牛珀至宝微丸对肺损伤早期纤维化大鼠TGF-β1表达的影响

21 0 2年第 l 6卷第 2 3期

实用临床医药杂志Ju l f l i l dcn rc c oma o i c iiei Pat e C n a Me n i 1

牛珀至宝微丸对肺损伤早期纤维化大鼠 T -表达的影响 GF阻徐少群高巨，罗晶，舜艳， 周 林( .广州中医药大学第二附属医院麻醉科，东广州， 1 10 1广 5 02;扬州大学临床医学院、苏省苏北人民医院， .麻醉科； .科教处，苏扬州 2 50 )江 2 3江 2 0 1摘要：目的观察牛珀至宝微丸对肺损伤早期纤维化大鼠转化生长因子岱 ( G— 1的影响。方法 l T Ft ) 3 4 8只 s大鼠随 D

机均分为 4组：对照组 ( c组 )内毒素组 ( P、 L S组 )低剂量牛珀至宝微丸预处理组( D组)高剂量牛珀至宝微丸预处理组 ( 、 L、 HD

组)。采用气管内联合腹腔注射内毒素法复制肺损伤早期纤维化模型。实验结束前留取标本测定肺血管通透性 ( B值 ) E及肺组织湿/干重量比( D) HE染色光镜下观察肺损伤程度 ( A W/; D D评分 )用免疫组化法和蛋白质免疫印迹法测定肺组织 T F; G. B 1蛋白表达； a isn染色法检测肺组织胶原纤维表达。结果 V nGeo论与 L S组比较， D组以及 HD组， P L尤其是 HD组的 E W/ B、 D

值和 D D评分明显降低 ( 00 )光镜下肺肺损伤及纤维化的程度均减轻， A P< . 1,肺组织中T F1表达明显减少 ( 0 0 ) G一1 3 P< . 1。结牛珀至宝微丸通过抑制肺组织 T FB G . 1蛋白的激活，有助于减轻内毒素所致肺损伤早期纤维化。 关键词：牛珀至宝微丸；肺损伤；肺纤维化；转化生子因子 B 1中图分类号： 6 R 53文献标志码： A文章编号：17 6 2—2 5 (0 2 2 0 0—0 3 3 2 1 )3— 0 1 4

Efe t o u o z i a i r p l o f c f Ni p h b o m c o il ne p e so f t a so m i g g o h f c o e a 1 x r s i n o r n f r n r wt a t r b t

i aswi a l b oi o umo ay ij r n r t t e ryf r s fp l n r nu y h i sX h o u GA J Z o u j g L N S u y n U S

a q n, O u, h u L oi, I h n a n(.T eScn f l t o i l厂G ag og U i rt 0 C, u nzo, u n dn, 1 10; 1 h eodA i e H s t un dn nv sy厂T M G aghu G ag og 50 2 i ad paQ e i2 3 u e P o l SH si Z Y n z o . in s。 2 0 1, .S b e e o t, a g h u J g u 2 5 0 ) p pa a

AB T AC S R T:Obet e T bev ee et f ip ia co i nepes no t n - jci oosre h f c o u oz bomi plo x rsi fr s v t f N h r l o a f m n rwhf t e ( G一 1 nrt wt al f rs f umoayi u .Meh d 4 o iggo t co b t 1 T F 1 )i a i er boi o l n r n r r a r a 3 s h yi s p jy to s 8

S a ee a dm ydvddit teflw n ru s tecnrl ru gopC, h n ooi D rt w r n o l i e o h l ig go p:h ot o p( ru ) teed t n s r i n oo 4 og x gop( P ru ) pera n ru i w d sg ip h a i o i L ru ) n r— ru L Sgop, rt t t opwt l oaeN u ozi om c p l( D gop a dpe e me g ho b r l t a e t ru i ihd sg ip h a i o i HD go p .Moe o al f rs f u— r t n g pwt hg oaeNu ozi om c pl em o h b r l( ru ) d l f r boi o p l e yi s m n r jr a t yit t c el n t p roe lnet no d t i. e r x e m n w s o a i uy s e b r r h a a di r ei n a i c o f n o xn B f eepr e t a yn w s n a a na t j i e o o i ed d tes ei n f ru s eecl c dfr sa f um nr ac l em ait( B ad n e, h p c me s g p r o et syo l o ayvsua pr ebly E ) n o4 o w l

e oa p r i p l o ayt sew td rp ro yw i t( D) ereo um n r jr w so sre n um n r s e r poot nb e h W/;dge f l o a i u a b evda— iu/y i g p y ny d rH i ocp ( A cr) I u o ioh m s ya dWet nbo me o ee sdf e c e E m c soy D D soe; mm n hs c e i r n s r l t dw r ue r t— r t t e t h o de t no G一 1e pes n V nGeo tiigm to a sdf sn fcl gnf rsepe- i f F 1 x rs o; a i n s nn ehdw sue rt t go o ae bi x rs o T 3 i s a o ei l i lso fpu mo a is .Re u t Co i n o l n r tsue y s ls mpa e t PS g o r d wih L r up,t he EB,W/D ai n r to a d DAD c r n soei

L ru n D go pd cesds n cnl P<0 0 ) ereo umo a jr a df rs D go pa dH ru erae i i at gf i y( . 1,d ge f l n r i u n boi p yn y i s rl vdu drm cocp,a dT F 8 x rsi n p l o ayt serd cd o v ul P<0 e ee n e i soy n G 1 epes n i um nr i u e u e bi s i r o s o y( .

O ) o cuin Nu ozia i o i a p rs at a o f G - 1i p l o a su n 1 .C n ls i hb om c pl cns pes c vt no F1 n um n r tsea d o p r l u i i T 3 y i rl v a yf rs f um nr jr d cdb n o xn ei eer boi o l o a i u i u e ye dt i. e li s p y n y n o KE WOR:N u o zia i o i;p l o a jr;p l o a boi;t nf m n Y DS ip hbo m c pl um n r i uy um nr f rs r l y n y i s r s r ig a og o h f co e a 1 r wt a t rb t

收稿日期： 02— 7—1 21 0 6

基金项目：广东省中医药管理管局资助项目( 00 6 ) 2 50 9通信作者：巨，主任医师、高博士研究生导师，E—m i aj 0@13 cn al ou0 3 6 .o :g

2

实用临床医药杂志

第 1 6卷

急性肺损伤 ( L )临床常见的危重症， A I是病

甲酰胺溶液中浸泡， 5 C温水浴 7 于 6q恒 2 h直至组织蓝色消失，以提取组织中染料。于 6 0 n 2 m波

死率可高达 3%一 0,中难以控制的肺纤维 5 6%其化约占 A I死原因的 4%~ 0。本课题组 L致 0 7%前期工作及既往研究均表明 _,化生长因 3转 J子 p ( G—1是启动和调控肺损伤早期纤维化 1 T Fp )的关键性细胞因子。有研究 _表明， 4 中药牛珀至宝微丸能显著抑制内毒素休克所致的脑、、肺肾

长处测定光密度值，用单位组织中伊文思蓝提取量反映肺毛细血管通透性。左下肺称湿重后置烤

箱 (0, 0h烤至恒重，干重计算 W/ 8 2 )称 D。 1 3 2肺组织形态学评价：组织行石蜡切片， ..肺 常规 HE染色，镜下观察并摄片。按修正后弥光漫性肺泡损伤 ( iu ea eoa d m g A系 D f s l rl a ae D D) f v r

等脏器损伤程度，能有效抑制急性肺损伤早期还胶原纤维的生成 _。本研究拟通过气管内联合 6 J腹腔注射内毒素方法，统观察牛珀至宝微丸对系肺损伤早期纤维化大鼠肺组织 T FB G -1表达的影响。

统进行评分，根据肺泡内纤维素渗出、泡内肺出血、间质水肿、泡内中性粒细胞聚集、间肺肺肺质内中性粒细胞聚集 5个参考因素，正常、、按轻 中、分别评为 0、、、,项参数评分之和为重 12 3分各D D评分。 A

1资料与方法1 1动物选择和分组 .

1 3 3 T F1 . . G . t蛋白的 Wet l 3 s mbo e t法测定： B afr测定提取液蛋白浓度；S S聚丙烯酰 r od法 d D-

健康成年清} S吉级 D大鼠 4 8只 (州中医药广大学实验动物中心提供 )体质量 20— 8,随， 5 20g机分成 4组：照组 (对 C组 )内毒素组

( P, L S组 ),低剂量牛珀至宝微丸预处理组 ( D组 )高剂量 L、牛珀至宝微丸预处理组 ( HD组 )。12药物预处理与模型制备 .

胺凝胶电泳分离胶和浓缩胶；用半干式蛋白质采电转移。电泳结束后，蛋白从凝胶转移至聚偏将二氟乙烯 ( V F膜。室温震荡封闭 1h后， PD) 加入

1 0:1 0兔抗大鼠的 T F1多克隆抗体孵育， 0 G 1 3 4 c过夜。将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育【=1h B 。T S洗 3次后， CP N T显色。用 K d k B I/ B aa

d i l c neD扫描及分析系统分析膜上蛋白 it i cl ga S e 5m, L按 5m/0灌胃， D组以牛珀至宝条带积分吸光度。 em, g 10g/ H微丸悬溶液含生药量 1/ L, 1/ 0 1 34 T F 1 0ms m按 0ms 10 g . . G - 1的免疫组化检测：聚甲醛固定 3多灌胃， 2组以 1m/0生理盐水灌胃，天的左中肺石蜡包埋切片后，加 1 10兔抗鼠余 L 10g每滴： 5 2次，连续灌胃 5d后进行实验。 T F1 G一1多克隆抗体 (国 SnaCu iehoo 3美 at rz o cnl bt—采用腹腔+气管内注射内毒素法复制模型， g司 ) 4℃过夜。二抗为生物素化的抗鼠 y公，大鼠于实验前 1 2h禁食，自由饮水，在第 1 3 5、、 IG,后过程按 S B g其 A C试剂盒 (京中山生物技北天经腹腔注射 1% ( V)合氯醛 ( . E 术公司产品公司 )明进行，D B显色。用 H I 0 W/水 0 3m/说 A P— A20 G—1的表 k) g麻醉，全身麻醉后仰卧于实验台上，固定头部 S -00型全自动图像分析仪分析 T F 及四肢，经腹腔注射入 L S1m/ g消毒颈部皮达与定位。 P gk, 肤，开并充分暴露气管，切明视下由气管一次性注 13 5 V nG eo . . a i n法检测胶原纤维： s石蜡切片脱入 L S2mgk,药完毕后缝合皮肤，大鼠直蜡至水后， We e氏苏木素染 1 2 i,流 P / g注将用 ir gt 0~ 0m n立、旋转，量使药液在肺内均匀分布；C组以等水冲洗 1 n用 V nG eo尽

0mi, a isn氏液染 1mi倾去 n,量生理盐水代替药物注射。于实验第 6天处死各染液， 9%乙醇快速分化，水酒精脱水，甲用 5无二组尚存活的大鼠，胸结扎左主支气管，开取左上肺苯透明，中性树胶封固。 1 4统计学处理 .组织迅速置于一10。氮中保存备测蛋白， 8 C液取左中肺置体积分数为 1%的多聚甲醛中固定备 0各组数据以 (±S表示，用 S S 7 0统 )采 PS1.作 HE染色和免疫组化，左下肺钡定肺湿/取 0干重计软件行单因素方差分析 ( N V及 LD检 A O A) S量比( D) W/。验。P< .5为差异有显著统计学意义。 00L D组预先以牛珀至宝微丸悬溶液含生药量13观察指标与测定方法 .

①肺毛细血管通透性和 W/ D测定：肺血管通透性测定采用伊文思蓝法 ( B) E:动物处死前经颈静脉注入 2伊文思蓝溶液 2 m/ g% g k,处死动物取右肺测定肺毛细血管通透性。称重后放入

2结果与分析2 1各组大鼠肺血管通透性的变化 .

与 C组比较，P L S组、中药组的 E两 B和 W/ D值均明显增高 ( P<0 0 ) . 1;与 L S组比较，中 P两

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第1 6卷

2 5肺组织纤维化形态学 .

一

光镜下 c组：在大支气管壁及血管周围见仅微量胶原纤维；L S组：管壁的内皮与肌层下、 P血支气管壁和肺泡隔均有大量红色胶原纤维阳性表达； D组：较多的胶原纤维表达，要分布在 L有主支气管壁的肌层和血管壁内皮下； D组：少量 H仅

的胶原纤维表达，要分布在支气管壁肌层与血主管壁的内皮下。

系列动物实验证实，珀至宝微丸对感染性休牛克大鼠的血压有稳定和升高的作用，特别在对内 毒素休克及所致肺损伤的研究中，牛珀至宝微丸对 A I着明显改善作用，机制与牛珀至宝微 L起其丸降低 N—B的表达，少 MD S D的生 FK减 A、O成¨下调 iO, N S的表达¨等有关。进一步研究发现，牛珀至宝微丸还能减少急性肺损伤早期胶原纤维的生成 I,以上研究仅关注急性肺损伤 6但 J的早期转归

,并未对 A I急性炎性反应向肺损 L从伤纤维化的病理衍变机制进行探讨。参考文献lj 1 G oj hoW a,Z a X,X eF S e a.E r d iirt n o u ,t t ay amns ai f l t o p o o l r e t a a s e d tx— d c d a uel n nuy rp f o cs gi t n o i i u e c t u g ijr opt n onni as b n i ii g t eTGF- ea ma 2 d p n e t a h y n r t y ih b tn h t l d e e d n t wa b S p

3讨

论

急性肺损伤 ( L) A I是多器官功能障碍综合征 ( D) MO S在肺部的表现，染是 A I主要诱因，感 L的 其本质是一种由内毒素直接或间接损伤肺毛细血管内皮细胞，而导致内皮细胞功能障碍，毛细从肺血管通透性增高的血管渗漏综合征 J L包括。A I炎症渗出期、殖期及纤维化期 3个病理分期。增 目前国内外研究多集中在早期的炎症反应，而对 A I急性炎性反应向肺损伤纤维化的病理衍变 L从过程较少关注。新近研究表明， A I期既有在 L早

[] n a mao eer 2 1 5 ( ) 4 1 J .If m t nR sac 00, 9 7, 9 . l i h, []徐少群， 2曾索冰，巨，高等.内毒素所致肺损伤纤维化时转化生长因子一 l S a2信号通路的变化[] 6/m d J .广东医学， 02, 3 2:15 21 3 () 8.

[] 3

Pt t ,Gi ts JD, esr, t 1 T FBi aci— ie JF rfh M t f i G i T e . G - s ri e a t c1m da ro ct ln nuy J .JCi n et 2 0; a eit faue u gi r[] l Ivs, 0 1 o j n1 7:1 3 0 5 7.

炎症反应，时又有纤维组织增生及修复，3种同

[]黎晖， 4杜少辉，李伊为，等.牛珀至宝微丸对内毒素休克鼠肺损伤 N S表达的影响[] O J .广州中医药大学学报，20 1 (: 0 . 02, 9 4) 35

病变共存，以完全区分。难 在启动和调控肺血管通透性和肺损伤纤维化的细胞因子网络中，已经证实 T F 6 G . 1起到关键

性作用。T F 6既是炎性细胞的趋化剂，是成 G一1也纤维细胞产生细胞外基质成分的促进剂，组织在

5]杜少辉， 黄彬，陈东风，等.牛珀至宝微丸对内毒素休克大鼠脑诱导型一氧化氮合酶表达的影响[] J .中国中西医结合急救杂志， 04 12: 7 2 0,1 ( ) 7 . []黎晖， 6李春，杜少辉，等.牛珀至宝微丸影响内毒素休克大鼠急性肺损伤胶原纤维的表达[] J .广东医学，2 0 05,2 ( ) 16 6 2: 5.

的发生、育及损伤后修复过程中发挥重要作发用。肺内许多细胞都能分泌 T FB, G .1如肺泡巨噬细胞、成纤维细胞、皮细胞和内皮细胞等。上 而 T F8是与纤维化关系最为密切的亚型， G一l可促进某些细胞如成纤维细胞的分化、生长与增殖；

[] SerSN,K e , if gC, t 1 f cso I M—n 7 t h nl I Wes o e .Ef t f G a s s l a e 6 h d o u in n o y r h n ce r e t p i u ci n, c e s l to o p lmo p o u la n ur h l n to o f

bce a cern e n u ghs l y i e dt e a J . at l l ac,adln ioo n n o xmi[] i r a t g oS ok 2 0, 9 2:17 hc, 0 8 2 ( ) 6 .[ G oJ egB X,Z o,e a.Po ci feso a 8] a,Zn huLJ t 1 ret eeet f t v e t am n wt pooo o nooi— dcdaueln jr r te t i rpf ne dt ni u e ct u giuy e h l x n n

通过选择性抑制胶原酶合成，胶原蛋白降解减使少， C沉积¨ EM。本研究结果表明，常大鼠肺正组织 T F6 G一 1的表达非常低。在内毒素刺激下肺组织 T F B表达明显上调，时肺毛细血管通 G—l同

i a[] r n et, 0 4 9 ( ) 27 nrt J .B A as 2 0, 2 2: 7 . s J h[]王丽.急性呼吸窘迫综合征早期肺纤维化的研究进展 9[] J .国外医学：呼吸系统分册， 0 3, 3 1: 0 20 2 ( ) 5 .[0] A￣bl g D tr,B

sgi 1 x iaaL, o aaotM,e a.T eae t f c il oJ i t 1 h r ui e et p c f o e t eihbt f G— np lo ay boi[] y f p pi iir0T Fpo um nr rs J .c - a d n o i f st ie 2 1 1 2 ) 4 . o n . 0 0, 2(2: 3 k

[ 1 H l M C, o n Waes 1 j al Y ugD A, tr JG,e a.T ecmprt e t 1 h o aav ir l fa tv trp e n 1 a d S d fc os i h e u ai n o o e o c ia o mt i n ma a tr n t e r g lto fT mp 1 n MMP一 g n x r s in y ta so mi g g o h i - a d 1 e e e p e so b r n fr n r wt

透性明显增高，纤维化程度严重。提示 T F6肺 G一1蛋白在正常情况下是处于非激活状态， P L S刺激后能激活该蛋白，而导致肺毛细血管通透性增从加和早期的肺损伤纤维化。 有关中医药防治内毒素所致 A I MO S的 L、 D

fc rbt 1 J .JBo C e 2 0, 7 (2) 13 4 at—e [] i hm, 0 3 2 8 1: 0 0 . o a l[2王本芙.中医药抗内毒素损伤的研究[] 1] J .中国中西医结合急救杂志， 02, 1 1 2 0 9: 2 . [3张赛霞，黎晖， 1]邓汝东，等.牛珀至宝微丸对内毒素休克肺组织核转录因子 B表达的调控[] K J .解剖学研究，2 0, 9 4) 27 07 2 (:4 .

潜力和优势正日益受到关注 l 1。牛珀至宝微丸

是根据清代何廉臣《重订广温热论》所载犀珀至宝丹而化裁，方是在中医“本三宝”之一的至宝丹基础上增加了通瘀开窍、辟秽化浊的功能，且为并

[4廖欣， 1]杨爱莲，杜少辉，牛珀至宝微丸对内毒素急性等.肺损伤 M A和 S D的影响[]深圳中西医结合杂志， D O J.2 0,1 (: 9 . 0 6 6 4) 16

了使其更有利于体内吸收而改为微丸剂型。近年

[ 5周健洪，陈东风， 1]杜少辉，等.牛珀至宝微丸对内毒素休克大鼠脑神经型一氧化氮合酶表达的影响[] J .中西医结合学报

, 0 5, ( ) 1 . 20 3 2:l5

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