微量肉汤稀释法药敏检测法

微量肉汤稀释法药敏检测

以下实验方法主要适用于需氧菌及部分兼性厌氧菌（以大肠杆菌为例），微需养菌和厌氧菌的培养条件亟待摸索。本实验方法，虽然操作较为繁琐，但是能够确切的得到细菌临床分离株对某种抗菌药物的MIC值，以此作为临床用药指导的部分依据。 菌悬液的制备：

① 菌液培养：取待测菌保存液10μL加入1mLMH肉汤（可根据实际需要做调整），置37℃温箱过夜静止培养12小时左右；

② OD600值测定：利用紫外分光光度仪测定OD值，MH肉汤调整菌液浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间，此时菌液浓度约10cfu/mL（大约需将培养菌液稀释7-10倍左右）； ③ 上样菌液稀释：将待测菌液在步骤②所得稀释倍数的基础上再稀释1000倍，此时菌液浓度约10cfu/mL（即7000-10,000倍），此时的菌液即为上样菌悬液； 注意：测定OD值所需菌液应在超净台中无菌取样，剩余菌液还需实验。 抗菌药物的制备：

抗生素母液配制：参照NCCLS标准上抗菌药物相应的R（抗药）值制备待测抗菌药物（母液浓度要远远大于R值，至少160倍），分装于无菌小管置-20℃备用（附件一.常用抗生素溶液的配制）。

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注意：无菌操作，抗菌药物的稀释液均需灭菌，溶解后还应过滤（滤膜孔径为0.22μm） 药敏试验的操作：

① 将待测抗菌药物进行10倍稀释；

② 无菌96孔板第1-11列加入灭菌MH肉汤100μL（一药一板）；

③ 无菌96孔板第1列加入10倍稀释的药液100μL，逐次倍比稀释至第11列（每孔液体终体积是100μL）；

④ 无菌96孔板的每一孔加入待测菌液100μL，每孔液体终体积是200μL（由于整板都是一种药物，所以96孔板的每一行可进行一种细菌的药敏试验，为了保证实验的可靠性，每株菌进行一次重复，即一株菌做两行，一块板可做四株细菌的药敏试验）；

⑤ 无菌96孔板的第12列上4孔加入200μL/孔灭菌MH肉汤作为阴性对照，第12列下4孔加入200μL/孔菌液（四株菌的菌液）作为阳性对照；

⑥ 药物和菌液上样完毕后，盖好板盖，置37℃温箱培养18-22小时观察结果（结果的判读请参照附件二. 2009年NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准）。 注意：无菌操作。 96点阵法药敏检测（大通量的药物敏感性检测实验）

以下实验方法主要适用于需氧菌及部分兼性厌氧菌（以大肠杆菌为例），微需养菌和厌氧菌的培养条件亟待摸索。该方法能够快速得到某种抗菌药物对细菌临床分离株的作用，抗药还是敏感，以此作为临床用药指导的部分依据。 菌悬液的制备：

① 菌液培养：无菌96孔板培养96株待测菌株（每一孔对应一株菌），每孔含有灭菌MH肉汤200μL，待测菌株保存液5μL，置37℃温箱过夜静止培养12小时左右；

② 上样菌液稀释：将过夜培养所得菌液稀释1000倍（使用无菌96孔板分三次进行稀释，每次稀释10倍，最后一次稀释所得菌液即为上样菌悬液）； 抗菌药物的制备：

抗生素母液配制：参照NCCLS标准上抗菌药物相应的R（抗药）值制备待测抗菌药物（母液浓度要远远大于R值，至少100倍），分装于无菌小管置-20℃备用（附件一.常用抗生素溶液的配制）。 药敏试验的操作：

① 用本实验室新定制的细菌培养瓶配制MH固体培养基，定量35mL，灭菌；

② 待MH固体培养基灭菌完毕，温度降至45℃左右时，加入一定量的抗菌药物，使其终浓度为R值（R值的确定请参照附件二. 2009年NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准），混匀，倒入96点阵药敏检测板底座内，用预先灭好菌的96孔板盖进行加盖；

③ 用灭好菌的96点阵药敏检测板的锥体盖对应蘸取96孔板内已稀释好的上样菌悬液，轻轻盖在96点阵药敏检测板底座的药物培养基对应位置上；

④ 置37℃温箱培养18-22小时观察结果。如果锥体接触的培养基位置长菌，说明该菌对板内药物抗药；如果不长菌，说明该菌对板内药物敏感。

注意：①在倾倒培养基时，务必确保三个无菌，96点阵药敏检测板的底座、锥体盖及96孔板盖无菌。此外，操作时，请勿将手随便在培养基表面晃动，及时盖盖；②往培养基中加抗生素时，一定控制好培养基的温度，温度过高，药物会失效；温度过低，培养基会凝固，药物混合不均匀。

纸片扩散法药敏检测

以下实验方法主要适用于需氧菌及部分兼性厌氧菌（以大肠杆菌为例），微需养菌和厌氧菌的培养条件亟待摸索。该方法能够快速、准确地得到某种抗菌药物对细菌临床分离株的作用，抗药还是敏感，以此作为临床用药指导的部分依据。 菌悬液的制备：

① 菌液培养：取待测菌保存液10μL加入1mLMH肉汤（根据实际需要可做调整），置37℃温箱过夜静止培养12小时左右；

② 用无菌生理盐水，对照0.5麦氏比浊管矫正菌液浓度； 抗菌药物纸片和培养基的制备：

① 抗菌药物纸片可以从试剂公司直接购买，杭州天和等多家试剂公司均售（国产和进口）； ② 将灭菌MH固体培养基倒入无菌平板中，9cm平板中培养基高度约4cm； 药敏试验的操作：

① 用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在培养基表面均匀涂抹3次，每次60°，最后沿平板内缘涂抹一周；

② 平板置室温下干燥3-5分钟，用无菌镊子将药物纸片小心紧贴于培养基表面，各纸片中心相距>24mm，纸片距平板内缘>15mm，纸片贴上后不可再移动；

③ 置37℃温箱培养16-18小时观察结果（结果的判读请参照附件二. 2009年NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准）。

注意：①在涂抹菌悬液时，保证培养基表面干燥无水；②在贴药敏纸片时，一定要稳、准，不能在培养基表面来回移动，水平放置，轻轻按压即可；③药敏制片相聚不能太近，否则会影响结果的判读。

牛津杯法药敏检测

牛津杯是药学和理学实验室中常用的基础实验器材，用牛津杯法做抑菌试验要注意以下几点事项：①首先要把平板倒好，一定要平，才能保证杯内抑菌物质均匀地向四周扩散；②不要封口，常用的生物法测定抗生素采用杯碟法，“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径6nm，高10nm的圆筒形管子，管子重量尽可能相等，碟是摊布培养基的玻璃培养皿。

药敏试验操作方法（一）：

① 将已灭菌的琼脂培养基加热至完全融化，倒在培养皿内，每碟15mL（下层），待其凝固； ② 将融化的培养及冷却到50℃左右混入试验菌，将混有菌的培养基5mL加到已经凝固的培

养基上待其凝固（上层）。

③ 在培养基表面垂直放上小杯，杯中加入待检样品，加满后在37℃培养16-18小时。培养中，一方面试验菌开始生长，另一方面抗生素成球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条是最低抑菌浓度带，在带范围内，细菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”，抗生素浓度越高，抑菌圈越大。 药敏试验方法（二）：

① 在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水，对照0.5麦氏比浊管矫正菌液浓度制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密；

② 以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10 nm 的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。待放好后，分别向各小管中滴加一定数量的待测抗菌药物药液，勿使其外溢。置37℃培养8-18小时，观察结果。 ③ 将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

联合法药敏检测

体外联合药敏试验的目的在于：①扩大抗菌谱，治疗混合感染；②预防或推迟细菌抗药性的发生；③联合用药还可以计量以避免达到毒性剂量；④对某些抗药细菌引起的严重感染，联合用药比单一用药时效果更好。

抗菌药物联合应用可出现以下4种结果：①无关作用，两种药物联合作用的活性等于其单独活性；②拮抗作用，两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性；③相加作用，两种药物联合作用的活性等于两种单独抗菌活性之和；④协同作用，两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。 药敏试验方法：

棋盘稀释法是目前临床试验时常用的定量方法，利用肉汤稀释法原理，首先分别测定拟联合的抗菌药物对待测菌的MIC。根据所得MIC，确定药物稀释度（一般为6-8个稀释度），药物最高浓度为其MIC的2倍（即2MIC），依次对比稀释。两种药物的稀释分别在方阵的横列和纵裂，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。接种菌量为5×10CUF/ml，37℃孵育18-24小时后观察结果。计算部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration，FIC）指数。 计算公式及判定标准：

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注意：混合药液的稀释是很麻烦的一项操作，一定要细心！混合药液的稀释，可沿对角线依次倍比稀释！

附件一.

抗菌药物贮备液制备用溶剂和稀释剂

抗菌剂 阿米卡星Amikacin 阿莫西林Amoxicillin 氨苄西林Ampicillin 安普霉素Apramycin 阿奇霉素Azithromycin 头孢唑啉cefazolin 头孢噻呋Ceftiofur 头孢噻吩Cephalothin 头孢氨苄cephalexin 溶剂 水 磷酸缓冲液pH6.0, 0.1mol/L 磷酸缓冲液pH8.0, 0.1mol/L 95%乙醇 95%乙醇或冰乙酸 磷酸缓冲液PH6.0, 0.1mol/L 水或肉汤 磷酸缓冲液pH 6.0, 0.1mol/L 磷酸缓冲液PH6.0, 0.1mol/L 95%乙醇 水 磷酸缓冲液pH 6.0, 0.1mol/L 水 水 稀释剂 磷酸缓冲液pH6.0, 0.1mol/L 磷酸缓冲液pH6.0, 0.1mol/L 水 肉汤培养基 磷酸缓冲液PH6.0, 0.1mol/L 水或肉汤 水 水 水 磷酸缓冲液pH 6.0, 0.1mol/L 水 氯霉素Chloramphenicol 环丙沙星Ciprofloxacin 克拉维酸Clavulanic acid 克林霉素Clindamycin 硫酸黏菌素Colistina 达氟沙星danofloxacin 1/2体积水，逐滴加入1mol/L 水 NaoH 至溶解 1/2体积水，逐滴加入1mol/L 水 NaoH 至溶解 水 1/2体积水，逐滴加入1mol/L 水 NaoH 至溶解 95%乙醇或冰乙酸 95%乙醇 水 水 二氟沙星difloxacin 强力霉素doxycycline 恩诺沙星enrofloxacin 红霉素erythromycin 氟苯尼考florfenicol 氟甲喹flumequine 庆大霉素Gentamicin 卡那霉素Kanamycin 左氧氟沙星levofloxacin 麻保沙星marbofloxacin 甲氧西林methicillin 1/2体积水，逐滴加入1mol/L 水 NaoH 至溶解 水 水 1/2体积水，逐滴加入0.1mol/L NaoH 至溶解 水 1/2体积水，逐滴加入1mol/L 水 NaoH 至溶解 水 萘啶酸Nalidixic acld 呋喃妥因nitrolurantoinc 诺氟沙星Norfloxacln 新生霉素novobiocin 氧氟沙星ofloxacin 苯唑西林oxacillin 土霉素oxytetracycline 青霉素penicillin 吡利霉素pirlmycin 多粘霉素B Polymywin B 利福平Rifampin 大观霉素Spectinomycin 链霉素Streptomycin 磺胺Sulfonamides 四环素Tetracycline 替米考星Tilmicosin 甲氧苄啶Trimethoprim 万古霉素Vancomycin 1/2体积水，逐滴加入1mol/L NaoH 至溶解 磷酸缓冲液pH8.0, 0.1mol/L 1/2体积水，逐滴加入0.1mol/L NaoH 至溶解 水 1/2体积水，逐滴加入0.1mol/L NaoH 至溶解 水 100% 甲醇 水 水 水 甲醇 [最大浓度640μg/mL] 水 水 1/2 体积热水, 以最小量的2.5mol/L NaOH溶解 水 95%乙醇 0.05mol/L乳酸或盐酸, 加入量为终浓度 水 磷酸缓冲液pH8.0, 0.1mol/L 水 水 水 水 水(搅拌) 水 水 水（可能需要加热） 注意：药物不全，可以逐步补充！ 磷酸盐缓冲液的配制 母液：A：0.2 mol/L Na2HPO4溶液 B：0.2 mol/L NaH2PO4 溶液 Na2HPO4·2H2O分子量 = 358.22，0.2 mol/L溶液为71.64克/升。 NaH2PO4·2H2O分子量 = 156.03，0.2 mol/L溶液为31.21克/升. 0.1mol 磷酸缓冲液的配法：取A液x ml ,加 B 液 y ml, 稀释至200 ml PH 6.0 x=12.3ml y=87.7ml PH 8.0 x=94.7ml y=5.3ml

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