发酵技术中的补料的控制

发酵技术中的补料的控制

补料分批发酵(fed-batch culture，FBC)：

又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。 1 FBC的作用 1） 可以控制抑制性底物的浓度 高浓度营养物抑制微生物生长：

① 基质过浓使渗透压过高，细胞因脱水而死亡；

② 高浓度基质能使微生物细胞热致死(themal death)，如乙醇浓度达10％时，就可使酵母细胞热致死；

③ 有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用，如高浓度苯酚(3％～5％)可凝固蛋白；

④ 高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。

? 有的基质是合成产物必需的前体物质，浓度过高，就会影响菌体代谢或产生毒性，

使产物产量降低。如苯乙酸、丙醇(或丙酸)分别是青霉素、红霉素的前体物质，浓度过大，就会产生毒性，使抗生素产量减少。

? 有的底物溶解度小，达不到应有的浓度而影响转化率。如甾类化合物转化中，因它

们的溶解度小，使基质的浓度低，造成转化率不高。

? 采用FBC方式，可以控制适当的基质浓度，解除抑制作用，得到高浓度的产物。 2） 解除或减弱分解代谢物的阻遏

? 有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏，如葡萄糖阻抑纤维素酶、赤霉素、

青霉素等多种酶或产物的合成。通过补料来限制基质葡萄糖的浓度，就可解除酶或其产物的阻遏，提高产物产量。

? 缓慢流加葡萄糖，纤维素酶的产量几乎增加200倍；将葡萄糖浓度控制在0.02％水

平，赤霉素浓度可达905 mg／L；采用滴加葡萄糖的技术，可明显提高青霉素的发酵单位等。这都是利用发酵技术解决分解代谢物阻遏的实际应用。在植物细胞培养中，也采用该技术来提高产量。 3）可以使发酵过程最佳化

? 分批发酵动力学的研究，阐明了各个参数之间的相互关系。利用FBC技术，就可

以使菌种保持在最大生产力的状态。 ? 随着FBC补料方式的不断改进，为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。

? 随着计算机、传感器等的发展和应用，已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数

学模型在线方式实现最优化控制。

FBC的优点：

? ①解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；

? ② 避免一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学性

质； ? ③ 可提高发芽孢子的比例，控制细胞质量；

? ④ 不需要严格的无菌条件，产生菌不易老化变异，比连续发酵适用广泛。 2 补料内容

① 能源和碳源； ② 氮源；

③ 微量元素； ④ 诱导物；

3 补料的原则

原则：根据菌体生长代谢规律； 生产需要；

环境条件

方法：充足而不过量（少量多次或分批流加） 4 补糖的控制 补糖时机

? 过早，刺激生长，加速糖利用；

? 过迟，所需能量跟不上。如谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料。 判断：培养基条件，菌种，发酵状况（残糖，pH，菌形态等），在需要时加入； 举例：四环素，P203图10-14 补糖方式

? 连续流加：每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加。 ? 少量多次间歇补入 ? 大量少次补入

可与其他组分一起进行多组分补料。 以不引起发酵液成分剧烈波动为前提； 补糖量——加入与消耗平衡，维持稳定的糖浓度； 例：

a 四环素发酵还原糖维持在0.8-1.2%

b 谷氨酸追加糖液发酵：在原工艺基础上，加大接种量到10%，增加生物素用量达5μg/L，减少初糖浓度（12%——7-8%）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖液，维持2%左右的糖浓度。 优点：低浓度发酵，以利于生长和发酵；

总糖浓度达20%，产酸高。

? 补糖开始时，不但CRR、OUR大幅度提高，连RQ也提高约10％，表明通过补糖

不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提

高，产能增加。

? 发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。

5 补偿氮源及无机盐

? 流加尿素，一方面调节pH，另一方面补氮。

? 谷氨酸发酵时，初次加入尿素量和补加量取决于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力。 ? 脲酶活力低，耐尿素强，初次加入用量多2%，流加次数少

? 脲酶活力强，耐尿素低，初次加入用量少0.6%，流加以少量多次好 6 补料的控制

? 流加操作控制系统分为有反馈控制和无反馈控制两类。反馈控制系统是由传感器、

控制器和驱动器三个单元所组成。根据控制依据的指标不同，又分为直接方法和间

接方法。

? 间接方法：以溶氧、pH值、呼吸商、排气中CO2分压及代谢产物浓度等作为控制

参数。对间接方法来说，选择与过程直接相关的可检参数作为控制指标，是研究的

关键。通气发酵利用排气中CO2含量作为FBC反馈控制参数是较为常用的间接方法。

? 直接法：随着一系列技术障碍的克服，该法将会得到迅速普及。反馈控制的FBC，

常常是依据个别指标来进行，在许多情况下，并不能奏效，尚需进行多因子分析。 ? FBC还可采用“放料和补料”(withdraw and fill)方法：发酵一定时间，产生了代谢

产物后，定时放出一部分发酵液(可供提炼)，同时补充一部分新鲜营养液，并重复进行。

维持一定菌体生长速率，延长发酵产物生产期，有利于提高产物产量，降低成本。注意染菌。

? 如控制青霉素生产所用的葡萄糖流加的质量平衡法，就是利用CO2的反馈控制。它

是依靠精确测量CO2的释放率CRR和葡萄糖的流动速度，达到控制菌体的比生长速率和菌浓。

? pH值也可用作糖的流加控制的参数。 注意事项：

? 适宜料液比 ? 无菌操作

? 碳氮平衡，经济合理

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