双色双融合间期荧光原位杂交探针检测慢性髓系白血病伊马替尼治疗患者的肿瘤负荷

2010;30(1)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%南方医科大学学报(J%South%Med%Univ)

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双色双融合间期荧光原位杂交探针检测慢性髓系白血病伊马替尼治疗患者的肿瘤负荷

杜庆锋，张嵩，刘晓力，孟凡义（南方医科大学南方医院血液科，广东广州510515）

摘要：目的研究双色双融合探针间期荧光原位杂交技术(D-FISH)检测慢性髓系白血病(CML)伊马替尼治疗过程中肿瘤负荷的灵敏度、特异性。方法应用D-FISH探针对24例伊马替尼治疗获完全细胞遗传学缓解的CML患者骨髓内残留肿瘤细胞负荷进行检测，并与应用单融合探针FISH(S-FISH)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测结果的进行比较。结果与S-FISH相比，D-FISH较具有更高的灵敏度及特异性。正常对照组中D-FISH的正常分界值为0.73%，而

S-FISH为6.24%，差异具有显著性；在24例伊马替尼治疗后患者中，S-FISH检测到7例(29.2%)阳性，而D-FISH检测到13例(54.2%)阳性，且结果与RT-PCR结果高度相关。结论D-FISH%由于具有较低的假阳性率与假阴性率，可较灵敏、特

异地监测CML伊马替尼治疗过程中肿瘤细胞负荷的变化。关键词：慢性髓系白血病；荧光原位杂交；伊马替尼；肿瘤负荷

中图分类号：R733%%%%%%%%文献标识码：A%%%%%%%%文章编号：1673-4254（2010）01-0123-03

Dual-color/dual-fusioninterphasefluorescenceinsituhybridizationprobeformonitoringtumorloadduringimatinibtherapyforchronicmyeloidleukemia

DU%Qing-feng,%ZHANG%Song,%LIU%Xiao-li,%MENG%Fang-yi

Department%of%Hematology,%Nanfang%Hospital,%Southern%Medical%University,%Guangzhou%510515,%China

Abstract:ObjectiveTo%evaluate%the%sensitivity%and%specificity%of%dual-color%and%dual-fusion%interphase%fluorescence%insituhybridization%(D-FISH)%in%determining%the%tumor%load%in%patients%with%chronic%myeloid%leukemia%(CML)%receiving%imatinib%therapy.%MethodsThe%BCR-ABL%fusion%gene%was%detected%by%FISH%in%24%cases%of%chronic%myeloid%leukemia%treated%with%imatinib.%The%sensitivity%and%specificity%of%D-FISH%were%compared%with%those%of%single-fusion%FISH%(S-FISH)%and%RT-PCR.%ResultsD-FISH%was%more%sensitive%and%specific%than%S-FISH.%In%normal%control%subjects,%the%cutoff%rates%of%D-FISH%and%S-FISH%were%0.73%%and%6.24%,%respectively,%showing%a%significant%difference%between%them.%In%24%CML%cases%receiving%imatinib%treatment,%the%positivity%rates%of%S-FISH%and%D-FISH%were%7/24%(29.2%)%and%13/24%(54.2%),%respectively.%The%results%of%D-FISH%had%a%high%correlation%to%that%of%RT-PCR.%ConclusionWith%lower%false%positive%and%false%negative%results,%D-FISH%can%be%used%as%a%sensitive%and%specific%method%for%monitoring%the%changes%of%the%tumor%load%in%CML%patients%during%imatinib%treatment.

Keywords:chronic%myeloid%leukemia;%fluorescence%in%situ%hybridization;%imatinib;%tumor%load

慢性髓系白血病（chronic%myeloid%leukemia,%常因荧光信号在核空间发生重叠而造成检测结果假阳性。近来我们应用VYSIS%LSI%BCR-ABL的双色双融合探针FISH(D-FISH)对24例CML伊马替尼后患者肿瘤负荷进行了检测，现报告如下。

CML）是起源于造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，由t(9;22)(q34;q11.2)易位形成的Ph染色体及相应的BCR-ABL融合基因被普遍认为是CML发生、发展的根本原因［1］，同时它们也是CML治疗过程中，尤其

是分子靶向药物伊马替尼治疗后肿瘤负荷准确动态观察的常用肿瘤标志［2］。与其它常用检测方法如常规细胞遗传学G显带技术比较，间期荧光原位杂交

1%%资料与方法1.1%%对象

符合《血液病的诊断及疗效标准》［3］临床诊断标准的CML慢性期患者24例，男性14例，女性10例，年龄12~61岁，中位年龄39岁。所有患者均口服伊马替尼400%mg/d，根据治疗反应和造血/非造血系统毒副反应程度调整剂量为100~600%mg/d，接受治疗时间6~26月，中位治疗时间14.5个月。正常对照组10例均为淋巴瘤患者，形态学检查证实无骨髓侵犯。

(iFISH)技术因具有操作方便、简单、灵敏度高及特异

性好等优点而在临床中得到了较广泛的应用，但是目前常用的BCR-ABL双色单融合探针FISH(S-FISH)

收稿日期：2009-07-23

基金项目：广州市科技攻关重点引导项目（2006Z3-E0401）

作者简介：杜庆锋，博士，副教授，电话：020-62787876，E-mail：

dqf@

通讯作者：刘晓力，教授、博士生导师，E-mail：lxl2405@

1.2%%DNA探针及间期荧光原位杂交

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两类DNA探针均由VYSIS公司提供。(1)LSI%

结果数据用SPSS10.0统计软件包中的配对样本

BCR-ABL%D-FISH探针；(2)%LSI%BCR-ABL%S-FISH探

针。按试剂盒提供的间期荧光原位杂交操作说明进行标本处理、变性、杂交、杂交后洗脱等操作。在

t检验进行统计学处理。2%%结果

2.1%%D-FISH检测的正常分界值

正常分界值按对照组中所得阳性细胞数的(x±

NikonE600荧光显微镜下通过三色滤光块(DAPI/TRITC/FITC)观察杂交信号,%橙色(orange,%O)

信号为BCR，绿色信号(green,G)为ABL，融合信号

3SD)取值［4］。阳性细胞率大于分界值的标本我们将其

定义为异常。本研究10例正常对照组用D-FISH检测到阳性细胞率为0%~0.5%,，平均值0.25%，标准差

(fusion,F)为BCR-ABL%融合基因,背景染色质为蓝色。

通过COHU高分辨CCD进行图像摄取，用

Macprobe%410荧光图像处理系统(英国PSI公司)%进行图像分析；每份标本计数1000个细胞。

FISH结果判断标准［4］：将O信号与G信号重叠或接触时定义为F信号；(1)D-FISH：正常细胞间期核可见2O2G彼此分离的4个杂交信号，具有典型t(9;22)易位的间期核中，可见1O1G2F或2O2G1F杂交

信号;%(2)S-FISH:正常细胞间期核可见2O2G彼此分离的4个杂交信号,具有t(9;22)易位的间期核中可见

0.16%，分界值D%=0.25%±3×0.16%=0.73%；用S-FISH检测到阳性细胞率为1.8%~4.5%,平均值3.12%，标准

差1.04%，分界值S=6.24%。两类探针检测的假阳性细胞百分率用配对样本t检验进行比较，组间差异有显著性，P=0.000。

2.2%%伊马替尼后患者肿瘤细胞负荷检测

24例患者骨髓标本CCG检测结果均阴性，而S-FISH、D-FISH和RT-PCR检测结果显示(见表1)：S-FISH检测7/24(29.2%)阳性，阳性细胞率6.5%~25.4%；D-FISH检测11/24例(45.8%)阳性，阳性细胞率0.8%~24.9%，与RT-PCR结果完全一致；11例D-FISH结果阳性标本中S-FISH检测仅7例阳性。2.3%%伊马替尼的治疗时间与BCR-ABL基因检测

1O1G1F%。

1.3%%逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测

BCR-ABL%融合基因转录本按我室常规方法进

行［5］。

1.4%%统计学方法

表1%%24例CML患者伊马替尼治疗后S-FISH、D-FISH及RT-PCR检测结果

例号

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%BCR-ABL(+)%(%)性别年龄(岁)%%伊马替尼治疗时间(月)

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%S-FISH%%%%%%%D-FISH%%%%%%%%%%%%RT-PCR男男女男女男女男男女女女男男女男男女女男男男男女

%%1%%2%%3%%4%%5%%6%%7%%8%%9101112131415161718192021222324

294334281240394445514761453350205438365035372739

1113%%621161910%%9%%7%%820%%91412%%8171624%%92413192616

0.52.810.63.54.70.92.421.25.06.11.57.83.39.815.14.22.92.06.525.41.41.90.92.3

--+----+---+-++---++----

0.61.28.80.60.80.20.522.80.91.20.34.20.63.710.40.70.50.41.124.90.50.30.10.3

-++-+--+++-+-++---++----

-++-+--+++-+-++---++----

第1期杜庆锋,等.双色双融合间期荧光原位杂交探针检测慢性髓系白血病伊马替尼治疗患者的肿瘤负荷

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本组患者中，伊马替尼治疗1年内，8名BCR-ABL基因阳性，阳性率72.7%（8/11）；治疗1~2年25.0%（3/12）阳性；治疗2年以上患者仅1名，BCR-ABL基因检测结果阴性。

3%%讨论

以P210BCR-ABL为靶点的小分子抑制剂伊马替尼用于CML临床治疗取得了显著的疗效［6-7］，目前已成为CML慢性期的首选治疗药物。最近的5年随机观察发现

［8］

，553名伊马替尼治疗CML患者1年完全

遗传学反应率（complete%cytogenetic%response,%CCR）为69%，5年为87%，5年总生存率为89%，显示出伊马替尼良好的治疗前景。然而，临床观察发现，伊马替尼对于CML急变期疗效并不明显，相当一部分患者存在原发耐药；而部分慢性期患者也在治疗过程中出现继发耐药现象，其中多数很快进入急变期［9］。因此，在伊马替尼治疗中动态的监测肿瘤细胞负荷，对于指导CML患者治疗、判断预后具有重要的临床意义。

目前，能够定量监测CML伊马替尼治疗中肿瘤负荷的检测手段包括CCG、FISH和实时定量PCR%等

［10-11］

。其中，FISH因操作相对简单、检测耗时短、易于

开展等优点而在临床中成为应用广泛的定量监测肿瘤负荷的常用手段。FISH检测BCR-ABL融合基因存在一定的假阳性率，这是由于BCR和ABL荧光信号随机接触或在核空间光学重叠的结果。与S-FISH相比，应用D-FISH技术，理论上将正常核中的2O2G信号错计为1O1G2F%或2O2G1F%的阳性核的可能性非常低，因为这种情况只有在BCR与ABL信号断裂和至少1个BCR与ABL信号重叠两个条件同时满足才可能出现。在前期的研究中，我们发现D-FISH能够降低检测的假阴性率，并具有可重复性等特点。因此，D-FISH具有明显的技术优势。

本研究中，24例伊马替尼治疗后获完全细胞遗传学缓解患者，应用S-FISH和D-FISH检测分别发现7例和13例阳性，其中5例的S-FISH(-)而

D-FISH(+)患者，RT-PCR检测阳性(+)，我们判定这些患者微小残留病(MDR)阳性，故应考虑伊马替尼加量治疗。本组患者伊马替尼的治疗时间为6~26月，BCR-ABL基因检测结果提示，在此治疗期间，随着伊马替尼治疗时间的延长，BCR-ABL基因阳性率有

下降趋势，但由于病例数有限，未做进一步统计学分析。另病例20，伊马替尼治疗两年，S-FISH、D-FISH

检测均阳性，阳性细胞比例较高，预示该患者伊马替尼疗效欠佳，8个月后该患者出现伊马替尼继发耐药，疾病演进到急变期。

总之，用D-FISH技术检测CML伊马替尼治疗过程中的肿瘤细胞负荷具有有灵敏度较高、特异性较好等优点，对疗效监测、耐药分析及预后判断具有重要的意义。参考文献：

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/1e3e.html