冰冻切片

1. 体式显微镜下，用显微剪刀沿角膜缘剪下角膜，将眼杯置于固定液内（0.2M NaH2PO4

10ml + 0.2M Na2HPO4 40ml + 8%多聚甲醛 50ml），４℃固定过夜

2. 体式显微镜下，用显微剪剪除虹膜，并剪断晶体悬韧带，晶体自动游离出眼杯，尽量减

少对眼杯扰动，将眼杯置于30%蔗糖（sucrose）溶液内（0.1M PB配置 PH=7.4），４℃脱水过夜沉底

3. 将眼杯由30%蔗糖溶液取出，置于20%蔗糖溶液与OCT包埋剂（TFM? Tissue Freezing

Medium）2：1体积比例混合液中，室温浸泡摇动30min 4. 体式显微镜下，于平皿内用软纸采用虹吸方式吸干眼杯内外水份，尽量减少对眼杯扰动 5. 在模具（tissue-tek 4565）上标记样品情况，向模具内倒入20%蔗糖溶液与OCT包埋剂

2：1体积比例混合液，将眼杯开口向上置于液体上，先用显微镊子按压一侧眼球（下方），使液体缓慢浸满眼杯，而后将眼杯在琼脂糖翻转，杯口朝下置底，上方眼球标记点朝向模具标记位置并置中，并使鼻侧或颞侧眼球靠近模具壁，将模具置于钢板上，移至-80℃冰箱（保证眼杯在内不动），静置10min

6. 将模具置于冰冻切片机恒冷箱内1h（冰冻切片参数切割头-17℃，恒冷箱-20℃），温度

平衡至-20℃，样本块颜色至瓷白色，并在对应模具标记位置标记样本块（眼球上方），将样本块由模具内顶出，用刀片修整样本块

7. 在支撑器上涂抹OCT，待颜色稍变化，将样本块预切割侧向上（靠近模具壁侧），置于

OCT内，将压制块置于标本块上

8. 待OCT液变色为瓷白色，将支撑器连同样本块固定于切割头上，样本块标记侧向上，

将刀片保护套去除后，逐步调节样本块与刀片距离（后退钮为连续性，前进钮为间断性） 9. 当刀片开始切割组织块时，先将切片厚度调至30μm进行粗切，并放置下防卷板，以连

续均匀的力量转动切片机的摇柄，当切割至目标区，将切片厚度调至12μm

10. 在促黏合载玻片上标记样本情况，先在恒冷箱预冷片刻，掀开防卷板，用刷子将冰冻切

片展开平整，将载玻片黏合剂侧向下，载玻片标记侧靠近切割头，将冰冻切片敷贴于载玻片上（眼球上方统一朝向载玻片标记侧）

11. 载玻片室温干燥过夜，置于-20℃或-80℃冰箱内，标本块置于模具内，包装严实后置于

-20℃或-80℃冰箱内

注：OCT冰冻切片包埋剂（opti-mum cutting temperature compound）：一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。又因OCT混合物为水溶性，故在漂片时可溶于水，在以后的染色中不会增加背景染色。

防止冰晶：（1）30%蔗糖溶液沉底；（2）包埋过程要求速冻，但温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂，而且产生冰晶

切片温度：任何组织都有一个理想的切片温度，如果温度太低，片子容易卷曲和破碎；如果温度太高，片子就会皱成一堆。非常坚实的组织容易产生横皱，切片时应包埋成角且尽可能的加温。如果需要加温，只需要把大拇指置于组织块面几秒钟，如果需要降温，简单的做法就是把过冻的冻台放在组织面上几秒钟

切片厚度：太薄看起来象半透明的镜纸，片子太厚看起来混浊、柔性差 波浪线样的横皱：切片机零件松动，并清除垃圾残骸

石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；要求做石蜡切片的，可作冰冻切片，要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片。冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点

是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

PB，phosphate buffer，磷酸盐缓冲液 0.2M NaH2PO4，NaH2PO4·2H2O 31.2g + ddH2O 至1000ml 0.2M Na2HPO4，Na2HPO4·12H2O 71.632g + ddH2O 至1000ml 0.2M NaH2PO4，NaH2PO4·H2O 27.6g + ddH2O 至1000ml 0.2M Na2HPO4，Na2HPO4 28.382g + ddH2O 至1000ml 0.2M PB（pH=7.4，200ml），19ml 0.2M NaH2PO4 + 81ml 0.2M Na2HPO4 0.1M PB（pH=7.4，100ml），50ml 0.2M PB + 50ml ddH2O

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