生物工程毕业论文 - 图文

毕 业 论 文

题目：大鼠肝脏细胞表面和心肌细胞表面生长激

素受体的检测

学 院： 中国农业大学 专 业： 动物医学 年 级： 2013级 姓 名： 层 次： 专升本 学习形式： 函授 指导教师： 何丹

（2015 年 5 月） 中国农业大学教务处制

大鼠肝脏细胞表面和心肌细胞表面生长激素受体的检测

摘要: 生长激素具有促进生长，促进骨、软骨、肌肉和其他组织细胞的分裂增殖和蛋白质的合成，从而加速骨骼、肌肉和器官的生长发育。而生长激素要发挥作用往往通过靶细胞表面的受体来实现，通过生长激素与受体的结合来触发细胞的分裂信号以及蛋白质合成等一系列信号，从而实现细胞的基础代谢以及细胞的分裂增殖。肝细胞是一类复制较为活跃的细胞，根据实验得到的数据，肝脏在切去2/3后患者仍能存活并且剩余的肝脏在一段时间后能够长成完整的肝脏组织。而心肌细胞则基本不复制，当心肌细胞受损后剩余的心脏组织不能通过复制来弥补缺损的部位，只能通过干细胞分化为一般的纤维细胞来弥补。所以我们推断肝脏细胞表面的生长激素受体的含量要高于心肌细胞表面的含量，因此我们用免疫组化的方法来检测生长激素受体在这两种细胞表面的含量。

关键词：生长激素；生长发育；肝细胞；心肌细胞；免疫组化

Detection of Growth hormone Receptor on Liver cells and

Myocardial cells

Abstract: Growth hormone has a lot of functions such as promoting growth, promoting the synthesis of bone, muscle and other tissuecells and proteins, thus accelerating the growth and development of bone, muscle and organs. Thegrowth hormone play its role by binding to the growth hormone receptor to trigger cell division and protein synthesis signal and a series of signals, enabling cell proliferation and cell basal metabolism. Liver cells are a class of cells replicating more active, according to the experimental data obtained in the liver of patients,liver can survive evenit is cut two-third and the remaining 1/3 of the liver can grow into a complete liver tissue. Myocardial cells can not replicate, when it is destroyed,it can not be restored to its original state. The defect organization can be compensated by Fibroblasts. Accordingly, we concluded that the content of the liver cell surface receptors of growth hormone is more than the myocardial cell surface, so we used immunohistochemistry to detect growth hormone receptors on the cell surface of these two organs.

Key words : Growth hormone; development; liver cell; myocardialcell; immunohistochemistry

目 录

1 绪论 .............................................................. 1 1.1 生长激素 ........................................................ 1 1.2 免疫组化 ........................................................ 1 1.3 免疫组化的标本 .................................................. 2 1.4 所用的抗体 ...................................................... 3 1.5 常用染色方法 .................................................... 3 1.6 多克隆抗体 ...................................................... 3 2 石蜡切片制作实验 .................................................. 4 2.1 准备工作及试剂 .................................................. 4 2.2 石蜡切片的制作过程 .............................................. 6 3 免疫组化实验 ...................................................... 8 3.1 实验器材与试剂 .................................................. 8 3.2 实验步骤 ........................................................ 9 4 实验结果 ......................................................... 10 4.1 心肌细胞免疫组化结果 ........................................... 10 4.2 肝脏细胞免疫组化结果 ........................................... 10 5 结论与分析 ....................................................... 11 结论

12

致谢 ............................................................... 13 参考文献 ........................................................... 14

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1 绪论

1.1 生长激素

生长激素（human Growth Hormone,hGH）是腺垂体细胞分泌的蛋白质，是一种肽类激素。通过重组DNA技术制造的生长激素简称r-HGH。正常情况下，生长激素HGH呈脉冲式分泌，生长激素（hGH）的分泌受下丘脑产生的生长激素释放素(GHRH)和生长激素抑制激素（GHIH，也称生长抑素SS）的调节，还受性别、年龄和昼夜节律的影响，睡眠状态下分泌明显增加。生长激素的主要生理功能是促进神经组织以外的所有其他组织生长；促进机体合成代谢和蛋白质合成；促进脂肪分解；对胰岛素有拮抗作用；抑制葡萄糖利用而使血糖升高等作用。生长激素分子是由191个氨基酸残基构成，相对分子质量22124道尔顿。分子构造具有4个α螺旋使生长激素分子结构可以和其受体有良好结合。就蛋白质序列上来说，生长激素和泌乳激素以及绒毛膜促乳素在演化上同源。

生长激素发挥作用依赖于细胞表面的生长激素受体，生长激素与生长激素受体结合后启动一系列的DNA复制、蛋白质合成以及细胞分裂的信号，从而实现细胞的复制。生长激素自腺垂体分泌后随血液到达身体各个组织器官发挥作用。由于各个组织器官细胞的分裂活性不同，因此各个组织器官细胞表面的生长激素受体的含量也不同。本实验旨在通过免疫组化的方法来检测肝细胞和心肌细胞表面的生长激素受体的含量。

石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。

1.2 免疫组化

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免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。

这些常用免疫组织化学方法的原理如下： 1. 免疫荧光细胞化学技术

将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量。

2. 免疫酶细胞化学技术

是目前免疫组织化学研究中最常用的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究。

3. 免疫胶体金技术

就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究．由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究。

1.3 免疫组化的标本

实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切

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片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

1.4 所用的抗体

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

1.5 常用染色方法

根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。

1.6 多克隆抗体

抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。

抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一种抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。

抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。一个抗

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原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体，最终产生出抗体是浆细胞。只针对一个抗原决定簇起作用的浆细胞群就是一个纯系，纯系的英文为Clone，音译就是克隆。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一种抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。

多克隆抗体又简称多抗。与之相对应的叫单克隆抗体，简称单抗。本实验所使用的抗体便是多克隆抗体，此多克隆抗体来源于兔，能够特异性的与大鼠的生长激素的表面受体结合，因此通过免疫组化的方法便可以检测两种不同组织细胞表面的生长激素受体的含量。

2 石蜡切片制作实验

2.1 准备工作及试剂

2.1.1 洗涤实验所需器皿（玻璃器皿的清洗）

1) 用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷； 2) 将器皿在自来水下冲洗干净；

3) 将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干。

注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1-3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12-24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1-3次烘干备用。 2.1.2 硫酸洗液的配制

成分 强酸液 次强酸液 弱酸液 浓硫酸（ml） 1000 200 100 重铬酸钾（mg） 63 120 100 蒸馏水（ml） 200 200 1000 重铬酸钾 1200g 蒸馏水 2000ml

将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌。 2.1.3 载玻片与盖玻片的处理

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1) 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时 2) 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍

3) 95%-100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用 2.1.4 常用液体的配制

缓冲溶液： 磷酸盐缓冲液：

A液：0.1mol/L磷酸二氢钠 B液：0.1mol/L磷酸氢二钠

A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（比例为3：7时溶液PH≈7.0） 枸椽酸缓冲溶液： A液：0.1mol/L枸椽酸 B液：0.1mol/L枸椽酸钠

A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（比例为6.2：42.8时PH≈6.2） 2.1.5 固定剂

10%甲醛：福尔马林100ml加蒸馏水900ml。 2.1.6 染色液

Harris苏木精液 A液：

苏木精 1g 无水酒精 10ml B液：

铵矾或钾矾 20g 蒸馏水 200ml 氧化汞 0.5ml 冰醋酸 8ml

将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96 ml中加4 ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染

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色，保存期1-2个月。此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但利于配后即用。

伊红：

伊红 5-10g 70%-90%酒精 1000ml 冰醋酸 10滴 2.1.7 盐酸洒精

多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色。配法是在100ml的70％酒精内加0.5-1ml的浓盐酸(Hcl)。用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再作其他处理。

2.2 石蜡切片的制作过程

2.2.1 取材

大鼠摘眼球致死后，用锋利的刀剖开胸腔及腹腔，切取大鼠的心脏组织及肝脏组织，规格为 3～5mm×3～5mm×10～15mm。 2.2.2固定

采用Bouin氏固定液装瓶固定，固定液用量一般为组织块体积的10倍。 2.2.3冲洗

固定后的组织块置于水龙头下以自来水冲洗24小时，冲洗好的组织可存放在75%酒精内。 2.2.4脱水

脱水一般用如下几种方法：

1) 使用70%的乙醇浸泡组织2小时。 2) 使用80%的乙醇浸泡组织2小时。 3) 使用95%的乙醇浸泡组织2小时。 4) 使用95%的乙醇浸泡组织2小时。 5) 使用100%的乙醇浸泡组织1小时。 6) 使用100%的乙醇浸泡组织1小时。

7) 使用体积比为1:1的乙醇和二甲苯浸泡20-30分钟。

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8) 二甲苯浸泡30分钟。

9) 二甲苯浸泡30分钟。

2.2.5浸蜡包埋

浸蜡的全过程应在恒温设备中进行，将恒温箱调至58℃。然后将组织浸没于二甲苯与石蜡的混合液（体积比为1:1），时间为1小时，之后用石蜡浸泡1小时，然后再用新的石蜡浸泡1小时，浸蜡必须彻底，否则组织内残留透明剂会造成切片过程的困难和影响切片的质量。

准备包埋蜡：先用软蜡（50°-52°），再用硬蜡（60°-62°为好），所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的韧性，可以加一些蜂蜡。蜡的熔点应与组织的硬度相适应，包埋用过的石蜡可以反复使用。

准备包埋框：用金属作为包埋框。

点燃酒精灯：准备好镊子，应事先做好标记。

在金属框中倒入硬蜡，然后将组织放入石蜡中，可室温下冷却。

包埋框内的蜡逐渐凝结，若表面已经形成一层固体状，即可放入冷水中加速其凝固。

待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架，取出蜡块。 2.2.6切片

包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm的石蜡带。 2.2.7粘片

将组织石蜡带在36摄氏度的温水中展片，然后用经1%HCl溶液处理干净的载玻片捞片，组织带即可粘在载玻片上。 2.2.8烤片

将粘好的载玻片置于60℃左右的温箱中烤干，待2-3小时后，即可取下编号。

2.2.9 H-E染色

1) 用新鲜的二甲苯浸泡切片1小时。 2) 用新鲜的二甲苯浸泡切片1小时。 3) 100%酒精浸泡5分钟。 4) 100%酒精浸泡5分钟。

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5) 95%酒精浸泡5分钟。 6) 95%酒精浸泡5分钟。 7) 85%酒精浸泡5分钟。 8) 75%酒精浸泡5分钟。 9) 蒸馏水冲洗1分钟。

染色：

1) 苏木精染色5分钟。 2) 蒸馏水冲洗1分钟。 3) 盐酸酒精分化15秒。 4) 自来水洗15分钟。 5) 蒸馏水洗1小时。 6) 0.5%伊红染色1分钟。 7) 95%酒精浸泡5分钟。 8) 95%酒精浸泡5分钟。 9) 100%酒精浸泡5分钟。 10) 100%酒精浸泡5分钟。 11) 二甲苯浸泡5分钟。 12) 二甲苯浸泡5分钟

2.10 封片

中性树胶封片:取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡。

3 免疫组化实验

3.1 实验器材与试剂

1) 0.01M的磷酸盐缓冲液 2) 多聚赖氨酸 3) 梯度酒精 4) 二甲苯 5) 柠檬酸盐缓冲液

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6) 3%的双氧水

7) 用PBS溶解的含有1%的牛血清白蛋白的封闭液 8) 15%-30%的蔗糖溶液 9) EDTA或者Triton X-100

3.2 实验步骤

1) 将肝脏组织和心脏组织石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤30分钟。 2) 脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(5min×2次)

→95%乙醇(5min×2)→90%(5min)→80%乙醇(5min) 3) 蒸馏水冲洗1次时间为5min，PBS洗2次每次各5min。

4) 抗原修复：一般选用微波修复中火6min，共修复4次，效果不错，修复

后自然冷却30min左右。

5) 蒸馏水洗1次时间5min，PBS洗2次每次各5min。

6) 加3%双氧水孵育30min(室温)以消除内源性过氧化物酶的活性。 7) PBS洗3次每次各5min。

8) 加蓝色试剂（蓝色试剂为封闭液，成分为用PBS稀释的10%的山羊血清），

室温孵育30min，倾去，勿洗。

9) 滴加一抗（抗生长激素受体的抗体），37℃孵育2h。 10) PBS冲洗3次每次各5min。

11) 滴加黄色试剂(生物素标记的二抗溶液)，37℃孵育30min。 12) PBS洗3次各5min。

13) 滴加试剂C(辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素)，37℃孵育30min。 14) PBS洗3次各5min

15) DAB显色30s，自来水充分冲洗。 16) 苏木素复染2-3min，自来水充分冲洗。 17) 盐酸酒精分化2s，自来水充分冲洗。

18) 脱水、透明80%(5min)→95%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→

100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)。

19) 封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。

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4 实验结果

4.1 心肌细胞免疫组化结果

此结果分为两种，空白对照组和样品实验组，空白组心肌细胞在免疫组化实验中除了一抗不加之外，其余的实验步骤均与样品组相同，最后再用苏木素进行复染。样品实验组按照正常的免疫组化实验步骤进行，最后用苏木素进行复染。然后分别拍照。结果如下：

图1 大鼠心肌细胞免疫组化空白组照片大鼠心肌细胞免疫组化样品组照片

4.2 肝脏细胞免疫组化结果

此结果分为两种，空白对照组和样品实验组，空白组肝脏细胞在免疫组化实验中除了一抗不加之外，其余的实验步骤均与样品组相同，最后再用苏木素进行复染。样品实验组按照正常的免疫组化实验步骤进行，最后用苏木素进行复染。然后分别拍照。结果如下：

图2 大鼠肝脏细胞免疫组化空白组照片大鼠肝脏细胞免疫组化样品组照片

图中紫色的小颗粒为苏木素着色的细胞核，细胞的边界呈现的颜色为DAB染色的效果。棕红色的程度越深表明细胞表面的生长激素受体的含量越高。

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5 结论与分析

这四张图中，紫色的小颗粒代表细胞核，此为苏木素复染的颜色。借助苏木素的复染可以清楚的辨别细胞的数量、形态和结构，并且能够凸显细胞的边界。棕红色是DAB染色的效果，正常情况下细胞膜上如果有生长激素受体则会被染成棕红色，细胞质中出现的淡淡的棕红色是由于泛染造成的，并且不同种类的细胞泛染的程度不同。从实验结果来看，心肌细胞的细胞膜表面DAB着色很浅，与心肌细胞空白组相比较没有明显的变化，而肝细胞表面DAB着色很深，而且与肝脏细胞空白组相比变化较大，棕红色较深。综合上述4张图可以表明肝脏细胞表面的生长激素受体的含量要比心肌细胞表面的生长激素受体含量高。这也在一定程度上解释了为什么肝脏细胞的复制活性要强于心肌细胞的复制活性。

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结 论

生长激素具有促进生长，促进骨、软骨、肌肉和其他组织细胞的分裂增殖和蛋白质的合成，从而加速骨骼、肌肉和器官的生长发育。而生长激素要发挥作用往往通过靶细胞表面的受体来实现，通过生长激素与受体的结合来触发细胞的分裂信号以及蛋白质合成等一系列信号，从而实现细胞的基础代谢以及细胞的分裂增殖。肝细胞是一类复制较为活跃的细胞，根据实验得到的数据，肝脏在切去2/3后患者仍能存活并且剩余的肝脏在一段时间后能够长成完整的肝脏组织。而心肌细胞则基本不复制，当心肌细胞受损后剩余的心脏组织不能通过复制来弥补缺损的部位，只能通过干细胞分化为一般的纤维细胞来弥补。所以我们推断肝脏细胞表面的生长激素受体的含量要高于心肌细胞表面的含量，因此我们用免疫组化的方法来检测生长激素受体在这两种细胞表面的含量。

从实验结果来看，肝脏细胞表面的生长激素受体的含量要比心肌细胞表面的生长激素受体含量高。这也在一定程度上解释了为什么肝脏细胞的复制活性要强于心肌细胞的复制活性。

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致 谢

感谢我的导师何丹老师，她严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样；她循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。

本课题在选题及研究过程中得到何丹老师的悉心指导。何老师多次询问研究进程，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。王老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，虽历时三载，却给以终生受益无穷之道。对王老师的感激之情是无法用言语表达的。

在论文完成之际，我的心情万分激动。从论文的选题、资料的收集到论文的撰写编排整个过程中，我得到了许多的热情帮助。 我首先要感谢何丹老师，是她将我领入了信息安全的大门，并对我的研究提出了很多宝贵的意见，使我的研究工作有了目标和方向。

时光匆匆如流水，转眼便是大学毕业时节，春梦秋云，聚散真容易。离校日期已日趋临近，毕业论文的的完成也随之进入了尾声。从开始进入课题到论文的顺利完成，一直都离不开老师、同学、朋友给我热情的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!

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参 考 文 献

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