A组链球菌壁多糖的抗原性及交叉反应性研究

医药,医学,内科学

A组链球菌壁多糖的抗原性及交叉反应性研究
2010-10-06 彭朝权　余步云　陈国庆　梁慧

　　【摘　要】　目的　研究A组β溶血性链球菌壁多糖的最具抗原性的部分，及与牛心瓣膜糖蛋白的交叉反应性。方法　设计了新的提取和纯化链球菌壁多糖抗原的技术—分子筛凝胶层析法，以双向琼脂免疫扩散法鉴定出最具抗原性的部分，并测定这部分多糖与牛心瓣膜糖蛋白交叉反应性。结果　发现A组链球菌壁多糖由4部分组成，分子量分别为15 000、37 000、66 000、150 000。其中最具抗原性的部分是37 000，37 000的多糖部分和牛心瓣膜糖蛋白能同时与风湿性心瓣膜炎的血清发生免疫反应。而病人血清中的抗体被瓣膜糖蛋白吸附后，则不再与细菌多糖反应。结论　A组β溶血性链球菌壁多糖的最具抗原性的部分是37 000，该部分与牛心瓣膜糖蛋白呈现交叉反应性。
　　【关键词】　多糖类，细菌　　心脏瓣膜糖蛋白　　抗原性　　交叉反应　　色谱法，凝胶

Antigenity and cross-reactivity in group A streptococcal polysaccharide

PENG Chaoquan　YU Buyun　CHEN Guoqing,et al.
(Third Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510630)

　　【Abstract】　Objective　To study the portion with strongest antigenity of group A β-hemolytic streptococcal polysaccharide (PS),and a cross-reactivity between PS and heart valvular structural glycoprotein (VSGP) of bovine.Methods　Molecular sieve chromatography was adopted to extract and purify PS.Double immunodiffusion in agarose was used to distinguish the portion with strongest antigenity of PS,and detect a cross-reaction between this portion of PS and VSGP.Results　It was found that PS was composed of four portions,their molecular weights were about 15 000,37 000,66 000 and 150 000 respectively.The portion with strongest antigenity had a molecular weight of 37 000.Both this portion of PS and VSGP could react on the sera of patients with rheumatic valvulitis.After antibodies in the sera were adsorbed by VSGP,no reaction was found between PS and sera.Conclusion　The portion with strongest antigenity of PS has a molecular weight of 37 000.A cross-reactivity existed between PS of streptococci and VSGP of bovine.
　　【Key words】　Polysaccharides,bacterial　　Heart valvular structural glycoprotein　　Antigenity　　Cross reactions　　Chromatography,gel

　　风湿热的发病机制尚未
明了，但A组β溶血性链球菌咽喉部感染引发的自身免疫反应的现象已为国际上所公认〔1〕。因此只有深入研究链球菌和宿主的关系，才有可能进一步了解风湿热的发病机制，A组链球菌的细胞结构和细胞外产物均具有致风湿热的抗原性〔2〕，而细胞结构具有特异性意义。国外研究发现，A组链球菌胞壁多糖(PS)与牛

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心瓣膜糖蛋白之间存在交叉反应性〔3〕，且在风湿热和风心病患者血清中测得抗多糖抗体(ASP)〔4〕，因此人们对PS在风湿热和风心病的发病机制中的作用产生了兴趣。本研究设计了新的抗原提取和纯化技术，提取出PS最具抗原性的部分，以进一步探讨PS在瓣膜病中的意义，并为今后临床测定ASP提供更纯化的抗原。

1　材料与方法
1.1　PS的提取及生化分析
1.1.1　链球菌胞壁的提取〔5〕：本室储存的A组β溶血性链球菌菌种，从风湿热患者咽喉部分离，为成链状排列的革兰阳性球菌，过氧化氢酶反应(－)，A组凝集试验呈阳性反应(Oxoid诊断试剂)，对杆菌肽敏感。链球菌的解冻复苏，纯培养和增菌培养，收集细菌。超声破碎细菌，加胰蛋白酶和链霉蛋白酶各70 mg/L消化细菌蛋白质，并加入氯仿10 ml/L和甲苯30 ml/L，室温放置16小时，27 000×g离心30分钟，可看到四层：①轻微混浊的上清液；②氯仿-甲苯层；③灰黑色界面；④白色沉淀。留下白色沉淀即为细胞壁，加生理盐水洗涤。
1.1.2　PS的提取〔6〕：细胞壁溶液中加入亚硝酸钠和冰醋酸提取出多糖液，加入丙酮结晶析出PS。蒸馏水中透析三次。
1.1.3　PS的进一步纯化和生化分析：采用分子筛凝胶层析法，取葡聚糖凝胶G-100，溶胀，装柱，加样(包括标准分子量的多糖和上述提取的PS)，洗脱和收集(流速0.15 ml/min)，苯酚-硫酸法测定每管收集液中多糖的含量，并以分光光度计测出每管的吸光度(A)值，得出峰值管和相应的洗脱体积(Ve)。
1.2　PS最具抗原性部分的测定
　　采用双向琼脂免疫扩散法，上述分子筛凝胶层析法得出不同峰值管的PS置于琼脂板中央孔，周边6孔分置6份风湿性心瓣膜炎患者血清(6例患者均为过去确诊为风湿性心瓣膜病，男1例，女5例。本次就诊时为风湿热再发，临床上有发热、关节痛、心功能不全加重等表现，体检时并发现有新的瓣膜杂音或原有杂音性质的改变，和/或超声心动图明显的瓣膜炎征象，实验室指标异常，如：ESR、CRP、ASO增高等)。观察抗原抗体反应产生的白色沉淀线，判断出PS最具抗原性的部分，并收集之。
1.3　牛心瓣膜结构性糖蛋白(VSGP)的提取〔3〕
　　取牛心瓣膜组织切碎、匀浆加三氯醋酸和尿素提取出VSGP，透析。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定VSGP的含量和纯度。

1.4　PS和VSGP的免疫反应及吸附试验
　　采用双向琼脂免疫扩散法。
　　已纯化的PS最具抗原性部分和VSGP分置琼脂板中央孔，周边6孔分置6份不同风湿性心瓣膜炎患者血清，观察沉淀线。然后用VSGP吸附患者血清中的抗体，并以生理盐水对照。被吸附后的血清再与PS反应，以观察

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PS和VSGP是否存在交叉反应性。

2　结果
2.1　PS的组成部分：根据每个洗脱管测得的吸光度(A)值和相应的洗脱体积(Ve)，绘制出PS的洗脱曲线。根据标准曲线，PS的4个洗脱峰的分子量见表1。

表1　四个部分多糖的分子量


PS部分 洗脱体积
ml logM 分子量
PS1 57.5 2.181 150 000
PS2 70.5 1.819 　66 000
PS3 79.5 1.570 　37 000
PS4 94.5 1.175 　15 000

　　由表1可见，PS的分子量为15 000～150 000。
2.2　PS最具抗原性部分的测定：只有PS3(分子量37 000)可与患者血清抗体有反应(观察到白色沉淀线)。而其他三个部分均无沉淀线，可见PS3(37 000)最具抗原性。

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