③ Pfu DNA Polymerase

有3 ?-5?的外切酶活性，5?-3?外切酶活性。是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端！ ④Taq Plus DNA Polymerase

是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。 Taq的PCR产物3?端往往带有一个A。 （3）引物（primer) 设计

①序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 ②引物长度以15-40 bp为宜。

③碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 ④引物内部避免形成二级结构。 ⑤两引物间避免有互补序列。

⑥引物3?端为关键碱基；5?端无严格限制。 3? 5? 5? ----------→

限制性内切酶的识别序列

启动子序列 定点突变 探针标记

避免连续相同碱基排列或内部回文序列。

5?GGCAGTCTGCCAGTCTAC3? 发卡结构 避免形成引物二聚体（dimer）

两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。 primer1

5? G G T C T G C C A G T C T A C3?-----------------→ ←---------------------3 ?C A G G A C T T A G T C A C T 5? primer2

Sense primer vs Antisense primer

Upstream primer vs Downstream primer Forward primer vs Reverse primer Primer1 vs Primer2

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（4）模板（template) ① 纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯

合剂等影响DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量：不能太多，100?l反应体系中100ng足够。 （5）dNTPs

dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。 一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。 浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。 （6）Mg 2+ 的浓度

Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。

所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。 一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。 ﹡PCR技术的扩展 1.定量PCR

半定量PCR 荧光定量PCR

半定量PCR（相对定量）

参照DNA 4-1 4-2 4-3 4-4 4-5 4-6

待检靶基因： 相同

? 引物相同 ? 靶基因相同 ? 模板量不同 荧光定量PCR

Real—time PCR（或TaqMan PCR ）

借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。

Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。 非特异性荧光标记：

1、SYBR Green 2、EB 特异性荧光标记： 3、TaqMan

4、TaqMan-MGB

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5、Molecular Beacon

6、Amplisensor

实时荧光定量PCR 方法 1 ——SYBR Green 法

工作机理：

SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光

复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

实时荧光定量PCR 方法2 ——TaqMan法

TaqMan---水解型杂交探针

5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)

探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R 与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针

3.巢式PCR

采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内 用途：验证第一次PCR产物的特异性 进行特殊PCR，如合成探针模板 4.反向PCR

扩增两个引物外侧的未知序列（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列） 技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子。

使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。

5.不对称PCR

用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。 技术关键：两个引物的浓度相差100倍。

低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。 6.反转录PCR（RT-PCR)

扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。 技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖 7. PCR技术的应用

（1）扩增某一段DNA

从基因组中扩增； 从载体上扩增； 组织样本原位扩增；

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微量残留DNA扩增； 分析模板序列；

（2）基因的体外诱变

在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。

技术关键：利用引物的5?端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。 （3）基因组的比较研究

比较不同物种之间的基因组特征和相似性。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA)

利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。

类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。

8. PCR技术在医学中应用 （1）.获得目的基因

（2）PCR在病原体基因检测的应用

PCR技术可用于诊断禽流感、口蹄疫、爱滋病、肝炎病毒、结核杆菌等 （3）PCR技术在法医学上的应用：

法医学上检测DNA的目的有两个，即个人识别与亲子鉴定。由于PCR技术可以在数小时内将目的DNA成千上万倍的扩增，使得犯罪现场留下的极少量的证据，如一滴血、一根毛发、少量精液、口腔上皮细胞以及骨块等都可进行DNA分析。从理论上讲，即使样品DNA已经降解，但只要有一条DNA链包含了欲扩增的靶序列，便可进行PCR反应。 ①HLA-DQα分型的应用

HLA-DQα：人类白细胞抗原-DQα

从功能和结构上可将HLA蛋白分为两类：I类和II类。HLA II类蛋白的基因位于第6号染色体上，并由三个家族组成：HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR。每个家族的表型蛋白又由二个亚单位构成：α和β。已经发现，HLA-DQα有8种等位基因，其中有6种最为常见。人们设计了一套能确定这6种常见等位基因特异的寡核苷酸探针（ASO），通过PCR技术，扩增这6种等位基因，然后采用斑点杂交，进行分析。DQα位点的6个等位基因有21种基因型，鉴别能力可达93%。 ②在性别鉴定中的应用

决定人类性别的基因位于Y染色体短臂1A1上，人们将其命名为SRY基因。在染色体上只要缺失SRY，个体就发育成女性。用针对SRY基因和X、Y同源序列的两对引物进行PCR扩增，只有男性会出现299bp的扩增片段。用这种方法可鉴别胎儿、运动员、犯罪人员等的性别，准确率极高。 （4）遗传相关基因的检测 ①苯丙酮尿症（PKU）

PKU是一种常染色体隐性遗传病，患者由于苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺乏或不足，造成苯丙氨酸及其代谢产物不能按正常代谢途径转变为酪氨酸，使得苯丙氨酸及其代谢产物在体内大量蓄积。未经治疗的患者出现脑组织损伤和不可逆的智力发育障碍。

人类PAH基因全长约90kb，包括13个外显子。引物设计在每个外显子及其两侧部分内含子序列。在PUK突变基因中，有几个突变基因的序列改变引起限制性内切酶识别位点的改变。常用的诊断方法是对相应的外显子进行扩增，PCR产物提纯后，应用这些限制性内切酶酶切，通过电泳分离酶切片段，判断个体是否有该种突变。 ②杜氏营养不良症：

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是一种男性常见的致死性X性连锁隐性遗传病，此种病也是由于基因缺陷所致。人们设计多对引物，用于扩增6个易缺失区。经一次PCR同时扩增，然后电泳观察，当其它片段扩增成功，而某个片段无扩增时，说明这段外显子缺失。在家系中相关的可疑女性妊娠时，可有针对性地对男性胎儿进行DNA检测，达到产前诊断的目的。

第五节 DNA序列分析

一、双脱氧链终止法

Sanger等1977年发明。Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖 原理：

（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。 （2）脱氧核糖的连接是以3??5?磷酸二脂键。 （3）复制反应可以在体外进行。

（4）2?和3?双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。 二、Maxam-Gilbert化学修饰法

1977年，哈佛大学的A.M. Maxam和W. Gilbert发明。Walter Gilbert, 1980年Nobel Prize化学奖。

原理： 化学试剂处理

末端放射性标记的DNA片单链———————→特定的碱基中引入化学基团 ↓

长度只差一个核苷酸的DNA链混合物←——————DNA在被修饰的核苷酸位置断裂 ↓

凝胶电泳 ————→ 放射性自显影 ————→ 阅读碱基顺序 三、DNA杂交测序

90年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。 原理：

（1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形成完全的双链分子。杂交效率最高。 （2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。 （3）非互补碱基越多，杂交效率越差。 四、DNA自动化测序

1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。 技术要点： （1）非放射性标记

荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。 （2）不同的标记对象

既可标记引物，也可标记ddNTP。 （2）反应的自动化

Sanger脱氧终止法。 （3）读片的自动化

激光探头直接读胶，实时阅读。 （4）分析自动化

电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。 （5）反应可在一个试管中进行

标记ddNTP时。

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是一种男性常见的致死性X性连锁隐性遗传病，此种病也是由于基因缺陷所致。人们设计多对引物，用于扩增6个易缺失区。经一次PCR同时扩增，然后电泳观察，当其它片段扩增成功，而某个片段无扩增时，说明这段外显子缺失。在家系中相关的可疑女性妊娠时，可有针对性地对男性胎儿进行DNA检测，达到产前诊断的目的。

第五节 DNA序列分析

一、双脱氧链终止法

Sanger等1977年发明。Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖 原理：

（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。 （2）脱氧核糖的连接是以3??5?磷酸二脂键。 （3）复制反应可以在体外进行。

（4）2?和3?双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。 二、Maxam-Gilbert化学修饰法

1977年，哈佛大学的A.M. Maxam和W. Gilbert发明。Walter Gilbert, 1980年Nobel Prize化学奖。

原理： 化学试剂处理

末端放射性标记的DNA片单链———————→特定的碱基中引入化学基团 ↓

长度只差一个核苷酸的DNA链混合物←——————DNA在被修饰的核苷酸位置断裂 ↓

凝胶电泳 ————→ 放射性自显影 ————→ 阅读碱基顺序 三、DNA杂交测序

90年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。 原理：

（1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形成完全的双链分子。杂交效率最高。 （2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。 （3）非互补碱基越多，杂交效率越差。 四、DNA自动化测序

1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。 技术要点： （1）非放射性标记

荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。 （2）不同的标记对象

既可标记引物，也可标记ddNTP。 （2）反应的自动化

Sanger脱氧终止法。 （3）读片的自动化

激光探头直接读胶，实时阅读。 （4）分析自动化

电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。 （5）反应可在一个试管中进行

标记ddNTP时。

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