膜片钳常见问题解答讲解

膜片钳常见问题解答（一）

1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？

答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。 2. 离子通道电导的单位是什么？如何换算？

答：离子通道电导的单位是西门子（Siemens, S），旧称姆欧，即安培/伏特。常用皮西门子（pS），1pS＝10E-12 S， 1,000 pS＝1 pA/mV。

3. MultiClamp 700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output是否需要连接信号器的 ANALOG IN 接口? scaled output，raw output有什么区别?

答：Raw output为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等），scaled output为定标输出，输出的信号经过了处理。后者的灵活度大，因此多采用。目前膜片钳放大器多设有scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的ANALOG IN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用Raw output了。若你想记录两个输出，则需要将Raw output与数模转换器的另一个ANALOG IN连接。

4. 在Clampex的Edit protocol/Wave中，Step和ramp各有什么适用范围？ 答：Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。而像钠通道，其衰减非常迅速，在持续去极化的情况下，通道很快失活，无法使用ramp，另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用ramp。 5. 什么是ramp？有什么作用？

答：与步阶（step）不同，ramp在pClamp软件中表示施加给细胞的一种逐渐变化的电压或电流，称为“斜坡电压或电流”，可用于作通道I-V曲线。

膜片钳常见问题解答（二）

6. input resistance是什么意思？如何测量？

答：在电生理学中，“input resistance”指“输入膜电阻（Rin）”。全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（一般为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出Rin。膜电阻（Rm）与膜输入阻抗Rin的关系为：Rm＝4πr2 Rin，r为细胞半径。

7. 在一次电压钳全细胞记录中，是否每次一定要做电容消除、串连电阻补偿、漏减、和液接电位矫正？

答：在电压钳实验中，如果需要给予细胞电刺激来改变细胞膜电位（如超极化或去极化），则会出现膜的被动反应，产生电容电流与电阻电流，此时，前者需要用电容补偿消除，后者需要用漏减功能消除。全细胞记录中，串联电阻是必须要补偿的（至少要补偿80%），除非它很小而忽略不计。液接电位（一般在10mV左右）也需要校正，除非它很小。你可采用Clampex软件中的菜单Tools/ Junction Potential功能对其测算，然后决定是否需要校正。 8. Decay是什么意思？和inactivation有何区别?

答：Decay是“衰减”之意，inactivation是“失活”之意，但在文献中经常混用，decay也常常被说成失活，例如钙电流的衰减常被说成失活，这样用也没什么问题。但实际上，两者细分的话还是有区别的。可以将Inactivation分为稳态失活与非稳态失活。后者即Decay，是指在刺激因素（电位变化、施加药物等）持续存在下通道的失活，而稳态失活（Steady-state inactivation）一般是指将膜电位钳制在不同的水平，然后观察通道的失活情况，做出失活曲线。 9. 什么是尾电流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？

答：在离子通道的激活因素（去极化或超级化）结束时通道的关闭过程叫做去激活(Deactivation)，所记录到的电流称为尾电流（Tail current），主要反映通道的关闭特征。延迟整流性K+离子通道以及一些不同类型的Ca2+离子通道，它们的尾电流均具有电压依赖性，关闭过程呈指数分布，可用指数方程拟合而

获得通道关闭过程的时间常数。

尾电流的分析对研究电压门控性离子通道的激活、关闭、失活等动力学过程很有帮助。如研究尾电流幅度与脉冲电压的关系、脉冲电压的不同持续时间或尾电流不同的钳制电压对尾电流幅度、衰减时间常数的影响等等。通过这些研究可了解通道关闭过程中出现的不同关闭状态。药物可影响通道的关闭过程，表现为尾电流的衰减过程变快或变缓慢。

10. 如何理解steady state activation中的steady state 的意义？ 答：“steady state”是“稳态”的意思。一般通过给予细胞持续一定时间的一系列去极化（多为去极化）脉冲来激活离子通道，记录通道电流峰值，再计算岀电导G，作出G-V曲线，该曲线称为稳态激活曲线，也就是我们常说的激活曲线。

膜片钳常见问题解答（三）

11. 电极拉制程序中具体应该如何控制。在参数设定的摸索中，是否需要每次都用显微镜检测，还是另有更易操作的方法.

答：不同的拉制仪拉制参数的设置不尽相同，你需要阅读说明书，参数中主要是设定拉力（对于P-97拉制仪，只需要设置Velocity，可不用设定Pull）与温度。一般第一步拉制电极颈部，温度要比第二步高（对于P-97拉制仪，温度的设定需要先测量Ramp值），拉力不要过大，以保证颈部较短；第二步拉制尖端，一般要使温度低些，拉力大些。一般都是通过显微镜查看电极尖端，这很简单，并不复杂！最好是抛光，这样就在抛光仪显微镜下查看。注意抛光后的电极尖端开口会变小，故在拉制电极时，尖端开口要大些。检查电极还有其它方法，如“气泡数法”，也可用放大器通过测量电阻来查看。

12. Rm＝4πr2Rin？似乎Rin是一个用细胞大小标化的膜电阻，那为什么不用电容Cm来标化而用这个什么4πr2？细胞形状各异，Cm是个公认的膜面积的指标，电流密度不就是用Cm标化的吗？盼回答，同时希望能将Rin的意义再多讲一点，谢谢

答：（1）一定要注意不要拘泥于Rm和Rin这两个符号，文献中常混用，但实际上表示的大多是Rin。通常我们所说的“膜电阻”是指“膜输入阻抗Rin”，但也有人用来指Rm。（2）你可以用Cm来计算膜面积，实际上这也正是我们的

做法，用来估算细胞大小，用于对通道电流幅度进行标化，但我们从来不用它计算膜电阻Rm（也称为“固有膜电阻”）。Rm的计算公式是数学理论上的，并没有多少应用的价值，我们很少发现有使用Rm的（虽然符号用Rm）。（3）实际上，Rin反映的当然就是膜电阻，它被称为膜输入阻抗（或膜输入电阻），也时常被称为“膜电阻”（这正是使人们产生混淆的原因！），是膜的被动反应参数之一。所谓被动反应是指膜上离子通道没有开放时，膜所表现出的电缆特性。膜的被动反应参数还包括膜电容、轴浆电阻等。全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（多为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律可求出Rin。当大量离子通道开放时，膜对电流的阻力急剧降低，测试脉冲电压与通道电流之间不满足欧姆定律，无法测量Rin，也没有了测量的意义。

13. 请教什么是Channel availability？

答：Channel availability指在排除失活情况下，能够开放的某通道的多少，通过全细胞电流幅度的大小来反映。例如，海马神经元Na通道的channel availability可因乙酰胆碱M受体的激活而降低，表现为Na通道电流幅度的降低。

14. 什么是window current，我知道是激活曲线和失活曲线的重叠。但是我有一个疑问，比如电压依赖的T型钙通道，书上说在windonw current的时候有持续性的钙内流，但是T性钙通道不是有时间依赖性的失活吗？怎么会有不失活的电流呢？

答：如果将通道的稳态激活曲线与失活曲线作在一个图上，则激活曲线与失活曲线之间交叉部分的电流就是window current，在这个电压范围内，有一些通道并没有完全失活，仍能被打开，有一定的开放概率。T性钙通道是有时间依赖性的失活，但还有很小的部分失活非常缓慢，此即window current，它是一些快速失活通道的动力学特征。对于T型钙通道，其window current维持了一个紧张性去极化，对动作电位的连续发放产生影响，当然，不同细胞中的T通道其作用不尽相同。

15. 使用Clampex 8.0记录配体门控离子通道电流，protocol 如何设置? 答：需要事先在Lab Bench中设定好Channel序号和Signal名称。在Edit

Protocol中选择Gap-free模式，采样频率可用5kHz，选好Input和Output。先在Clampex中启动记录（Record），然后诱发电流，可用Time Tag作诱发标记。

膜片钳常见问题解答（四）

16. 电极内液中加入1mmol/L的EGTA和10mmol/L的EGTA有什么区别? 答：EGTA一般用10 mM左右（1 mM太低），促进封接，鳌和内钙。 17. 什么是漏电流，为什么要做Leak subtraction？

答：漏电流的概念比较混乱，可以指封接电流（封接时从封接处“漏掉”的电流），也可指放大器的系统偏差，还可指膜漏电流。一般来讲，膜漏电流是细胞膜的被动反应电流，是非离子通道电流，因此在记录离子通道电流时要将它去除。膜片钳放大器与采样分析软件都具有将其去除的漏减功能。

18. 请问动作电位是否一定要有越过0的超射，我在一篇文献中看到作者将一个没有超射的电位变化也称为动作电位，我觉得不对，应该是阈下反应才对吧？但又不敢下结论，觉得国外文献不该出错。

答：一般生理情况下动作电位都含有超射，超射与Na离子（或Ca离子）的平衡电位有关。但在具体实验中（或某些病理情况下），若细胞内外液的Na离子（或Ca离子）的浓度发生变化，则Na离子（或Ca离子）的平衡电位也随之变化，就可能不产生超射或超射值更大。

19. 我想请教一下为什么我们用培养的大鼠海马神经元记录NMDA电流，总是会出现电流的衰减，而且我们记录是选择的培养第10-14天的大鼠，可是电流大小不等，具体在100-1500pA间波动，这让我们很疑惑，注明一下，电极内液中我们用了CsCl和ATP、GTP。

答：电流大小不等与细胞大小、细胞状态等都有关，另外更重要的可能与你的给药方法有关，不知你采用的是哪种给药方法？正常情况下，连续诱发受体电流会存在失敏，表现为电流的衰减（幅度减小），但如果在记录过程中细胞状态逐渐不好，也会出现这种情况。我们认为你所选用的细胞培龄没有问题，内液也没问题。

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