米根霉发酵生产L_乳酸

乳酸发酵

　第30卷第3期　

2000年9月

工　业　微　生　物IndustrialMicrobiology

　Vol.30No.3　

Sept.2000

米根霉发酵生产LΟ乳酸

虞东胜,　周晓燕,　王　健,　王　勤,　田文阳

(上海市工业微生物研究所,上海200233)

摘　要　报道了LΟ乳酸菌株的分离与筛选,发酵条件对产LΟ乳酸的影响。从78Ο,

其中米根霉(Rhizopusoryzae),。试验结果表明,该,MgSO40.08,KH2PO40.05,ZnSO40.01。发酵罐中,当总糖平均浓度为174g/L时,5罐平均

产LΟg/L80.4%,发酵周期61h,LΟ乳酸纯度97.9%。关键词:　LΟ乳酸　发酵　　乳酸是一种重要的食用有机酸。人和哺乳动物体内存在的乳酸全是LΟ型的,它直接参与代谢,并且能迅速地转化成肝糖,全部被吸收。从人体营养及代谢的角度来看应服用LΟ乳酸。世界卫生组织建议限制使用DΟ乳酸含量高的产品,尤其是生产婴幼儿营养食品应避免使用DΟ或DLΟ混合乳酸。故国外对LΟ乳酸的研究和生产十分重视,现在世界总产量已达10万t以上。利用根霉发酵生产LΟ乳酸,与细菌发酵相比,具有发酵快、菌体生长营养要求简单、可以使用无机氮源、发酵液含杂质较少等优点。因此,国内目前全部采用此方法生产LΟ乳酸。然而,发酵转化率较低是其一大缺点。用米根霉Rs928菌株发酵生产LΟ乳酸不但能提高对糖转化率,而且不会产生其它有机酸,是较理想的生产菌株。

1.1.3　分离纯化培养基:察氏培养基。1.1.4　种子培养基(%):葡萄糖10,KH2PO40.08,MgSO40.03,尿素0.2,CaCO32,ZnSO40.03,pH自然。尿素、CaCO3均分

开灭菌。

1.1.5　发酵培养基(%):葡萄糖16,KH2PO40.08,MgSO40.03,尿素0.2,CaCO32,ZnSO40.01,pH自然。尿素、

CaCO3均分

开灭菌。

1.2　LΟ乳酸产生菌的分离和筛选

Rs928LΟ乳酸产生菌,是一支产生LΟ乳

酸纯度高,产酸能力强的优良菌株,从我国生产黄酒的酒曲中分离得到,是根霉属中的米根霉(Rhizopusoryzae),为发酵食品常用菌。米根霉在斜面培养基上生长形态及特征:匍匐菌丝爬行,假根较发达,孢囊梗2～4成束,很少单生,孢子菌丝上有厚垣孢子。

将酒曲样在斜面培养基上30℃培养2～3d。挑取似根霉的菌落,进行适当稀释,在

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌种:米根霉(Rhizopusoryzae)Rs928,

察氏培养基上涂布分离纯化。将分离纯化的菌株接入斜面培养基中,30℃培养5d左右。根据米根霉的生长形态及特征,分离纯化出米根霉78株。然后进行菌种选育,选育过程如图1所示。

本所分纯选育和保藏。

1.1.2　斜面培养基:马铃薯汁培养基。

作者简介:虞东胜(1965～),男,大学,工程师。

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乳酸发酵

　第3期虞东胜,等:米根霉发酵生产LΟ乳酸

分离筛选

60

第30卷　

DES处理

Rs82260

Coγ射线处理

Rs88Ο9Rs928株

Rs88Ο29Coγ射线处理

图1　米根霉Rs928筛选系谱程序

初筛时,将分离纯化的米根霉制成孢子悬浮液,接入种子培养基中,35℃振荡培养72h。用纸层析法定性,对产乳酸高杂酸少

2　结果与讨论

2.1　

的菌株进行复筛。复筛时,将初筛时确定的65株产乳酸的发酵液进行LΟ乳酸纯度的测

定,产LΟ行数次发酵,筛选出13LL乳酸纯度在%以上的优良菌株。,以Rs928的指标为最高,也最稳定,选定为LΟ乳

L,玉,玉米淀粉水解,其余以发酵培养基为基础进行发酵,发酵周期72h,结果见图2。从图2中可见,玉米淀粉水解对产LΟ乳酸影响很大,大米、玉米对产LΟ乳酸也有影响,口服葡萄糖生产成本又较高。因此,本试验采用玉米淀粉水解糖为碳源

。

酸产生菌。1.3　培养方法

1.3.1　斜面培养:33℃,培养时间3～4d。1.3.2　种子培养:500ml三角瓶装入100ml

培养液,0.1MPa20min灭菌,接入孢子振荡培养20～28h。5t种子罐装65%罐容的种子培养液,0.1MPa30min灭菌,接入孢子,35℃培养,风量1∶0.08～1∶0.10,发酵24～32h。

1.3.3　发酵培养:60t发酵罐装65%罐容的

图2　不同碳源对产LΟ乳酸的影响2.2　不同氮源对产LΟ乳酸的影响

发酵培养液,0.1MPa25min灭菌,接种量8%～10%,33℃培养,风量1∶0.08～1∶0.10,发酵48～72h。1.4　分析方法

1.4.1　乳酸的定性测定:采用纸层析法。展

以发酵培养基为基础,加入不同氮源进

行发酵,结果见图3。图3的数据显示,米根霉Rs928利用玉米浆发酵产LΟ乳酸有很大影响。从不同氮源对产LΟ乳酸的效果来看,用尿素最为合适。

开剂:水、苯甲醇、正丁醇以1∶5∶5的量相混合,然后加1%的甲酸。显色剂:0.04%的溴酚蓝酒精溶液,用0.1mol/LNaOH调节pH到6.7。

1.4.2　发酵液中总糖的测定:费林氏法。1.4.3　发酵液中总酸的测定:发酵液过滤

后,

用E.D.T.A.法测定乳酸钙含量,再折算为乳酸量。

1.4.4　LΟ乳酸的纯度测定:(1)LΟLDH-UV

图3　不同氮源对产LΟ乳酸的影响

2.3　不同碳源浓度对产LΟ乳酸的影响

图4显示的数据是以发酵培养基为基础、不同的玉米淀粉水解糖浓度的发酵结果。显然,随着糖浓度的增加,对糖转化率逐渐降

—5

—

法。(2)高压液相色谱法。

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　第3期工　业　微　生　物第30卷　

低,发酵周期不断延长。当糖浓度大于180g/L时,更为明显。对工业化生产来说150g/L左右的浓度比较适合

。

到5mg/mL时,产酸速度开始突增,发酵40h后生物量达到高峰22mg/mL。产酸达到100g/L,并继续增长,而生物量却开始下降。接种20h以后耗糖速度加快,随着产酸的速度加快而加快。生物量达到最高峰后,菌体有部分自溶,产酸开始减缓,慢图4　

LΟ乳酸的影响2.4　LΟ乳酸的影响

在500ml三角瓶内装入不同体积的发酵培养基,在往复式摇床上振荡培养72h,观察通气量对产LΟ乳酸的影响,结果见图5。从表中可以得出,在500ml三角瓶中装入50～100ml的发酵液,产酸水平没有受到影响,说明Rs928进行LΟ乳酸发酵对通气量要求不高。

图6　温度对产LΟ乳酸的影响

图5　通气量对产LΟ乳酸的影响2.5　温度对产LΟ乳酸的影响

图7　生产LΟ乳酸全过程

2.7　60t罐生产LΟ乳酸的试验

选用摇瓶确定的最佳发酵培养条件,在60吨罐规模进行试验。在5t种子罐按种子培养基配料,灭菌后接入孢子,35

℃培养48～72h,发酵结果见表1。

将Rs928按相同接种量接入发酵培养基后,置于相同转速的往复式摇床上,分别于30℃、35℃、40℃

恒温室中同时培养,观察温度对产LΟ乳酸的影响。由图6

可以看出Rs928在35℃发酵时,产LΟ乳酸率最高。2.6　发酵生产LΟ乳酸的全过程

发酵产酸速度直接影响罐的利用率和成本。当发酵其他条件不变时,菌体生物量与产酸速率有重要关系。图7显示当生物量达

—6

—

3　结束语

通过对LΟ乳酸发酵条件的试验,确定了以Rs928为LΟ乳酸产生菌,在玉米淀粉水解糖150g/L、0.2%尿素、500ml三角瓶中装入50～100ml的发酵液、于35℃进行发酵,得到了比较满意的效果。但对糖转化率还比较低,都在85%以下,是否能提高对糖转化率尚有待于进一步研究。

乳酸发酵

　第3期虞东胜,等:米根霉发酵生产LΟ乳酸第30卷　

表1　60t罐生产LΟ乳酸的试验

批号

12345

总糖(g/L)

175177171172175174

产LΟ乳酸(g/L)

142140137139142140

转化率(%)

81.179.180.180.881.180.4

周期(h)

606456626361

LΟ乳酸纯度(%)

98.797.599.597.169

平均

:97参考文献

G.andEngineeringChemistry,

):1233～1235

[]周德庆主编.微生物学实验手册.上海:上海科学技术

[1]　陈　声主编.版社,1991

[2]　LiviaAlm;ofonNutrientsin

MilkandSPropertiesofFermentedLiquidMilk

出版社,1986

[5]　钱信忠主编.中华人民共和国药典(二部),北京:人民

卫生出版社,1985:238～239

L2lacticacidproductionbyRhizopusoryzae

YUDong2sheng,ZHOUXiao2yan,WANGJian,WANGQin,TIANWen2yang

(ShanghaiInstituteofIndustrialMicrobiology,Shanghai200233)

Abstract　TheLΟlacticacidproductionwascarriedoutbythestrainRs928ofRhizopusoryzaeanditsfermentationconditionsin60m3fermentorwereinvesgated.Themediumcontained(%):glucose16,MgSO40.08,KH2PO40.05,ZnSO40.01,CaCO37,Urea0.2.Theresultswereasfollows:theyieldofLΟlacticacidwas140g/L;thefermentationperiodwas61h;theconversionratewas80.4%andthepurityofLΟlacticacidwas97.9%.

Keywords　Rhizopusoryzae;LΟlacticacid;fermentation

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