检验方法验证的类型及基本要求

检验方法验证的类型及基本要求 （一） 概述

方法验证的目的是证明所采用的 方法达到相应的检测要求。由于分析性质的差异，本节中所讨论的验证内容不适用微生物分析方法。

验证的内容主要包括准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围、粗放性和耐用性9个方面。药典收载的方法一般比较成熟，需验证的内容与新开发的检验方法有很大差异，美国药典中明确规定其所收载的方法需做系统适应性试验，这即是美国药典对方法验证的要求。某一方法需到底须进行哪些项目的验证，应根据实际情况而定，并不是所一的方法都必需进行以上9个方面的验证试验。方法验证的范围，一般来说，可分为以下3种情况区别对待。 1、 对于直接引用有法定依据的方法，如药典标准和部颁标准，仅做系统适应性试验即可。但若将法定方法用于测定新药，或将某一品种的法定方法用于另一品种，就需进行系统的方法验证。

2、 对于已在一实验室验证过但需在另一个实验室使用的分析方法，可采用对照试验法。即取同一批样品，按此方法在两实验室分别进行检验，将结果进行比较（如用t检验法计算），判断是否有显著性差异。这特别适用于大公司（包括跨国公司）的情况。母公司完成了系统的方法验证工作，子公司实验室均可用结果对照的方法进行判断，节省了大量人力、物力。国外称这种做法为“技术转移”（Technical transfer）。 3、 其他分析方法可分为4种类型，验证要求可参见下表 不同分析方法的验证要求

验证项目 类 型

类型I 类型II 类型III 类型IV 定量测定 限度试验

准确度 要求 要求 * * —— 精密度 要求 要求 —— 要求 —— 专属性 要求 要求 要求 * 要求 检测限 —— —— 要求 * —— 定量限 —— 要求 —— * —— 线性 要求 要求 —— * —— 范围 要求 要求 * * ——

注：“——”表示不坐要求；“*”表示需根据实验特性决定是否坐要求。

类型I指用于测定原料药中主要成分或制剂中活性组分（包括防腐剂）的定量分析方法。 类型II指用于测定原料药中杂质或制剂中降解产物的分析方法，包括定量分析和限度试验。 类型III指用于测定性能特性（如溶解度、溶出度）的分析方法。 类型IV指鉴别试验。

（二） 验证的内容及基本要求 1. 准确度

准确度是指用该方法测定的结果与真实值接近的程度，一般用回收率表示。准确度的测定至少要区方法范围内地个浓度级别，每个浓度级别至少要测定3次。如某方法的范围是80%~120%，则应取80%、100%、120% 3个浓度，每个浓度测定3次，计算9个测定结果的回收率及相对标准偏差，回收率及相对标准偏差均应在规定限度之内。 （1） 原料药含量分析 可通过分析已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与另一验证的方法所得结果进行比较。 （2） 制剂中各组分的含量分析 按制剂处方取适量各组分进行有机物混合得有一混合物

进行测定，从而确定方法的准确度。若不可能得到处方中所有组分，可往制剂中加入已知量的被分析物进行测定，另一方法是把此方法的分析结果与另一已建立准确度的方法法的分析结果进行比较。 （3） 杂质的定量分析 往样品中加入已知量的的杂质进行测定；若不可能得到某种杂质或降解产物，可把此方法的分析结果与另一已验证的方法的结果进行比较来确定。杂质的量可用杂质与主药响应值的比值来表示。 2. 精密度

精密度制在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差（变异系数）表示。精密度又分为重复性、中间精密度、重现性3类。在相同条件下，由同一分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同实验室，不同时间由不同分析员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。 （1） 重复性 方法重复性的确定至少要取方法范围内的3个浓度级别，每个浓度级别至少要测定3次；或取100%的样品浓度至少测定6次。应自样品制备开始制备6份样品溶液，所得结果的相对标准偏差即为方法重复性。自动进样器重复性的测试，一般取同一样品溶液至少重复进样10次，其相对标准偏差不应大于1%。

（2） 中间精密度 中间精密度主要是为考察随机变动因素（如时间、人员、设备等）对精密度的影响，但不必对每个可能的影响因素进行单个的考察，可设计方案对其进行统一考察。色普分析方法由于受外界因素的影响较大，故一般需考察中间精密度，至少应在两种不同条件下进行考察（如不同时间，更换实验人员等）。

（3） 重现性 一般实验室不进行此项考察，只有当分析方法将被法定标准采用时，才进行重现性试验。建立药典分析方法时常需通过协同检查得出重现性的结果。如紫外分光光度法中吸收系数E1m的确定，需通过5个以上实验室分析，测定结果符合数理统计要求，才能采纳使用，收入标准。

准确度和精密度之间没有必然的联系。测量的精密度不能说明测量值与真实值的关系，精密度的测量值不一定是准确的，因为引起测量值远离真值的误差可能会对一系列的测量发生同样的影响，而不影响精密度，这即是系统误差的概念。 3. 专属性

专属性系指在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。

对于鉴别试验，应证明当样品中含有被分析物时呈正反应，当不含被分析物是呈（阴性）负反应。必要时，需证明与被分析物结构相似的或相近的物质均不呈正反应。 对于杂质的测定，一般取含一定杂质量的样品进行分析，证明此杂质测定其具有适宜的准确度和精密度即可。

对于含量分析，可通过加入一定量的杂质或赋形剂至样品中，通过分析证明结果不受影响。若杂志或降解产物为未知物，可将样品用强光照射、高温、高湿、酸碱水解或氧化的方法进行加速破坏，而后将此样品进行分析，将分析结果与另一个经验证的方法或法定方法所得结果进行比较。含量测定应比较两方法的分析结果，杂质测定若有色谱图，则应对比杂质峰的形状。

4. 检测限

检测限指样品中被测物能被检测出的最低量。 （1） 非仪器分析目视法 通过用已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限。 （2） 仪器分析方法 可以非仪器分析所用的目视法来确定检测限，也可用已知浓度的样

品与空白试验对照，以信噪比为2:1或3:1来确定检测限的最低水平。不论用哪种方法，均需制备相应检测限浓度的样品，反复测试来确定。 5. 定量限

定量限系指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解物用定量测定方法研究时，应确定定量限。 （1） 非仪器分析法 与检测限的非仪器分析方法所用方法相同，只是所得结果需符合一定的准确度和精密度要求。

（2） 仪器分析法 一般以信噪比为10:1时相应的浓度作为定量限的估计值，然后配置相应定量限浓度的样品，反复测试来进行确定。 6. 线性

线性指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程序。应在 规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液精密稀释或分别精密称样，制备一系列的供试品（至少5份不同浓度的供试品）进行测定。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数，进行线性回归，求出回归方程及相关系数。 7. 范围

范围指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。分析方法的范围应根据具体分析发以及对线性、准确度、精密度的结果和要求确定。无特殊要求时，通常可采用以下标准：

（1） 对于原料药和制剂的含量测试，范围以内感为测试浓度的80%~120%。 （2） 杂质测定，范围应为测试浓度的50% ~120%。

（3） 含量均匀度，范围应为测试浓度的70%~130%，根据某些剂型的特点（如气雾剂），此范围可适当放宽。

（4） 溶出度范围应为标准规定范围的±20%。如某一剂型的溶出度规定，1h后溶出度不得小于20%，24h后溶出度不得小于90%，则考察此剂型的溶出度应为0~110%。

（5） 若含量测定与杂质检查同时测定，用百分归有法，则线性范围应为杂质规定限度的-20%至含量限度的20%。 8. 粗放性

分析方法的粗放性（Ruggedness）指在不同实验条件下（如不同实验室、不同实验员、不同的实验员、不同批的试剂、不同的分析温度、不同时间等）对同一样品进行分析所得结果的重现性。此实验条件应仍在方法规定的限度内。

将在不同实验条件下所得结果的重现性与方法的重复新年感进行比较，来衡量分析方法的粗放性。 9. 耐用性

耐用性（Robustness）指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相、柱温、进样器和检测器温度等。如果测定条件要求比较苛刻，则应在方法中写明。

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