人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞

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经验交流

人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞

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李海红!，，付小兵!，张庆红&，周,岗!，孙同柱!

（!-解放军总医院’"%临床部全军创伤修复重点实验室，北京,!"""’(；&-郧阳医学院附属太和医院，湖北十堰,%%&"""）,探讨人骨髓间充质干细胞（/0123）体外分离培,,摘要：

养、鉴定以及分化。认为/0123在体外很容易分离培养和扩增，成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为脂肪细胞。

表达阴性；流式细胞仪示2B%%阳性率为*#-)%>，2B’%为"-!!>。细胞周期检测显示第’代/0123中."@.!期的细1O.&O0期占#-%)>，第!"代中."@.!期胞占#"-+%>，

关键词：人骨髓间充质干细胞；分离培养；脂肪细胞中图分类号：4’&#-&,,文献标识码：5

骨髓中存在着一类被称为间充质干细胞（673789/:6;<3=7697<<3，0123）的非造血干细胞，这些细胞具有强大的多向分化潜能，特别是跨胚层分化能力，且0123来源丰富、分离培养简单、具有高度增殖能力。笔者就人间充质干细胞的分离、培养和诱导分化作一探讨。

材料与方法

4,实验方法,无菌条件下穿刺正常人髂后上嵴，抽取骨髓约&6<，

采用直接贴壁法，以含!">胎牛血清、青霉素（!""?@6<）和链霉素（!""!A@6<）的B0C0@D!&为培养液（即/0E123培养液），在’(F、体积分数+>2G&，饱和湿度的孵育箱内培养，&%小时后更换培养基，弃掉未贴壁细胞，以后每&H’天换液!次。待细胞达*">融合时，用"-&+>的胰蛋白酶’(F消化，加入上述/0123培养液，按!I’比例传代培养。分别用免疫细胞化学法和流式细胞仪法对/0123的表面标记进行检测，同时检测第’代和第!"代/0123的细胞周期。第!"代/0123达*">H#">融合后，行定向脂肪诱导，试验组加入JEB0C0诱导液（含!">胎牛血清，!""?@6<青霉素，!""!A@6<链霉素，!!6K<@L地塞米松，!"!A@6<胰岛素，"-+66K<@LM50N，对照组加入JEB0C0培养液（含!">胎牛血清，!""?@6<青霉素，!""!A@6<链霉素），每&H’天换液!次。分别在培养第!和第&周行油红“G”染色，苏木素复染。

5,结果,采用直接贴壁法培养/0123，&%小时后可观察到培养的上清中有很多的漂浮细胞及少量贴壁细胞，根据形态的不同，贴壁细胞可分为’种：小圆细胞、星形细胞和梭形细胞（即/0123）。贴壁细胞前&H’天生长缓慢，之后迅速增殖，且以梭形细胞占优势，(天左右达融合。通过间断摇动培养瓶，可使骨髓血中大量的红细胞、白细胞等漂浮细胞与贴壁细胞分离。由于梭形细胞的优势生长，第’代时，几乎全为梭形细胞，随着传代次数的增加，/0123变得宽大扁平，。第’代培养的细胞免疫细胞化学示/01232B%%和2B!"+表达阳性，但2B!"+的强度弱于2B%%的强度，2B’%基金项目：国家重点基础研究发展规划资助项目（.!###"+%&"%）,,,,,国家自然科学基金（’"!("#))，’"&’"’("）,,,,,国家杰出青年基金（’#+&+"&%）

收稿日期：万方数据&""+$"!$!"；修回日期：&""+$"#$"%

的细胞占(*-)&>，1O.&O0期占&!-’*>为，提示绝大部分细胞处于静止态，少部分处于功能态。第!"代/0123加入脂肪诱导剂后，诱导第!周油红“G”染色见胞质中有许多红染的细小颗粒，第&周胞质中红染颗粒聚集增大，脂滴聚集达高峰。诱导时间延长达%周以上，脂肪细胞因从基质脱离而死亡。

讨,论

0123存在于骨髓基质中，对骨髓中的造血干细胞起支持作用，骨髓中的0123含量极少，约占骨髓中有核细胞的"-""!>H"-"!>，但由于012很容易分离纯化和扩增，并且具有多能性而使其成为理想的干细胞来源。

目前，尚未发现0123的特异性标志，而是借用间充质细胞、内皮细胞、上皮细胞和肌细胞的特点，0123的表面标志主要有黏附分子、生长因子和细胞因子、生长因子受体和细胞因子受体、整合素等，尤其是强表达2B%%———多种配体的受体，但不表达典型的造血干细胞抗原2B%+、2B’%和

2B!%［’］

。本研究培养的/0123免疫细胞化学示2B%%和

2B!"+表达阳性，但2B!"+的强度弱于2B%%的强度，2B’%表达阴性，流式细胞仪示2B%%阳性率为*#-)%>，2B’%为"-!!>，符合0123的基本特征标志。细胞周期检测显示第’代/0123中."@.!期的细胞占#"-+%>，1O.&O0期占#-%)>，第!"代中."@.!期的细胞占(*-)&>，1O.&O0期占&!-’*>为，提示绝大部分细胞处于静止态，保留自我更新、增殖和分化能力，少部分处于功能态。

为了诱导/0123向脂肪细胞分化，我们选择了含!E甲基E’E异丁基E黄嘌呤（M50N）、地塞米松、胰岛素、和牛血清的培养基，用油红染色证实获得大量的脂滴，在诱导!周时就可检测到脂滴，&周时脂滴聚集达高峰，诱导时间延长达%周以上，因脂肪细胞从培养瓶脱落而死亡。/0123向脂肪细胞分化的具体机制尚不清楚，PQKR7<等用4PES24方法分析发现基础培养条件下的0123表达脂肪细胞特异性的转录活性基因：脂蛋白脂酶、;S&以及参与控制脂肪分化的转录因子2@C5S"和SST4#!，诱导’周时，细胞表达成熟脂肪细胞的其它标志：SST4#&（SST4#的另一剪接同工型）和脂素。未分化的细胞表达许多种系特异性的转录活性基因，可能是从广泛干细胞室来源的细胞，在不同的分化能力间波动，当给予一定的条件刺激时，就向特定的终末细胞分化，这是细胞具有可塑性的基础，也是012的主要特性。

（本文编辑：章洛秋）

人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞

作者：作者单位：

李海红， 付小兵， 张庆红， 周岗， 孙同柱

李海红(解放军总医院304临床部全军创伤修复重点实验室,北京,100037;郧阳医学院附属太和医院,湖北,十堰,442000)， 付小兵,周岗,孙同柱(解放军总医院304临床部全军创伤修复重点实验室,北京,100037)， 张庆红(郧阳医学院附属太和医院,湖北,十堰,442000)创伤外科杂志

JOURNAL OF TRAUMATIC SURGERY2006，8(1)1次

刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

相似文献(10条)

1.期刊论文 李海红.付小兵.周岗.白晓东.陈伟.朱国俊.蔡存良.孙同柱 人骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定及标记 -创伤外科杂志2005,7(4)

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养、鉴定和标记的方法以及生物学特性.方法无菌条件下穿刺人髂后上嵴抽取骨髓,采用直接贴壁法分离纯化hMSCs,体外扩增,用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的hMSCs进行鉴定,同时检测第3代和同代溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2'-deoxyuridine,BrdU)标记的hMSCs细胞周期.结果体外培养的原代hMSCs在培养24小时内可见少量贴壁细胞,7天达到融合,免疫细胞化学示CD44和CD105表达阳性,CD34表达阴性,流式细胞仪示CD44阳性率为89.64%,CD34为0.11%.大部分hMSCs核抗BrdU染色阳性,阳性率达90%.细胞周期显示第3代和同代BrdU标记的hMSCs约有90%的细胞处于G0/G1期,第10代为80%.结论 hMSCs在体外很容易分离培养和扩增,但随着传代次数的增加,hMSCs变得宽大扁平且增殖速度减慢,出现衰老现象;用BrdU标记hMSCs对其细胞周期无明显影响,可作为标记细胞的一种有效手段.

2.学位论文 郭新 人骨髓间充质干细胞体外分离培养和向内皮细胞诱导分化的研究 2003

该实验从人骨髓中分离纯化MSCs,采用联合鉴定和反向证明法,确定为高度同源细胞群.体外联合应用生长因子和不同细胞外基质,对其进行内皮诱导分化.采用免疫组化、细胞化学、免疫荧光、电镜、流式细胞分析及RT-PCR技术,在蛋白及核酸水平检测其分化标志,探讨其分化机制.结果显示,诱导分化后的细胞群为hMSCs和EPC之间的过渡细胞类型,具有内皮分化趋势,由此类型细胞再分化为内皮细胞.hMSCs的内皮诱导分化受局部微环境(细胞外基质ECM和生长因子)——干细胞小生境影响,ECM-整合素受体和生长因子-受体之间相互作用,调控hMSCs分化.该研究首次系统地探讨hMSCs的最适内皮分化条件,为将来体外大量产生内皮细胞提供实验依据,并为最终应用于缺血性疾病治疗,促进组织工程化器官的血管再生,达到微血管替代治疗目的,提供重要的实验和理论基础.

3.会议论文 王忠.高毅.汪艳.潘明新 人骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 2007

目的:建立一种简便可行的人骨髓间充质干细胞的体外培养扩增方法，并就人骨髓间充质干细胞的表型、细胞周期、生长曲线、超微结构、核型等方面进行初步鉴定.

方法:应用密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞，条件培养基培养.相差显微镜下观察HMSCs形态学变化；流式细胞仪检测HMSCs的表面标记以及细胞周期；绘制HMSCs的生长曲线，计算细胞倍增时间；扫描电镜和透射电镜观察HMSCs的超微结构；Giemsa染色检测HMSCs的细胞核型.

结果:密度梯度离心法能分离出纯度较高的HMSCs.HMSCs贴壁生长，以长梭形为主.细胞存活率均大于95%.流式细胞仪检测HMSCs CD29、CD34、CD44、CD45、CD71、CD105、CD166、HLA-ABC、HLA-DR、UEA-1阳性表达细胞比率分别为95.3%、1.8%、94.7%、0.8%、96.2%、96.6%、92.7%、96.3%、1.1%、98.7%.HMSCs的生长曲线呈S形，在传代7代之前具有较好的生长特性.超微结构显示HMSCs表面较多突起，孔隙较多，胞质丰富，粗面内质网发达，囊腔扩张，可见大量蛋白分泌物.核

4.期刊论文 王忠.高毅.汪艳.潘明新.WANG Zhong.GAO Yi.WANG Yan.PAN Ming-xin 人骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 -中华神经医学杂志2006,5(10)

目的 建立一种简便可行的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的体外培养扩增方法,并就hBMSCs的表型、细胞周期、生长曲线、超微结构、核型等方面进行初步鉴定.方法 应用密度梯度离心法分离hBMSCs,条件培养基培养.相差显微镜下观察hBMSCs形态学变化;流式细胞仪检测hBMSCs的表面标记以及细胞周期;绘制hBMSCs的生长曲线,计算细胞倍增时间;扫描电镜和透射电镜观察hBMSCs的超微结构;Giemsa染色检测hBMSCs的细胞核型.结果 密度梯度离心法能分离出纯度较高的hBMSCs.hBMSCs贴壁生长,以长梭形为主.细胞存活率均大于95%.流式细胞仪检测hBMSCsCD29、CD34、CD44、CD45、CD71、CD105、

CD166、HLA-ABC、HLA-DR、UEA-1阳性表达细胞比率分别为95.3%、1.8%、94.7%、0.8%、96.2%、96.6%、92.7%、96.3%、1.1%、98.7%.hBMSCs的生长曲线呈S形,在传代7代之前具有较好的生长特性.超微结构显示hBMSCs表面较多突起,孔隙较多,胞质丰富,粗面内质网发达,囊腔扩张,可见大量蛋白分泌物.核型分析显示第3、6代hBMSCs的染色体数量和形态均未发生变化.结论 应用密度梯度离心法可得到纯度较高的hBMSCs,能表达hBMSCs的表型特征.hBMSCs能在体外较长期培养,细胞染色体数目未发生改变.

5.学位论文 杨志刚 人骨髓间充质干细胞的分离培养和诱导分化为神经元样细胞的研究 2006

目的：探索成人骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化为神经元样细胞的体外条件。

方法：采用Ficoll淋巴细胞分离液(1.077g／m1)密度梯度离心法从人的骨髓中分离出骨髓间充质干细胞进行体外扩增。收集第2代细胞流式细胞仪检测MSCs表面标志。逐渐加入EGF、BME和ATRA诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学法鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。

结果：流式细胞仪检测结果显示培养后的MSCs强表达CD29;较强表达CD44、CDl 66和CDl05；不表达CD45、CD34和HLA-DR。诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示78％的细胞NSE表达阳性；大约51％细胞Nsetin表达阳性；所有细胞GFAP均阴性表达。 结论：成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。

6.期刊论文 张向荣.郭光华.刘德伍.彭燕.Zhang Xiang-rong.Guo Guang-hua.Liu De-wu.Peng Yan 人骨髓间充质干细胞的分离培养及BrdU标记鉴定 -中国组织工程研究与临床康复2009,13(19)

背景:骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的细胞及基因治疗的靶细胞.目的:拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记骨髓间充质干细胞的方法.设计、时间和地点:开放性实验,于2008-03/05在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的住院患者,无血液系统疾病和家族遗传病史,由南昌大学第一附属医院提供.方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用BrdU标记.主要观察指标:相差显微镜下观察人骨髓间充质干细胞的形态变化;流式细胞仪检测入骨髓间充质干细胞的表面标记以及细胞周期:绘制人骨髓间充质干细胞生长曲线;透射电镜观察人骨髓间充质干细胞的超微结构.结果:密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的人骨髓间充质干细胞.流式细胞仪检测入骨髓间充质干细胞CD90,CD29,CD44,CD34,CD45阳性细胞表达分别为98.48%,98.74%,97.41%.0.36%,0.64%.人骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形.透射电镜可见人骨髓间充质干细胞胞质丰富,粗面内质网发达,大量蛋白分泌物.免疫组织化学检测BrdU标记48 h后人骨髓间充质干细胞标记率80%.结论:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养相结合,以获得纯度较高和活性骨髓间充质干细胞,是简便可行的方法:BrdU是一种简单、有效的标记骨髓间充质干细胞的方法.

7.期刊论文 郭希民.王常勇.王永红.段翠密.赵强.孙大铭 人骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞定向分化的实验研究 -中华口腔医学杂志2003,38(1)

目的探讨人骨髓间充质干细胞体外分离培养和向软骨细胞定向分化的条件,为髁突软骨组织工程提供种子细胞.方法采用 Percoll 分离液,根据细胞密度梯度原理,从健康人骨髓组织中分离骨髓间充质干细胞,对所获得的细胞进行体外培养和表面标志的流式细胞仪分析.对经过鉴定证实的骨髓间充质干细胞用含胰岛素、转铁蛋白、丙酮酸、地塞米松和 TGF-β的诱导培养基处理7～14 d.对诱导细胞进行蕃红花 O-亮绿染色和Ⅱ型胶原染色,鉴定诱导后细胞的软骨细胞表型.结果培养的人骨髓间充质干细胞均一表达 CD29、CD44,而 CD34、CD45 和 HLA-DR 呈阴性.细胞经过诱导液作用 14 d 后,蕃红花O-亮绿染色和Ⅱ型胶原染色阳性.结论采用比重为1073 g/L 的 Percoll能分离获得高纯度的人骨髓间充质干细胞 (纯度大于95%).该细胞经诱导液作用,可定向分化为软骨细胞.

8.学位论文 杨博 人骨髓间充质干细胞体外的分离培养及在血管紧张素Ⅱ诱导下向心肌样细胞分化的研究 2008

目的：

心肌细胞丢失、瘢痕形成及心室重构是造成心脏功能恶化的主要因素，也是最终导致慢性充血性心力衰竭的主要病理基础。细胞移植治疗是治疗心脏疾病的一种新策略。骨髓间充质干细胞(BMSCs)目前被认为是细胞移植治疗最理想的种子细胞。研究BMSCs体外定向分化为心肌样细胞对细胞移植治疗心脏疾病具有重要的理论和临床意义。

本课题旨在通过血管紧张素II化学诱导等方法体外诱导BMSCs定向分化，检测BMSCs是否可分化为心肌样细胞，观察血管紧张素II对BMSCs生长增殖的影响，对BMSCs分化的可能机制作一探讨。本研究以人骨髓间充质干细胞为研究对象，实验分为两部分，第一、体外分离、纯化、传代人骨髓间充质干细胞(HBMMSc)。第二、血管紧张素II体外对HBMMSc向心肌样细胞的诱导分化的研究。 方法：

1.HBMMSc的分离，培养和传代及鉴定标本来源于正常人的骨髓。采用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，再利用贴壁筛选法纯化骨髓间充质干细胞后，进行原代和传代培养，并对其进行细胞生长和形态学的观察、表面抗原的鉴定。

2.HBMMScs在血管紧张素II的诱导下向心肌细胞的培养分化及心肌细胞的鉴定。收集第8代hBMMSCs，分4组为实验组3组和空白对照组。用0.1 μmol/L Ang II诱导孵育hBMMSCs 24h。通过倒置显微镜形态学观察、半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法鉴定诱导细胞是否具备心肌样细胞的形态、结构特点及是否表达心肌特异性蛋白cTnI，GATA-4，Nkx2.5。 结果：

1.hBMMScs原代培养接种24h贴壁完成，2-3天细胞呈梭形，第9天形成多个克隆，第14-16天细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显方向性，细胞排列成漩涡状。传代细胞24h内完全贴壁，伸展成梭形，开始迅速增殖，7天即铺满培养瓶底，传代细胞保持原代细胞的形态特征。随代数增加，细胞得到纯化，梭形细胞达95％以上。连续传代至P8，细胞由梭形变为平坦、宽大，分裂相减少，细胞质疏松，可见空泡。传至P10，部分细胞变成圆形，折光增强，脱壁死亡。随着传代次数的增加，克隆形成率逐渐下降，10代后无明显克隆出现。流式细胞测定分离提纯后的hBMMScs表达CD29和CD44，不表达CD34和CD45。

2.Ang II诱导的细胞第8-10d即呈棒状，第18-21d细胞为长杆状，走向便趋一致。电泳检测证实.AngII诱导的细胞第2、3、4、5周已经表达cTnI，NkKX2.5，GATA-4，并且随时间推移，蛋白表达增强。空白对照组hBMMSCs无形态变化，不表达心肌特异蛋白。 结论：

1.利用淋巴细胞液进行密度梯度离心法和贴壁筛选法，可分离纯化hBMMSCs，细胞的均一性高，是一种简单，经济有效的分离提纯hBMMSCs方法。并且扩增细胞数量足够，遗传背景稳定，可满足组织工成要求。体外分离、培养hBMMSCs具有很好的成功率及成活率。 2 Ang II在体外可诱导第8代hBMMSCs分化为心肌样细胞。

9.期刊论文 王培蕊.马学玲.王心蕊.文佳媚.陈柏竹.刘亢丁.Wang PR.Ma XL.Wang XR.Wen JM.Chen BZ.Liu KD 人骨髓间充质干细胞分离培养及血管内皮生长因子对其产生的诱导分化作用 -中国组织工程研究与临床康复2007,11(46)

目的:目前有关骨髓间充质干细胞向内皮细胞诱导分化的研究较少.本实验分离和培养人骨髓间充质干细胞,用带有VEGF165的质粒转染人骨髓间充质干细胞,探讨血管内皮生长因子对其体外诱导分化的作用.方法:实验于2005～04/2006-04在吉林大学人兽共患病教育部重点实验室完成.取成人的已排除血液系统肿瘤疾病的新鲜骨髓(自愿提供),采用Percoll梯度分离培养骨髓间充质干细胞,于倒置显微镜下观察细胞形态变化和生长情况.原代细胞培养至增殖接近融合状态时,单克隆培养法分离传代培养,扩增骨髓间充质干细胞.采用流式细胞术检测细胞免疫学表型.在原核细胞大肠杆菌DH5α中复制扩增和提取,纯化、克隆pcDNA3.0-VEGF165质粒.用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞.应用流式细胞术检测诱导后骨髓间充质干细胞免疫学表型变化.并采用免疫荧光染色鉴定转染情况,并设质粒空载和未转染的骨髓间充质干细胞为对照.结果:人骨髓间充质干细胞原代培养1周后,造血细胞消失,贴壁细胞体积增大,呈现梭形外观,有粗大的细胞突起伸出.2周后细胞融合成单层,梭形突起变长,排列有明显的方向性,细胞排列成旋涡状、网状、辐射状.流式细胞术显示,人骨髓间充质干细胞免疫学表型CD44、CD29阳性,CD34、CD31、CD45阴性.VEGF165诱导骨髓间充质干细胞后CD44表达明显降低,CD31明显升高.免疫荧光染色显示,用FITC标记后的VEGF抗体使细胞显现绿色荧光,用cy3标记的CD31抗体使细胞显现了红色荧光.结论:转染后的骨髓间充质干细胞细胞表型发生明显转变,CD31表达率明显增高,呈现典型的内皮细胞的表型特征,这说明骨髓间充质干细胞具有向内皮细胞分化的潜能.

10.期刊论文 钱寒光.赵基栋.祝建中.Qian Hanguang.Zhao Jidong.Zhu Jianzhong 人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究 -中国交通医学杂志2006,20(2)

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能.结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞.结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求.

引证文献(1条)

1.晏晓青 应用人脂肪前体细胞构建工程化脂肪组织的实验研究[学位论文]博士 2006

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