微生物实验指导书(1)

《 微生物学实验 》

实验一 显微镜的使用、细菌革兰氏染色法及细菌特殊结构的观察

（一） 实验目的

1. 了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理 2. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。 3. 在油镜下观察细菌几种基本形态 4．掌握细菌革兰氏染色法

（二） 实验原理

1．显微镜的基本结构及油镜的工作原理

现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常 被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：

1. 增加照明亮度

油镜的放大倍数可达 100 Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的油镜（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。

2. 增加显微镜的分辨率

显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，分辨力D可表示为：D=λ/2N.A，式中λ= 光波波长； NA= 物镜的数值孔径值。

光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7 μ m ），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：

NA=n × sin α

式中α为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到 120 O ，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空气及水的折射率（分别为 1.0 和 1.33 ）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所

能达到的数值孔径值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（ NA 都低于 1.0）。若以可见光的平均波长 0.55 μm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2 μ m 左右。

2．革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

（二） 实验器材 1． 菌种

枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物 2． 溶液或试剂

香柏油，二甲苯，结晶紫染色液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染色液，蒸馏水 3． 仪器及相关用品

显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、镊子 （三） 实验方法

1． 显微观察

显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序。

油镜观察 高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过 1.0 ，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 2．革兰氏染色 （1） 涂片 常规涂片法

取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 （2） 初染

滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。 （3） 媒染

用卢戈氏碘液媒染约1 min ，水洗。 （4） 脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。

革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。 （5） 复染

在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。

（6） 镜检

干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G

+

），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。 4．用毕后的处理

（1）上升镜筒，取下载玻片。

（2） 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。

（4）分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。 （四） 实验结果

1． 绘出你在油镜下观察到的三种菌的形态

2． 列表简述两株细菌的染色结果(菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。 （五） 思考题

1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？ 2、影响显微镜分辨率的因素有哪些？

3、 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 4、 你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节?

实验二 沉降法检测空气中微生物数量

（一） 实验目的

1．学习并掌握用沉降法检测空气中的微生物

2．了解空气中微生物的分布状况 （二）实验原理

在我们周围的环境中存在着种类繁多、数量庞大的微生物。空气中也不例外。虽然空气不是微生物栖息的良好环境。但由于气流、灰尘和水沫的流动，人和动物的活动等原因，仍有相当数量的微生物存在。当空气中个体微小的微生物落到适合于它们生长繁殖的固体培养基的表面时，在适温下培养一段时间后，每一个分散的菌体或孢子就会形成一个个肉眼可见的细胞群体即菌落。观察大小、形态各异的菌落，就可大致鉴别空气个存在的微生物的种类。（三)实验器材 1． 试剂

牛肉蛋白胨培养基配方：

牛肉膏 5.0g, 蛋白胨 10.0g，NaCl 5g, 水1000ml，pH 7.2~7.4 马铃薯培养基配方：

马铃薯 200g, 蔗糖 20g, 水1000ml， pH 7.2

高氏一号培养基配方：

淀粉 20g, 硝酸钾 1.0g, 磷酸氢二钾 0.5g, 硫酸镁0.5g, 氯化钠0.5g, 硫酸亚铁0.01g, 水1000ml, pH 7.2~7.4 2. 仪器及其他用品

高压灭菌锅，操作工作台，三角瓶，培养皿，酒精灯，培养箱等 （四）实验方法

1．倒平板：按常法配置上述培养基，分装于三角瓶中，高压灭菌备用。临用前将培养基熔化，冷却至50℃左右，各倒16个平板备用。

2．暴露取样

在指定的地点草地，一层楼，三层楼，七层楼各放4皿，将平板皿盖打开，在空气中暴露5min和10min,时间一到，立即合上皿盖。

3． 培养观察： 细菌置于37℃培养，放线菌培养基平板和真菌培养基平板置于28℃培养。细菌培养48h，真菌和放线菌培养4-6天。计数平板上的菌落，观察各种菌落的形态、大小、颜色等特征。

4.计算1m3空气中微生物的数目

奥梅染斯基（Омелянский）曾建议：如面积为100㎝2的平板培养基，暴露在空气中5分钟，置于37℃培养24小时后所生长的菌落数，相当于10L空气中的细菌数。

X= N×100×100 πｒ2

X：每m3空气中的细菌数

N：平板暴露5分钟，置37℃培养24小时后生长的菌落数 r：平皿底半径（㎝） （五）实验结果

1．列表比较不同放置地点空气菌落种类以及数量的差异？

菌落平均数 环境 室外 10min 5min 室内 10min 3

细菌 5min 霉菌 放线菌

2．用沉降法计算1m空气环境中所含菌数。 （六）思考题

1．对沉降测定法的结果，进行分析。

实验三 多管发酵法检测水中的大肠菌群

（一） 实验目的

1. 了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义 2．学习检测水中大肠菌群的方法 （二）实验原理

大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。

大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。

多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。

1．初发酵试验

水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。48小时后仍不产气的为阴性结果。

2．平板分离

初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo′s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar,EMB agar）平板上划线分离菌落。

3．复发酵试验

以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。 （二） 实验器材 1. 水样

自来水 2．试剂

乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板，革兰氏染液。 3． 仪器及其它用品

载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管，革兰氏染液，显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，灭菌三角瓶等。 （四） 实验方法 1． 水样的采取

水源水

2．初发酵试验

取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9ml自然水。完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min左右。冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样，向装有一倍的乳

酸蛋白胨培养液的另5支试管中加入1ml 10-1水样。 将各试管充分混均，置于37℃恒温箱中培养24h。

（2）平板分离 经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶）液体，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再置于37℃下培养18—24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。

（a）深紫黑色、有金属光泽。（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。（c）淡紫红色、中

高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，K2HPO4 0.5g， NaCl 0.5g ，MgSO4.7H2O 0.5g ，KNO3 1g ， FeSO4 0.01g，琼脂 15－20g ，H2O 1000ml，pH 7.2-7.4

马铃薯蔗糖培养基：去皮马铃薯200g, 蔗糖20g，琼脂15～20g，H2O 1000ml, pH自然。 1%链霉素，0.5%重铬酸钾，结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红 2． 仪器以及其他用品

高压灭菌锅，超净工作台，普通光学显微镜，培养皿， 移液器， 天平，灭菌的袋子，小铲，250ml三角锥形瓶，250ml烧杯，药勺，无菌培养皿，盛9m1无菌水的试管6支、盛45m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃珠、接种环、酒精灯、显微镜、称量纸等。 （四） 实验方法 1．土壤取样

根据实验的目的选取采样地点，把采到的土壤装进取样袋后直接带回微生物实验室立即使用或放入4℃的冰箱备用，但放置时间不要超过一天。 2． 培养基的制备

培养基的类别 马铃薯蔗糖培养基 培养基配制原料 配置方法 用于培养的菌种 马铃薯200g，葡萄糖20g, 将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，霉菌 琼脂20g，水1000ml。 煮沸10～20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。加入琼脂，加热溶化，分装，121℃高压灭菌20min。 酵母菌 高氏1号培养基 可溶性淀粉 20g,KNO3 先将淀粉溶入烧杯中加热搅拌至完全溶7H2O 水至1000mL。调pH7.2～7.4，加入琼脂，加热溶化，分装，121℃高压灭菌20min。 放线菌 1g,NaCl 0.5g,K2HPO4·3H2O 解，再加入其他成分依次溶解，最后加0.5g,MgSO4·0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,琼脂20g,水 1000mL，pH 试纸。 牛肉膏蛋白胨培养基 先将牛肉膏、蛋白胨溶入烧杯中加热搅 细菌 牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 拌至完全溶解，再加入其他成分依次溶5g,琼脂20g，水1000ml，pH 解，最后加水至1000mL。调pH7.2～7.4，试纸 。 加入琼脂，加热溶化，分装，121℃高压灭菌20min。

3.仪器灭菌

将配置好的培养基，用报纸包扎好的培养皿、用橡胶塞封好的盛有9mL的试管、枪头和装有45mL蒸馏水与玻璃珠的三角锥瓶，玻璃珠放到高压灭菌锅进行高温蒸汽灭菌。

4．微生物的分离

（1）倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马铃薯琼脂培养基溶化，待冷至55—60℃时，在高氏1号培养基中加入1ml的0.5%重铬酸钾, 在马铃薯蔗糖培养基中加入1ml的1%链霉素，然后分别倒平板，其中其方法是右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果三角烧瓶内的培养基一次可用完，则瓶塞不必夹在手指中。瓶口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。

（2）制备土壤稀释液 称取土样5g，放入盛45ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散,配制成10-1土壤溶液。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7各种稀释度的土壤溶液。 （3）分离微生物

分离细菌

划线 将牛肉膏蛋白胨两个平板底面分别用记号笔写上10-6和10-7两种稀释度，然后用

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接种环分别在10和10三管土壤稀释液中各吸取一环土壤稀释液，在平板上划线 。

培养 肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养1—2日。 分离放线菌

涂布 将高氏1号两个平板底面分别用记号笔写上10-3和10-4两种稀释度，然后用两

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支1ml无菌吸管分别由10和10三管土壤稀释液中各吸取200ul对号放入已写好稀释度的平板中，加入8个灭菌的玻璃珠，轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。

培养 平板倒置于28℃温室中培养3—5日。

分离酵母与霉菌

-3-4

涂布 将马铃薯四个平板底面分别用记号笔写上10和10两种稀释度（一个稀释度两皿），然后用两支1ml无菌吸管分别由10-4和10-5三管土壤稀释液中各吸取200ul对号放入已写好稀释度的平板中，加入8个灭菌的玻璃珠，轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。 （5）挑菌

划线分离 使用接种环从待纯化的菌落中沾取少量菌种，细菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上、霉菌和酵母菌在马铃薯蔗糖琼脂培养基上、放线菌在高氏1号培养基上进行划线分离。可采取如下几种采画线接种方法

（6）保存菌种

（五） 实验结果

1．在你所实验的三种培养基平板上，长出的菌落分属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。

菌落 类型 1 2 3 4 5 1 特征描写 高度 大小 形态 干湿 透明度 颜色 边缘

（六）思考题

1.如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养?请写出实验的主要步骤。 2.如果要分离得到酵母菌，在什么地方取样品为宜?并说明理由。 实验报告要求

包括如下内容，写作规范严格按照统一的要求。 1.实验目的 2.实验原理 3.实验器材 4.实验步骤与方法 6 .实验结果与分析 7． 思考题

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