冷冻切片protocol

冷冻切片

实验材料：固定好的鼠脑 试剂：30%蔗糖；包埋剂；1*PBS 用品与仪器：冷冻切片机；刀片；24孔板

实验步骤：（切片的地点在1楼和6楼，1楼的切片机在使用前需要预约）

1、将前一天放于4%PFA中固定的鼠脑样品取出放入30%蔗糖中进行固定。（鼠脑刚放入时会浮在液面上，放置过夜，待沉淀后可进行切片操作）

2、进行切片操作之前要进行一些准备工作，首先，在24孔板（每个鼠脑大概需要2个24孔板）每个孔中加入1ml PBS，用来舒展脑片。其次，具有自带荧光的鼠脑的切片需要使用包有锡纸的24孔板，防止其荧光淬灭

3、开切片机，将CT和OT温度都调节为-20℃，切片厚度设定为40μm。

4、用包埋剂包埋底座，凝固后将底座置于切片机相应位置上，调整好底座的位置，使之与刀片平行，转动切片转轮，将底座切平，注意不要让底座的厚度太大，根据切口的情况调整切片机使之运作良好。（注意切片的转轮要在每一次切片完成后锁定，防止切伤手指） 5、沿与冠状切平行的方向将鼠脑的小脑部分切除，将剩余的脑放置在底座上（注意鼠脑的中缝线要对准底座上的豁口），底座平行放置于-20℃环境下，可看到鼠脑由底座部分向上逐渐变白。

6、待鼠脑完全变白后，向鼠脑上添加包埋剂，等待鼠脑包埋好。（如发现部分鼠脑未包埋住或包埋不充分，需要向该部位再次添加包埋剂）

7、鼠脑包埋好后，将底座上流出的多余包埋剂切除，然后将样品连同底座放至切片机上进行切片。

8、放好样品后，先按后退键，将盛放样品的基座向后放，目测使刀片不能切到样品的位置。 9、转动切片机，使样品慢慢接近刀片，继续转动切片机进行切片，直至看到嗅球部位的脑组织，清理掉嗅球之前切下的切片。

10、自嗅球开始，每10片样品切片用玻璃钩粘起，放至第一个24孔内（脑切片如果粘在孔壁上不能直接用玻璃钩刮下来，而要用孔内的PBS冲刷下来），以此类推，直至得到自己需要的样品切片为至。

11、切片过程中注意观察切片形状，可发现得到切片的先后顺序依次为：嗅球、前额叶、含有胼胝体的脑片、SVZ、SCN等。

12、切片过程中要注意速度要均匀，不能太快也不能太慢，否则有可能使脑切片损伤。 13、切片结束后，将24孔板盖好（包好锡纸），清理干净切片机内部，将CT打开，OT关闭，锁定切片机，在切片机使用记录本上登记使用记录。

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