荧光探针的合成及自由基检测研究 - 图文

荧光探针的合成及自由基检测研究

荧光探针的合成及自由基检测研究

摘要

荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增，其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点，且荧光现象具有有利的时间表度。由于物质分子结构不同，其所吸收光的波长和发射的荧光波长也不同，利用这一特性可以定性鉴别物质。荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测。这种技术具备极高的灵敏性和极宽的动态时间响应范围的基本特点。羟基自由基(HO·)和超氧阴离子自由基(O2-·)是生物体内活性氧代谢产生的物质，当体内蓄积过量自由基时，它能损伤细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。因此，近些年来人们为了预防这类疾病的发生，自由基的研究已逐渐成为热点。而快速、灵敏和实用的自由基检测方法就显得十分重要。荧光探针检测自由基具有操作简便、响应迅速、选择性高等多种优点，我们将着重研究一类苯并噻唑结构荧光探针的合成及其对超氧阴离子自由基(O2-·)的检测。

关键词：荧光探针，苯并噻唑，超氧阴离子自由基，自由基检测

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荧光探针的合成及自由基检测研究

SYNTHESIS OF FLUORESCENT PROBES AND

DETECTION OF FREE RADICALS

ABSTRACT

Applications of fluorescence analysis method in biochemistry, medicine, industry and chemical research grow with each passing day, the reason is that fluorescence analysis method has the advantages of high sensitivity, and the flurescence phenomenon has a favorable time characterization. Since the molecular structure of different materials, the absorption wavelength and fluorescence wavelength of the emitted light is different, this feature can be characterized using differential substances. Fluorescent probe technology is a method using photophysical and photochemical properties for researching some systems’ physical and chemical process at the molecular level and detecting a particular structure and physical property of the special environment material. This technology not only can be used for steady-state nature of certain system, but also can monitore fast dynamic processes of a certain system such as the production and decay of a new species. This technology has the basic characteristics of a high degree of sensitivity and very wide dynamic range response time. Hydroxyl radical(HO-·)and superoxide anion radical(O2-·) is a substance produced in vivo metabolism of reactive oxygen species. When the body accumulates excess free radicals that will damage cells thereby causing chronic diseases and aging effects. Thus, in recent years people in order to prevent the occurrence of such diseases, the study of free radicals has become a hot spot. And fast, sensitive and practical method for the detection is very important. Using the fluorescent probes for the detection of free radicals is a simple, quick response, high selectivity variety of advantages. We will focus on the study of a class

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of synthetic fluorescent probes of benzothiazole structure and detection of superoxide anion radical.

Key words：Fluorescent probes, Benzothiazole, Superoxide anion radical, Detection of free radicals

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荧光探针的合成及自由基检测研究

目 录

1 绪论................................................................................................................... 1

1.1 引言 .............................................................................................................................. 1 1.2 荧光 .............................................................................................................................. 1

1.2.1 荧光的产生 ....................................................................................................... 1 1.2.2 荧光探针结构特点 ........................................................................................... 2 1.2.3 荧光探针传感机理 ........................................................................................... 3 1.2.4 常见荧光团 ....................................................................................................... 3 1.2.5 荧光探针的性能 ............................................................................................... 5 1.2.6 影响荧光探针性能的因素 ............................................................................... 5 1.2.7 荧光淬灭 ........................................................................................................... 5 1.3 自由基 .......................................................................................................................... 6

1.3.1 自由基的间接检测技术 ................................................................................... 6 1.3.2 自由基的直接检测技术 ................................................................................... 7 1.4 研究现状 ...................................................................................................................... 8

1.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)的检测 ........................................................................ 8 1.4.2 2-(2-吡啶)-苯并噻唑啉荧光探针 ..................................................................... 8 1.4.3 PF-1和PNF-1 ................................................................................................... 8 1.4.4 香草醛缩苯胺 ................................................................................................... 8 1.4.5 Hydroethidine类荧光探针 ................................................................................ 9 1.4.6 二(2,4-二硝基苯磺酰基)二氟荧光素 .............................................................. 9 1.5 选题背景和意义 ........................................................................................................ 10 1.6 课题研究内容 ............................................................................................................ 10

2 荧光探针的合成............................................................................................. 11

2.1 引言 ............................................................................................................................ 11 2.2 还原文献 .................................................................................................................... 11

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2.3 新探针合成 ................................................................................................................ 11

2.3.1 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 ........................................................................... 11 2.3.2 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 ................................................................................... 12 2.3.3 2-(苯)-苯并噻唑 .............................................................................................. 12 2.3.4 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 ................................................................................... 12 2.3.5 2-(4-硝基苯)-苯并噻唑 ................................................................................... 13 2.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 ...................................................................................... 13 2.4 合成小结 .................................................................................................................... 14 2.5 实验药品及规格 ........................................................................................................ 14 2.6 实验仪器及型号 ........................................................................................................ 15

3 实验结果与讨论............................................................................................. 16

3.1 引言 ............................................................................................................................ 16 3.2 荧光性能测试 ............................................................................................................ 16

3.2.1 荧光性能待测溶液配制 ................................................................................. 16 3.2.2 荧光性能测试结果 ......................................................................................... 16 3.2.3 测试谱图 ......................................................................................................... 17 3.3 1H NMR数据 ............................................................................................................. 21

3.3.1 2-(2-吡啶)-苯并噻唑 ....................................................................................... 21 3.3.2 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 ........................................................................... 22 3.3.3 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 ................................................................................... 23 3.3.4 2-(苯)-苯并噻唑 .............................................................................................. 24 3.3.5 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 ................................................................................... 25 3.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 ...................................................................................... 25 3.3.7 2-(2-噻吩)-苯并噻唑 ....................................................................................... 26 3.4 反应条件控制及处理 ................................................................................................ 27 3.5 结论与展望 ................................................................................................................ 27

参考文献............................................................................................................... 28 致谢....................................................................................................................... 30 译文及原文........................................................................................................... 31

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1 绪论

1.1 引言

荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增, 其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点, 且荧光现象具有有利的时间表度。 当物质吸收紫外光和可见光后, 它的电子能级跃迁至激发态, 然后将这一部分能量释放出来, 接着返回基态。 由于物质分子结构不同, 所吸收光的波长和发射的荧光波长也不同。利用这一特性, 可以定性鉴别物质。研究分子的荧光光谱可为研究分子微观结构、分子的构象特点及变化情况提供帮助。

1.2 荧光

1.2.1 荧光的产生

振动弛豫内转换S2振动弛豫振动弛豫系间窜跃S1T2T1内转换振动弛豫光吸收光吸收发射荧光发射磷光振动弛豫S0

图1-1 荧光的产生

如图1-1所示：当高能量光线照射荧光物质时，其分子或原子中的电子将吸收能量，由基态被激发到激发态。激发态有两种电子态：一种为激发单线态(S)，另一种为激发三线态(T)。电子处于高能级时不稳定，又会放出能量，从高能级跃迁回到低能级。当电子从最低激发单线态S1回到单线基态S0时会发射出光子，

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我们称之为荧光；当电子从最低激发单线态S1系间窜越到最低激发三线态T1，再从T1回到单线基态S0时发射出光子，我们称之为磷光[1]。

电子从基态跃迁到激发态吸收的能量要高于荧光发射的能量，则荧光探针的发射波长总是大于其激发波长,两者之差值称为斯托克斯(Stokes)位移。荧光分析就是利用Stokes位移将荧光染料的激发光与发射光分离开来,只检测发射光,从而提高检测的分辨率和灵敏度。

荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。这种技术的基本特点是具备高度灵敏性和极宽的动态时间响应范围，正是基于这种特点，该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测。 1.2.2 荧光探针结构特点

只有含荧光基团的物质才有可能发射荧光。入射光照射时会产生荧光，而入射光一旦停止照射，荧光也几乎同时消失。荧光探针的激发光谱、发射光谱和荧光强度都与荧光基团的结构有密切的关系。

其结构有以下特点：(1)含有共轭双键体系, 通常增加分子内π电子共轭体系的长度可提高荧光效率并使荧光红移; (2) 具有芳环或杂环。芳环越大, 其荧光峰越向长波长方向移动, 荧光强度往往也越强。苯、萘仅在紫外区有荧光, 随着芳环的增加, 它们的荧光光谱可以进入可见光区; (3)具有刚性结构和平面结构的π电子共轭体系。闭环可以增加分子共平面性和刚性，从而使荧光增强。许多本身无荧光或者荧光很弱的化合物与金属鳌合产生具有环状结构的鳌合物时，会显示较强荧光。如图1-2所示，汞离子络合导致硫代罗丹明B酰肼开环荧光增强

[2]

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图1-2 硫代罗丹明B与汞离子络合

1.2.3 荧光探针传感机理

荧光分子探针是将至少两部分构件即受体结合部位和信号响应亚单位结合在一起的分子染料。化学传感器的一个重要特征就是能够将受体对被分析物的结合作出信号响应。大多数的被分析物自身并不具备信号发射团，因此设计一个荧光探针，就必须向体系中引入荧光团。最普遍也是最早使用的方法是将荧光团与受体共价连结在一起。除了上述共价结合发色团的方式以外，另一种方法是基于指示剂和被分析物对受体结合能力的不同。这种方法荧光团和受体并非共价结合，而是形成了分子自组装体。

信号单元识别单元被检物质+光照无荧光光照荧光

图1-3 荧光探针和荧光传感 1.2.4 常见荧光团

荧光团是荧光分子探针的最基本组成部分, 作用是将分子识别信息表达为荧光信号。荧光分子探针中的荧光团通过给出荧光强度的增强和减弱, 以及荧光峰值波长的位移等信息来反映微观世界的分子识别作用[3]。

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以蒽、芘为主要代表的稠环芳烃类荧光团一般都是具有强而稳定的荧光，在荧光分子探针研究领域里, 它们作为结构最简单的荧光团经常用于基础理论的研究。萘酰亚胺类化合物作为一种荧光团母核, 是很重要的有机功能染料中间体。此外，以吲哚环和苯并噻唑、苯并噁唑或苯并吲哚等含氮杂环为骨架的碳菁类荧光团近年来研究比较活跃。

ONOSHNNHHNNNSN

N

图1-4 蒽的衍生物，萘酰亚胺衍生物，苯并噻唑衍生物

香豆素、荧光素、罗丹明类分子等因具有较高的量子产率也常被用于制备荧光底物[4] 。香豆素母体结构无色且无荧光，取代后的香豆素衍生物可以产生绿色荧光。荧光素的量子产率高, 最大吸收/发射在492 /525 nm,大量的荧光素衍生物被合成并用作荧光检测试剂。但荧光素衍生物也有如敏感性偏低、共轭体系不稳定、受环境因素影响较大等缺点。罗丹明类最大吸收/发射在496 /520 nm, 与荧光素类衍生物相比具有更强的光稳定性, 更高的荧光量子产率以及更低的pH 敏感性。由于目前没有合适的替代品，荧光素和罗丹明在生物医学领域内仍然是应用最为广泛的荧光团。

COOHCOOHNON+OO HOOO

图1-5 香豆素，荧光素，罗丹明B

卟啉和酞菁容易和不同金属离子反应形成多种配合物，具有较高的荧光量子

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产率和较大的Stokes位移。氟硼类荧光染料(BODIPY)类也具有结构稳定及量子产率高的特点。 1.2.5 荧光探针的性能 (1)Stokes位移

Stokes位移越大荧光探针检测越灵敏。 (2)荧光强度

荧光探针发射荧光的光量子数目为荧光强度，决定了荧光探针检测的灵敏度。

(3)荧光寿命

荧光寿命指分子在激发态的平均时间，即激发态寿命。不同性质的被测物可应用荧光寿命不同的荧光探针采取不同方法检测。 1.2.6 影响荧光探针性能的因素

合理的分子结构是影响荧光探针性能的首要因素。选择结构恰当的荧光探针检测不同结构的被测物，才能发挥荧光探针检测简便而迅速的优点。

刚性结构可增加荧光强度,若π电子共轭体系分子是刚性平面结构,分子则不易发生变形,而保持大的平面结构也就保持了大的π电子共轭度。同时荧光效率随着π电子共轭程度和分子平面度的增加而增大,其所发生的荧光光谱将向长波方向移动[5]。

荧光探针的取代基对其性能的影响非常大。推电子基团可以使荧光分子共轭体系增大，其荧光一般都会增强，如-OH、-OR、-NHR、-NR等。而吸电子基团的一般会使荧光减弱，如-C=O、-CHO、-COR、-COOH、-NO2、-N=N-等。卤素的取代称为重原子的取代，可以使荧光减弱而磷光增强。

此外还有一些环境因素也会对检测产生影响，如探针浓度、溶剂性质、pH值、温度等。 1.2.7 荧光淬灭

通过各种原因使荧光探针的荧光强度降低，导致荧光探针的浓度与荧光强度不呈线性关系的现象称为荧光淬灭。引起荧光淬灭的物质称为淬灭剂。在使用荧光探针进行检测时，也应密切关注是否有淬灭剂存在及其对检测的影响。

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3 实验结果与讨论

3.1 引言

我们选取具有代表性的荧光探针分子团2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑、2-(4-氰基苯)-苯并噻唑、2-苯-苯并噻唑作为代表来研究这一系列化合物的荧光性能。我们将分别测量这三种探针在几种不同溶剂中的紫外吸光度和荧光强度并计算其荧光量子产率。并且我们将对所有这些产物的1H NMR进行分析。

3.2 荧光性能测试

3.2.1 荧光性能待测溶液配制 (1)荧光探针溶液

称取0.0037g 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑溶于1.45ml三氯甲烷中得到10-2mol/l的原始溶液。再分别取50μl置于6根10ml比色管中，使用电吹风吹干三氯甲烷后分别使用正己烷，乙醚，乙酸乙酯，四氢呋喃，乙腈，乙醇稀释至10ml。溶液浓度为5×10-5mol/l。

使用同样方法配制2-(4-氰基苯)-苯并噻唑、2-(苯)-苯并噻唑溶液。称取0.0020g 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑溶于0.85ml三氯甲烷中得到原始溶液，称取0.0030g 2-(苯)-苯并噻唑溶液溶于1.42ml三氯甲烷中得到原始溶液，再分别稀释成6种不同溶剂的待测溶液。

(2)荧光素钠溶液

使用荧光素溶液作为标准物来测量探针的荧光量子产率。称取0.0060g荧光素溶于10ml 0.1mol/l的氢氧化钠溶液中得到1.8×10-3mol/l的荧光素钠原始溶液，再抽取20μl至3ml氢氧化钠溶液中测量紫外吸收和荧光强度，该溶液实际浓度为1.2×10-5mol/l。 3.2.2 荧光性能测试结果

使用公式(1)计算荧光量子产率式中, Yu 和Ys 分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率, Fu 和Fs 分别表示待测物质和参比物质的积分荧光强度,Au和As 分别表示待测物质和参比物质对该波长激发光的吸光度。

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Yu = Ys ×(Fu/Fs) ×(As/Au) (1)

测试结果数据整理为表3-1，其中1，2，3分别表示2-(苯)-苯并噻唑，2-(4-氰基苯)-苯并噻唑，2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑；A～F分别表示正己烷，乙醚，乙酸乙酯，四氢呋喃，乙腈，乙醇。

表3-1 荧光性能测试结果

探针 A B C D E F

1 295 295 297 297 295 297 最大吸收波长 2 319 317 317 319 313 317 (nm) 3 346 349 352 355 356 357

1 350 354 356 355 362 360 荧光波长 2 367 385 387 386 399 392 (nm) 3 393 400 409 411 425 427

1 0.029 0.026 0.042 0.038 0.100 0.083 量子产率 2 0.154 0.127 0.139 0.130 0.174 0.344 3 0.209 0.237 0.267 0.207 0.345 0.378

3.2.3 测试谱图 (1)荧光波长

26242220181614121086420-2300350400450Fluorescence Intensity Hex DEE AAE THF ACN EtOH500Wavelength, nm

图3-1 2-(苯)-苯并噻唑荧光波长

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403530Fluorescence Intensity Hex DEE AAE THF ACN EtOH2520151050300350400450500Wavelength, nm

图3-2 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑荧光波长

800700600Fluorescence Intensity5004003002001000350400450500Hex DEE AAE THF ACN EtOH550Wavelength, nm

图3-3 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑荧光波长

测试结果表明2-(苯)-苯并噻唑荧光波长基本不受溶剂极性影响，而2-(4-氰基苯)-苯并噻唑和2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑荧光波长会随溶剂极性增大而波长变长。同时当溶剂极性增大时大探针荧光强度会增强。

(2)紫外吸光度

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Hex DEE AAE THF ACN EtOHAbs0300nm

图3-4 2-(苯)-苯并噻唑吸光度

2 Hex DEE AAE THF ACN EtOHAbs0300nm

图3-5 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑吸光度

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Hex DEE AAE THF ACN EtOH2Abs0300400nm

图3-6 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑吸光度

测试结果表明这三种荧光探针最大吸收波长在不同极性溶剂中基本不变，而吸光度会随溶剂极性变化略有变化。这一类探针在乙腈及乙醇中波长相对较长且荧光强度较强，量子产率较高。

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荧光探针的合成及自由基检测研究 3.3 1H NMR数据 3.3.1 2-(2-吡啶)-苯并噻唑

图3-7 2-(2-吡啶)-苯并噻唑啉

如图4-1所示，1H NMR (400MHz, DMSO-d6):8.53(d, J=4, 1H, pyridine-H), 7.84(t, J=4, 1H, pyridine-H), 7.55(d, J=8, 1H, pyridine-H), 7.33(d, J=8, 1H, pyridine-H), 7.11(s, 1H, C-H), 6.99(d, j=8, 1H, benzothiazole-H), 6.90(t, J=8, 1H, benzothiazole-H), 6.67(d, J=8, 1H, benzothiazole-H), 6.61(t, J=8, 1H, benzothiazole-H), 6.39(d, J=4, 1H, N-H).

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3.3.2 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑

图3-8 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑

如图4-2所示，1H NMR(400MHz CDCl3):7.98(t, J=8, 3H, 2×benzene-H&benzothiazole-H), 7.84(d, 1H, J=8，benzothiazole-H) 7.46(t, J=8, 1H, benzothiazole-H), 7.31(t, J=8, 1H, benzothiazole-H), 6.75(d, J=8, 2H, 2×benzene-H), 3.06,(s, 6H, 2×CH3).

由图4-3可看出两种产物约1:1混合，未氧化探针N原子未形成共轭双键，N-H化学位移为6.39。

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图3-9 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑及未氧化探针

3.3.3 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑

图3-10 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑

如图4-4所示，1H NMR(400MHz CDCl3):8.24(d, J=8, 2H, 2×benzene-H),

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8.15(d, 1H, J=8, benzothiazole-H), 7.97(d, J=8, 1H, benzothiazole-H), 7.82(d, J=12, 2×benzene-H), 7.58(t, J=8, 1H, benzothiazole-H), 7.48(t, J=8, 1H, benzothiazole-H). 3.3.4 2-(苯)-苯并噻唑

图3-11 2-(苯)-苯并噻唑

如图4-5所示，1H NMR(400MHz CDCl3):8.15(d, J=8, 3H, benzothiazole –H&2×benzene-H), 7.94(d, J=8, 1H, benzothiazole -H), 7.54(s, 4H, 2× benzothiazole –H&2benzene-H), 7.43(t, 1H, J=8, benzene-H).

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3.3.5 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑

图3-12 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑

如图4-6所示，1H NMR(400MHz CDCl3):8.07(d, J=8, 1H, benzothiazole-H), 7.99(d, J=8, 2H, benzothizole-H&benzene-H), 7.89(d, J=8, 1H, benzene-H), 7.50(t, J=4, 1H, benzothiazole-H), 7.37(t, J=4, 1H, benzothizole-H), 7.30(d, J=8, 2H, 2×benzene-H), 2.43(s, 3H, CH3). 3.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑

如图4-7所示，1H NMR(400MHz CDCl3):8.03(d, J=8, 1H, benzothiazole-H), 7.94(d, J=8, 1H, benzothiazole-H), 7.74(d, J=8, 1H, benzene-H), 7.54(t, J=8, 1H, benzothiazole-H), 7.39~7.46(m, 2H, benzothiazole-H&benzene-H), 7.14(d, J=8, 1H, benzene-H), 6.99(t, J=8, 1H, benzene-H), 1.28(s, 1H, O-H).

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图3-13 2-(水杨醛)-苯并噻唑

3.3.7 2-(2-噻吩)-苯并噻唑

图3-14 2-(2-噻吩)-苯并噻唑及未氧化产物

此化合物与图4-3类似，两种产物按一定比例混合。

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荧光探针的合成及自由基检测研究 3.4 反应条件控制及处理 (1)反应溶液及温度选择

根据不同原料合成的探针反应所需温度不同，可根据不同原料性质选择不同沸点的溶剂，当溶剂沸点较低时反应后更加易于分离。

并且溶剂极性不同对反应速率快慢也有影响，实验结果表明通常溶剂极性越高反应速率越快。

(2)反应时间与产物处理

该反应通常可在1～2h内反应完全。反应结束后可通过蒸出少量溶剂后自发沉淀或结晶，或者可通过完全蒸干溶剂后重新溶解结晶或过柱分离。

3.5 结论与展望

我们所新合成的这一类化合物大多并未有文献报道，我们通过一系列的实验，控制不同的反应条件选择出适合不同原料所合成探针的不同方法，并且对这一系列化合物的紫外吸光度、荧光波长进行测量并计算出量子产率。但该探针由于无法避免被空气氧化，暂时难以应用为检测超氧阴离子的荧光探针。

取代基可以使该类物质的最大波长变长并且荧光强度增强。在对多种探针观察比较中发现2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑荧光强度最强，即便是浓度非常低的溶液仍然具有较强紫色荧光，这一特点在其他文献中并没有记载。该化合物虽然暂时不能应用于超氧阴离子自由基检测，但也许可以应用于染料领域或者其他方面。

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参考文献

[1]张宝明,徐晶晶,董爱娟. 荧光共轭聚合物的荧光机理研究[J]. 科技视界,2012,28:82-84.

[2]Zheng, H., Qian, Z. H., Xu, L., Yuan, F. F., Lan, L. D., & Xu, J. G. (2006). Switching the recognition preference of rhodamine B spirolactam by replacing one atom: design of rhodamine B thiohydrazide for recognition of Hg (II) in aqueous solution. Org.Lett. 2006, 8(5), 859-861.

[3]顾峥. 几种新型荧光分子探针的合成及性能研究[D]. 湖南大学, 2010. [4]陈蓁蓁, 张宁, 张文申, 唐波. 蛋白质分子荧光探针研究及其应用新进展[J]. 分析化学, 2006, 09: 1341-1347.

[5]刘璇. 细胞荧光探针的合成与应用[D]. 湖南师范大学,2012.

[6]郑国灿,肖尚友,穆小静,夏之宁. 自由基检测技术进展[J]. 广州化学,2006,03: 37-44.

[7]张昊,任发政. 羟基和超氧自由基的检测研究进展[J]. 光谱学与光谱分析,2009,04: 1093-1099.

[8]严建伟,阮积惠. 生物体系中自由基检测方法评述[J]. 杭州大学学报(自然科学版),1998,03: 79-84.

[9]赵宝洪,高洪,屈长林,陈超. 自由基检测方法[J]. 动物医学进展,2007,07:107-110.

[10]Tang B, Zhang L, Zhang L. Study and application of flow injection spectrofluorimetry with a fluorescent probe of 2-(2-pyridil)-benzothiazoline for superoxide anion radicals[J]. Anal.Biochem. 2004, 326(2): 176-182.

[11]Xu, K. H., Liu, X., Tang, B., Yang, G. W., Yang, Y., An, L. G. Design of a phosphinate-basedfluorescent probe for superoxide detection in mouse peritoneal macrophages[J]. Chem. Eur.J., 2007, 13(5):1411-1416.

[12]蒲法章. 荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究[J]. 分析科学学报, 2009,

28

荧光探针的合成及自由基检测研究

25(5):575-578.

[13]章舒祺, 魏永锋. 检测活性氧的荧光探针新进展[J]. 光谱实验室, 2009 (4): 794-802.

[14] Maeda, H.; Yamamoto, K.; Nomura, Y.; Kohno, I.; Hafsi, L.; Ueda, N.; Yoshida, S.; Fukuda, M.; Fukuyasu, Y.; Yamauchi, Y.; Itoh, N. A Design of Fluorescent Probes for Superoxide Based on a Nonredox Mechanism [J]. J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 68-69.

[15]李晓瑞. 超氧阴离子自由基荧光探针的研究进展[J]. 山东化工,2011,10:45-48. [16]Oliver G L, Dann J R, Gates Jr J W. Preparation of Thiazolidines and Related Compounds: Lactams and Lactamidines[J]. J. Am. Chem. Soc, 1958, 80(3): 702-707. [17] Wang J, Zhang X Z, Chen S Y, et al. Iron-catalyzed arylation or aroylation of benzothiazoles with benzylic alcohols and aryl ketones[J]. Tetrahedron, 2014, 70(2): 245-250.

[18]EMERSON W S, PATRICK Jr T M. The preparation of 2-thiophenealdehyde and some of its derivatives[J]. J. Org. Chem, 1949, 14(5): 790-797.

[19] Shelkar R, Sarode S, Nagarkar J. Nano ceria catalyzed synthesis of substituted benzimidazole, benzothiazole, and benzoxazole in aqueous media[J]. Tetrahedron Lett, 2013, 54(51): 6986-6990.

[20] 李鹏宇, 李江胜, 刘卫东, 等. 苯并噻唑类杂环合成最新进展[J]. 精细化工中间体, 2011, 41(4): 8-11.

[21] 王欢,高奕红,张萍. 荧光传感器及其分子识别作用的研究进展[J]. 应用化工,2014,04:718-723+728.

[22]李蒙蒙. 吡唑啉荧光探针的合成, 结构表征及性质研究[D]. 山东大学, 2013. [24] Dongjian Z H U, Hua J. 基于花菁的硫醇近红外比率荧光探针[J]. 影像科学与光化学, 32(1): 106-112.

[25] 张泱泱,申剑冰,姚成. 一种新型亚酞菁荧光探针的合成、表征及动物活体成像研究[J]. 生物加工过程,2014,02:70-76.

[26]赵玉玲, 张成成, 俞天智, 等. 一锅反应合成两种含苯并噻唑基团荧光材料[J]. 化学通报, 2013, 76(4): 369-374.

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荧光探针的合成及自由基检测研究

致谢

本论文是在张煊副教授的认真指导下完成的。在跨越两个学期的实验过程中，张老师一直在用严谨的治学态度感染着我，指导我完成各项试验，解开各种谜团。而当我在学习上遇到困难时，张老师也会对我伸出援手帮我渡过难关。老师对我的教诲将永远铭记于心。在此谨对张老师表示崇高的敬意和诚挚的感谢，并祝愿老师日后研究一往无前，顺利攻克完成各项课题。

感谢课题组的司芳，李旭东，陈辉标，胡锦文，朱迎迎，张蓓，刘静云和马丽霞等各位师兄师姐对我的无私帮助和指导，以及刘东岳和张弛同学在实验室的同甘共苦，使本可能枯燥的实验室生活充满乐趣。感谢许士新，戚恺宁，李强，谈晓强和林立广同学在我大学生活中对我提供的各种帮助和陪伴。

感谢我的家人将我抚养成人，远在千里之外支持我读完大学，没有你们就没有我。

尹铁乔 2014/5/28

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荧光探针的合成及自由基检测研究

译文及原文

2-(2-吡啶)-苯并噻唑荧光探针对超氧阴离子自由基的流动

注射荧光光谱测定的研究和应用

摘要

这篇论文展示了一种用新型的命名为H.Py.Bzt（2-(2-吡啶)-苯并噻唑）的荧光探针检测超氧化合物歧化酶(SOD)活性的全自动化的荧光光谱检测法(流动注射荧光检测法)。这种荧光探针可以在室内合成，并且同时充分具有元素分析和红外光谱、质谱核磁共振的特点。它可以专门鉴别并捕获O2-?并且被其氧化成一种强力的荧光产物。以此反应为基础，这种流动注射荧光光谱检测法被设计并成功用于检测SOD的活性。我们所推荐的这种方法在氧化物反应进程上有更好的识别性，因为这种探针只能被除H2O2以外的O2-·氧化。作为一种简单，迅速，精确，敏感并且全自动化的技术，它在对葱、蒜、洋葱中SOD活性的测量中取得令人满意的结果。

关键词：超氧阴离子自由基(O2-·),2-(2-吡啶)-苯并噻唑,荧光探针,流动注射荧光光谱法,SOD

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荧光探针的合成及自由基检测研究

各式各样的游离自由基在生物体新陈代谢期间产生，例如超氧阴离子自由基(O2-·)，羟基自由基(HO·)，ROO·，这是典型的3种自由基[1]。游离自由基，尤其是O2-·，在过去几年内，O2-·被认为在心肌缺血和再灌注损伤中广泛存在[2]。过多的O2-·，即有毒性反应活性的氧，对光合色素和薄膜有巨大伤害，并对整个光合系统有进一步的伤害。而且，O2可以转化为更大毒性的自由基，如HO·，H2O2，

1

O2等[3]，这会伤害光合作用薄膜和许多生物分子。此外，O2-·会造成冠心病，动

脉硬化，肿瘤等疾病[4-6]。出于这些原因，从生物体中排除O2-·对阻止疾病和衰老有重大意义。

众所周知超氧歧化酶(SOD)1是O2-·的清除剂和生物体中O2-·数量的重要指示剂。因此建立一种精确，迅速并敏锐的检测SOD活性的方法具有重大的应用价值。目前，检测SOD活性的常用方法是焦棓酸的自身氧化[20]和次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(HX-XO)-细胞色素的还原[7]，这两种都属于分光光度法。近几年来，一些新的方法如化学发光法(CL)[8]，电子自旋共振法(ESR)[9,10]，高效液相色谱法(HPLC)[11]，极谱氧电极法[12]和免疫法已发展成熟。然而，所有这些方法都有所不足；例如，ESR的仪器需求非常昂贵，HPLC的操作很复杂，CL的选择性匮乏，分光光度法敏感度很低。比较之前提到的几种方法，荧光光度法更加简便，敏锐和更具选择性。然而，至今只有为数不多的几篇使用荧光光度法检测SOD活性的报告。流动注射检测(FIA)方法具有更好的重现性和更为迅速的验定速度，这可以实现实时，在线和全自动化样品验定。所以FIA和荧光光谱法结合同时具有荧光法的特点和流动注射检测的优势。现在，FIA-荧光光谱法[14,15]和FIA-化学发光法[16,17]已经在自由基检测中获得应用，但应用于检定自由基和SOD活性的FIA-荧光检测法还没有报道。

在这篇文章中，一种命名为2-(2-吡啶)-苯并噻唑(H.Py.Bzt)，可在室内合成的新型荧光探针，通过流动注射法应用于O2-·鉴别和SOD活性检测。在实验中，我们发现O2-·可以氧化H.PY.Bzt形成一种强效的荧光探针，并且H2O2不会对此有影响。此外，同等数量的氢氧根自由基(HO)也同样对检测O2-·无影响，因为在它反应系统发生变化时的测量波长中不会产生荧光强度。所以这种探针有更好的选择性。此外，我们所推荐的这种方法在我们所处理的55种样品中体现出自动化和迅速的特点。它在应用于葱，大蒜，洋葱中SOD活性检测中获得成功。

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荧光探针的合成及自由基检测研究

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

荧光的光谱和强度使用一台装有氙灯和18微升石英贯通池(Varian,澳大利亚)的荧光分光光度计测量。流动注射器配有一个八通道同时开动的注射阀和同时使用的两台蠕动泵(FIA-3100，北京万托，中国)。所有pH的测量使用一台pH-3c数字pH测量仪(上海雷茨装置工程，中国)。红外光谱使用一台PE-983红外光谱仪(KBr压片，Perkin-Elmer，Norwalk，CT，USA)。元素分析使用PE-240CHN分析仪进行。HNMR使用FX-90Q核磁共振仪记录(溶剂使用DMSO，JEOL，日本)。吸光度使用一台UV-265分光光度计(日本)测量。 1.1.2 试剂

5.00×103molL荧光探针(内部合成)以适当2-(2-吡啶)-苯并噻唑溶解于乙醇中备用。Na2S2O4溶液(1.20×103molL-1)以适量Na2S2O2溶于0.10molLNaOH溶液中备用。储备好的SOD溶液(1.00×102gL-1)溶于水中备用(放在冰箱中)。使用KMnO4标定过的H2O2溶液(1.20×103molL)。下列溶液在二次蒸馏水中准备:邻苯三酚，3.00×103molL；Na2B2O7-NaOH(pH9.20)，0.10molL-1)缓冲溶液，Tris-HCl(pH8.20)，0.10molL-1)缓冲溶液。Fluka公司的2-吡啶甲醛和邻氨基苯硫醇。所有化学药品为分析纯级别，使用双蒸馏水。 1.1.3 H.Py.Bzt的合成及性能

2-(2-吡啶)-苯并噻唑以适量2-吡啶甲醛(0.03mol)和邻氨基苯硫醇以1：1摩尔比缩合。合成反应图在图1中展示。混合溶液需要加热回流约2-3h。之后减压蒸馏除去溶剂即可出现黄色粗品，然后使用甲苯重结晶并真空干燥。[熔点：80-81.5C。H NMR(90MHz,DMSO-d6,25C,TMS):δ 6.3 (s, 1H, C–H), 4.3 (s, 1H,N–H), 7.2–8.5(4H, pyridine-H), 6.6–7.2 (4H, benzol-H)。 IR (KBr压片): ν(cm-1) 3250 (N–H), 3105 (C–H), 1595 (C=C)。元素分析计算值 C12H10N2S (实测值): C67.24 (67.31), H 4.70 (4.81), N 13.70 (13.60).] 这些数据与 [18,19]中的报告值相同。

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荧光探针的合成及自由基检测研究

表1 流动注射操作规程

过程a 阀位置 时间(s) 泵(A)转速(min-1) 泵(B)转速(min-1) 1 F 15 30 30 2 I 50 0 30

a

五次循环

1.1.5 流动注射合成装配

流动注射已经通过初步测试得到优化，之所以选择图2中的装配法是因为这种配置设计是可以同时满足峰高和峰型的最好折衷办法。使用这种设计时，荧光探针在达到一个称为反向注射值时注入。因为Na2S2O4溶液要每2h配制一次并且探针需要保持在一个稳定的状态，反向注射可以节省荧光探针并且峰型比常规注射更好。操作计划在表1中展示。

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1.2 实验程序

1.2.1 O2-·和SOD活性测定。

探针试剂(R)通过蠕动泵P(A)和P(B)注入载流蒸汽(C)中与用来制造O2-.的碱性Na2S2O4(S1)混合。H.Py.Bzt迅速被O2-·捕捉并出现强荧光产物。测量所得荧光强度与空白试剂对比λex/em=377/528nm(S1为0.10mol·L-1NaOH溶液，S2是水)。相对荧光强度与O2-·数量成正比。实验参数设置如下：进样量200μl；反应管长度250cm(内径0.80mm)；采样和注射时间分别为15s和50s；泵转速为30转每分。

测定SOD活性时，提取S2蒸汽(0.20ml稀释到10ml)。设SOD数量P(参考O2-·消除作用测定)达到50%作为一个单位，SOD活性的计算公式如下：SOD活性(Uml-1)=PVTn/(50%VM)，VT是被检测溶液的总体积，VM是所提取SOD的体积，n是所提取SOD被稀释的倍数(VT/ VM)。SOD活性的单位可以根据SOD在样品中的含量可以转换为Ug-1。 1.2.2 O2-·消除作用测定。

当一定浓度SOD标准溶液流过S2时荧光强度记为Fs；只有一定量Na2S2O4溶液流过S2时荧光强度为F；当SOD和Na2S2O4均未被添加时荧光强度为F0.SOD对超氧阴离子的清除率(P)计算公式为P=(F-Fs)/(F-F0)×100%。 1.2.3 从样品中提取SOD。

葱，大蒜和洋葱去皮、根，洗净，空气中放干；每个样品取1.0000g并与2.00ml磷酸盐缓冲溶液(pH7.80；0.050molL-1)混合，冷冻2h后捣成糊状，稀释至8ml，持续冷冻1h，离心(4000rpm)15min。上清液转移入三支离心管中，加入冷的乙醇(0.50ml)和氯仿(0.50ml)。混匀后离心5min。上清液为SOD提取物，存放于冰箱中。 1.2.4 通过邻苯三酚的自动氧化检测SOD活性。

10ml比色管中加入5ml Tris-HCl(pH8.20)缓冲溶液，0.30ml邻苯三酚(3.00×10-3molL-1)，以及0.20mlSOD提取物[20]。使用双蒸馏水稀释至刻度。溶液混匀后在320nm处与空白试剂对比测量荧光。25℃时，抑制邻苯三酚自动氧化速率至50%min-1ml-1的SOD数量定义为SOD活性单位(Uml-1).SOD活性计算公式如下：SOD活性(Uml-1)=[(υp-υs)/(υp×0.5)]×VTn/υs, υp为邻苯三酚自氧化率，υs是样品的自氧化率，VT是被测溶液总体积(ml)，n是SOD提取物稀释倍数。SOD活性单位可以根据样品中SOD含量转换为Ug-1。

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2 结果与讨论

2.1 检测机理

在这次研究中，O2-·通过反应S2O42-+O2+4HO-=2SO32-+2H2O+O2-·制得[21],根据SO32--S2O4和O2-O2-·的标准和氧化还原电位计算[22]，反应平衡常数(K)和条件反应常数(K′)分别为7.6×1018和7.6×108。因此反应可以在O2碱性饱和溶液中自发反应完全，并且O2-·的浓度在0.10molL-1NaOH中可以至少维持1.5h。

因为H.Py.Bzt与O2-·反应形成强荧光产物，所以O2-·数量可以通过测量荧光强度变化来直接检测。根据这种方法所得到的激发和发射光谱记录在(图1)，荧光强度使用λex/em=377/528nm。结果表明H.Py.Bzt本身没有荧光而在氧化反应发生后荧光强度显著增加。但H2O2不能氧化该探针(图1(3))同样数量的羟基自由基(HO·)在同样的测量波长下也不能改变荧光强度(图1(4))。虽然10倍数量的HO·可以使荧光强度增加，实际上HO·源自O2-·并且只能以10-8molL-1的极低浓度持续10-4s[23]，但是这种HO·数量以现有的生物体内不能达到这么高数量的O2-·。此外，H.Py.Bzt捕捉O2-·的反应敏感而迅速。因此HO·将不会在实际样品中干扰O2-·的检测。所以这种探针可以针对识别O2-·并且该方法在活性氧的检测中有更好的选择性。

为了研究反应机理，合成氧化产物；0.050gH.Py.Bzt溶于10ml乙醇中，2.00gNa2S2O4溶于10mlNaOH中(0.10molL-1)，将其混合，并加入适量缓冲溶液。然后除去溶剂，残留物用二氯乙烷洗。得到粗产物绿色固体。乙醇中重结晶得到纯的棕色产物。[熔点：131-132℃。1H NMR(90MHz，DMSO-d6，25℃，TMS)：δ7.6-8.6(4H，pyridine-H)，7.3-7.6(4H，benzol-H)。IR(KBr压片)：ν(cm-1)1637(C=N)，3105(C-H)，1595(C=C)。元素分析(%)计算C12H8N2S(实际值)：C67.90(67.92),H3.75(3.77),N13.26(13.21)]。如1H NMR图谱显示，对应于H.Py.Bzt中N-H(4.3)和C-H(6.3)的峰消失并且其它信号移动到较低的区域，表明该产物具有较大的共轭体系。这也可以解释荧光强度增加的原因。在红外图谱中，N-H(3250cm-1)和C-H(3105cm-1)消失而C=H在1673cm-1的吸收带出现。所有光谱

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荧光探针的合成及自由基检测研究

数据与方案3中的结构Ⅱ一致。该结构通过元素分析进一步证实。因此，该机制可以推测如下：

O2-·通过去氢氧化该探针得到有更好的稳定性和更大的共轭体系的化合物2-(2-吡啶)-苯并噻唑(方案3，Ⅱ)(S上的自由电子对同样与苯环共轭)。由于它更大的共轭体系，荧光强度在探针与O2-·反应后显著增加。

要确认是由碱性Na2S2O4获得的O2-·使荧光增强，我们用几种含硫的化合物进行了测试。结果表明Na2SO4，Na2SO3和Na2S均不能使荧光强度增加。我们同样测试了使用中性和碱性Na2S2O4与H.Py.Bzt反应，结果表明荧光强度在中性水溶液中不会改变而在碱性溶液中显著增加。这些测试证明只有产生O2-·的碱性Na2S2O4溶液可以氧化该探针并且使荧光强度增高。为了进一步验证该结论，使用邻苯三酚产生O2-·与探针反应。结果显示与碱性Na2S2O4相同(图2)并且由于邻苯三酚的缓慢自氧化速率，荧光强度增加更加持久。这样的结果表明碱性Na2S2O4溶液中存在O2-·，这也可以通过SOD清除O2-·的实验证实。与通过邻苯三酚自氧化产生O2-·比较，碱性Na2S2O4更为迅速，所以没有必要考虑时间对测定的影响。这不仅避免了实验错误也改进了实验速度。

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荧光探针的合成及自由基检测研究

2.2 多参数优化

优化的多方面参数为取样、注射时间和停止流动，流速，注射体积。实验中所用试剂是流动的1.20×10-3molL-1 Na2S2O4，5.00×10-3molL-1H.Py.Bzt，以及Na2B4O7-NaOH(pH9.20；0.10molL-1)缓冲溶液作为载体。 2.2.1 注射体积影响。

H.Py.Bzt注射体积从50到300μl多次取样。截过表明相对荧光强度随注射体积增加而升高，而△F从200至300μl几乎不改变(图3)。同时，更大的注射体积意味着更低的样品通量。为了同时保证敏感度和样品通量，选择200μl。 2.2.2 流速影响。

反应器为一段PTFE管(250cm长，内径0.80mm)。流速是样品通量的重要因素。实验中流速通过改变泵转速调整。结果表明△F在转速为25-30转每分时达到最高并且稳定；30转每分时基线稳定并且峰型良好。所以转速采用30转每分，载体流速，H.Py.Bzt，Na2S2O4，和SOD分别为1.60，2.40，2.20ml每分钟。

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2.2.3 采样和注射时间的影响。

我们使用不同的采样和注射时间测试了敏感度和峰型。结果表明它们分别是15s和50s时△F最高并且峰型更好。停止流动的时间同样进行了测试。结果表明停止流动的时间对△F没有影响。这表明该反应非常迅速；由于这样的反应速率它可以在一瞬间完全反应，所以时间对检测没有影响。这可以减少由于测定时间带来的误差。由于反应时间对测定没有影响，不需要停止流动，这也就缩短了检测时间并且改进样品通量。因而，这种方法达到每小时55个样品的通量。

2.3 pH的影响

图4表明，结果显示在8.90-10.00的范围内是产生O2-·的最佳pH。相比较而言，Na2B4O7-NaOH比NH4Ac-NaOH，NH4Cl-NH3·H2O和Tris-HCl缓冲溶液体系内更敏感。因而选择Na2B4O7-NaOH缓冲溶液(pH9.20,0.10molL-1)作为载体。

2.4 反应物浓度优化

Na2S2O4的浓度决定O2-·的产量。试验结果表明△F与Na2S2O4在0.00至1.10×10-3molL-1间呈线性关系并在Na2S2O4浓度达到1.20×10-3molL-1时达到稳定(图5)。所以实验中Na2S2O4浓度选择1.20×10-3molL-1。

因为H.Py.Bzt是O2-·的捕捉剂，它的浓度直接决定O2-·是否能被完全捕获，这也就决定了该方法的准确和敏感程度。△F随捕捉剂浓度升高而升高并且在H.Py.Bzt达到4.50×10-3molL-1时达到平衡(图6)。因此H.Py.Bzt的注射浓度取5.00×10-3molL-1。

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表2 样品中SOD活性检测

样品 数量 建议方法x±SD (U g) 标准方法x±SD (U g-1) 葱 7 180.2±3.1 182.1±5.6 蒜 7 71.3±2.8 72.2±5.2 洋葱 7 50.8±3.5 51.2±6.0 —

—

-1

2.5 方法的再现性

根据这种方法进行了11次测定。峰高的标准偏差是0.42，相对标准偏差是0.28%，这表明该方法的再现性非常良好。

2.6 干扰影响

31种干扰被单独研究来测定以该过程从1.20×10-3molL-1Na2S2O4获得O2-·时对其造成的影响。相对荧光强度±5%的误差可以接受。以下(每mol可接受的量)Na+，Cl-，(超过1500)；葡萄糖，乳糖(1000)；蔗糖，K+，Mg2+(500)；Cu2+，Ca2+，Br-，NO3-(200)；乳糖，SO42-，I-(120)；Zn2+(100)；L-苯丙氨酸，Co2+，Pb2+(80)；HAS，胸腺嘧啶，胞嘧啶(40)；腺嘌呤，鸟嘌呤(30)；硫脲，DNA(20)；RNA，牛血清白蛋白(15)；色氨酸，DL-酪氨酸(10)；及Fe3+，Al3+(2)无影响。试验结果表明大

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荧光探针的合成及自由基检测研究

多数生物体样本无影响。

2.7 清除O2-·的效果

SOD是O2-·的特定清除剂，这种清除O2-·效果可以用来验证该方法的效率。由图7可见清除效果和SOD数量呈明显线性关系，这证明该方法有效。

2.8 检测样品中SOD的活性

基于这种实验方法成功检测出葱，大蒜，洋葱中SOD活性(表2)。与经典邻苯三酚自氧化检测法相比，该方法具有高敏感度，短检测时间和自动反应的优点。更为重要的是，反应时间由程序严格控制并且反应可以与时间无关迅速完成。虽然经典测定SOD活性的方法，即邻苯三酚自氧化与检测时间密切相关，但这时间不能严格控制，这使得测定不规范并且产生更大误差。此外，金属离子在经典方法中有更大的影响。

3 结论

在这次研究中，碱性Na2S2O4被采用为O2-·的来源，2-(2-吡啶)-苯并噻唑作为新型荧光探针，葱，大蒜，洋葱中SOD活性得以通过流动注射法成功检测。荧光探针因为只能检测O2-·所以具有更好的选择性，而H2O2和相应量HO·不会对超氧阴离子自由基有影响。此外，该反应为全自动并且分析速度迅速，这样更适用于块状样品的检测。因此该法在大规模筛选抗氧化药物和SOD活性检测中有重要使用价值。

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致谢

对国家自然项目科学重点项目基金(No.20335030)和中国山东自然科学基金(No.Z2003B01)表示感谢。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/1q4a.html