CLSI临床质谱新标准解读

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CLSI 临床质谱标准

C62-A新内容解读

CLSI 临床质谱标准C62-A主题内容架构由基础内容部分包括（1）范围、（2）标准预防措施、（3）术语、（4）仪器；方法内容包括（5）预考察事项、（6）方法建立、（7）方法验证；质控内容包括（8）液质检验方法的质量保证与质量控制、（9）后续监督构成。其中方法和质控内容是与应用过程直接相关的。下面进行具体介绍。

5．预考察事项（preexamination considerations）

5.1目标分析物

内容包括5.1.1 外源性物质、5.1.2内源性物质、5.1.3 外源性和内源性物质的相关因素、5.1.4 样本采集。要充分了解目标分析物的性质，包含（1）目标分析物的临床意义如生理意义、临床价值、常用检测方法等；（2）理化性质如结构式、分子量、沸点、极性大小、酸碱性等；（3）存在形式如游离型、结合型；（4）干扰因素如类似物、同分异构体、其他代谢产物等；（5）预期浓度如常量级、微量级、参考区间浓度、切点浓度、病理浓度等；（6）样本类型如血清、血浆、全血、尿样、唾液、胆汁、组织等；（7）采集和处理方式如静脉血、足底血、指尖血、离心处理或静置、何种采血管等；（8）储存和运输方式如避光、冷藏、冷冻等。

5.2 内标

内标可以校正基质效应或者样本萃取、色谱分离、离子化过程中产生的偏差，有利于提高定量分析的准确性和精密度及方法稳定性。

5.3 试剂和耗材的质量

5.3.1 试剂盒耗材的质量：由于MS灵敏度高，因此试剂和耗材要求也高。在使用前应对试剂、耗材进行验证，避免其中杂质对MS的影响。使用过程中应按照SOP进行保存、操作，避免污染。按照ISO 17025:2017进行批间次管控。

5.3.2 实验室设备：配置校准品和内标时，实验室应使用A级的容量瓶和移液器。

6．方法建立（assay development）

6.1离子转变（ion transition）

在建立和优化质谱采集参数的过程中，要先配制标准物质溶液直接导入质谱检测器进行质谱扫描，获取目标化合物的相关信息。根据目标分析物的极性选择合适的离子化方式

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：ESI源适合中等偏大极性化合物、难挥发化合物或热不稳定化合物；APCI源适合有一定挥发性的中等极性或低极性的小分子化合物。根据化合物的功能基团选择正负离子模式，然后选择合适的离子对分别作为定量离子对和定性离子对。之后，优化化合物参数，包括离子源参数以及质谱扫描参数，使所选择的离子对质谱响应值最高。

6.2高效液相色谱固定相

色谱柱种类繁杂，色谱柱选择通常取决于目标分析物的元素组成和化学结构。弱极性固定相有C18、C8、苯基柱等，极性固定相有氨基柱、氰基柱、硅胶柱等。要注意色谱柱的耐压范围和pH使用范围。当更换色谱组时，应使用系统适用性样本（SSS）进行核查。

6.3高效液相色谱流动相

流动相的设计取决于目标分析物的理化性质和色谱柱的特性。影响分离效果的流动相参数包括溶剂组成和比例、流速、离子强度、pH值、添加剂和温度等。其中避免使用的添加剂有非挥发盐、无机盐（腐蚀离子源）、表面活性剂（抑制电喷雾）、离子对试剂（影响后续离子化）。进行梯度洗脱或等度洗脱时，要注意溶剂比例、进样量、运行时间、梯度范围、柱温、样品溶剂等因素对分析结果的影响。应明确标注流动相的有效期。

6.4参数考察（examination variables）

6.4.1保留时间

控制流动相、色谱柱及外部条件（如温度）等。要预混合、防蒸发、控制pH值、保证泵流速。要求每次检测保留时间变化在±2.5%内。

6.4.2色谱分辨率

应达到基线分离Rs>1.25。可以通过增加色谱柱长度、改变流动相组成和比例、减缓梯度、降低流速和提高柱温来实现良好的色谱分离。

6.4.3其他改善色谱质量的因素如使用保护柱、减少死体积、检查管线连接到位等。

6.4.4信噪比

LLMI处S/N至少大于10，建议大于20。改善S/N的措施有考察基质效应、再优化提取效率、离子源参数、洗脱梯度、重组溶液、进样体积，优化驻留时间，优化进样量，优化前处理以及考虑衍生。

6.4.5色谱峰数据点和积分

推荐15-20个数据点，定量项目最低不少于10个数据点进行拟合。采集数据点的个数应与驻留时间有关。采用正切斜滑（tangent skim）方式积分非基线分离色谱峰。

6.5误差来源

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6.5.1由基质效应引起

生物样本高度复杂，基质组成一般包括盐类、脂类、蛋白、多肽有机小分子等。盐类、脂类（特别是磷脂）是离子化效率最重要的影响因素。多数基质干扰可以通过样品前处理或色谱分离去除。

6.5.2碎片离子的交叉干扰

如果两个碎片离子有相同的m/z，并且同时进入碰撞室可能会发生干扰。新筛等项目需要同时采集多离子通道信号时也可能会发生碎片离子干扰。驻留时间和切换通道时间极端（<1ms）时也易出现碎片离子交叉干扰。

6.5.3内调和校准品的杂质

6.6方法校准（assay calibration）

6.6.1概述

6.6.2校准物质

建议实验室购买和使用商品化的标准品，如无法获得商品化标准品则可以自配。校准物质应具有确定的纯度和稳定性信息。只要可能，校准物质的定值应溯源至参考方法（ISO 17511）。推荐使用有证标准物质（CRMs），但是可供目前使用的CRMs较少。不推荐使用无基质溶剂配制校准品，除非证明该操作不会引起基质效应。CRMs可用于验证商业校准品或实验室自配校准品的定值，但是应注意基质效应。

用于配制校准品的基质要尽可能与临床样本相似。对于外源性分析物，不含分析物的生物体液可作为理想的基质。对于内源性分析物，推荐使用“模拟”基质减少基质效应，经透析、活性炭处理的临床样本可作为“模拟”基质。若处理后分析物残留仍>20%LLMI则可使用人工合成基质。实际样本难以除去内源性待测物时也可使用溶液基质校准品。上述均应注意考虑基质效应。总结来说就是校准品原材料“级别”越高越好。配制用的基质与临床样本越相似越好。要时刻注意考察基质效应。

6.6.3校准品的数量和位置

FDA规定校准应包括空白、零点、6-8个浓度点（建立标准曲线）。在实际操作中，标准品的浓度点应定位于LLMI和ULMI，以及分析范围内的所有相关医学决定水平点。弱标准曲线范围跨度超过3个数量级（如10-1000），或范围内存在非线性区间，建议增加标准品数量或者缩小浓度检测范围。建议在每个检测批次前运行标准曲线。或实验的定标频率能保证检测质量，则可视具体情况而定。

6.6.4生成曲线

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6.7预验证（preverification）—评估基本性能参数

6.7.1选择性和特异性

第一步：进行背景噪音评价。双空白样本（无目标分析物/无内标）反应LC/MS系统的整体背景噪音。应满足以下要求之一：无背景峰、背景峰面积小于LLMI处分析物峰面积的20%、小于等于预期保留时间处IS峰面积的5%。

6.7.2基质效应的评估

基质效应是指在样本测试过程中，由于目标分析物以外的其他物质的存在，直接或间接影响目标分析物响应的现象。C62~专指对质谱系统的基质效应；互通性评价~一般指常规方法基质效应。基质效应可能会对分析产生一般性或样本特异性的影响，引起灵敏度和回收率的损失，引入误差，是对LC-MS方法验证的重要一环。

推荐方法为提取添加实验—前处理为液液萃取、蛋白沉淀等。其中set1含有待测物+内标+流动相，set2含有待测物+内标+提取后基质，set3含有待测物+内标+未提取基质（样本）。对比set2/set1可以评估基质效应，对比set3/set2可以评估提取效率，对比set3/set1可以评估前处理回收率。提取添加实验的设计和结果计算应制备5条不同的标准曲线（基质实验应做5批，计算结果的平均值），每批包含5种不同的基质（样本）。结合Tea考虑，如果精密度>15%，需要重新优化方法，如果在一个样品基质中自方法的灵敏度和特异性不能满足要求，需要重新优化方法。

还有柱后灌注实验可直观的评估基质效应。

基质混合实验（CLSI EP-07）方法：混合含有目标分析物的不同机制样本（通常为纯溶液样本和生物基质样本）分别处理后进样分析，比较混合液样本的响应值与生物基质样本和纯溶液样本响应值的均值，评估基质效应是否存在和影响目标分析物的准确定量。当基质效应评价结果不理想时，可以使用同位素内标进行补偿和抵消。还可以减少进样量，稀释样品，降低流速。还可以优化样本前处理，优化流动相条件使目标分析物的出峰时间错开发生离子抑制的时段，更换添加剂如TFA，更换色谱柱，更换离子化方法如ESI换APCI，或者尝试使用其他型号品牌的质谱系统。

6.7.3交叉污染（携带污染）

LC-MS是由连续流路组成，这种一体化的检测系统会增加高浓度样本残留风险。目前，尚无临床指南设定LC-MS的允许残留标准，但携带污染不应对检测准确性或精密度产生显著影响。无论同一次运行的其他样本中分析物的浓度如何，分析空白样品时的检测器信号都应该远低于LLMI（如25%）。评级方法参见CLSI EP-10或FDA指南。如果携带污染大于规定标

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准，建议减少进样量并降低最高标准曲线浓度。对未知样本在浓度高于最高标准曲线浓度样本之后进样的结果需要重新分析。

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交叉污染主要在自动进样器。管路、进样针、分析柱和流路连接处产生。出现交叉污染时可以重新设置进样程序，洗针程序，调整梯度洗脱程序，流动相组成。必要时，使用前钝化色谱柱。

6.7.4初步精密度（重复性）评价

在进行全面（多批次）方法验证之间进行初步精密度评价。选择三个浓度点：110%LLMI，90%ULMI，（LLMI+ULMI）/2。一批进行20次重复测定。计算SD，CV和靶值回收率。如果不满足预设标准，则要重新优化方法。

在正式用于临床检测前，任何一种质谱方法都需要进行方法学验证。目的就是验证方法的可靠性。如果方法的性能发生显著变化则要求方法重新优化并重复方法学验证，其中包括LOD，LLMI，线性和稀释，精密度，准确度，干扰。

7方法建立（assay development）

7.1检测限和定量检测下限

7.1.1LOD

LOD检测限是指检测方法在规定的实验条件下所能检出分析物的最低浓度。仅用于辅助确定检测方法的LLMI。可参考CLSI EP17。

7.1.2LLMI

LLMI定量下限是在满足实验室对准确性和精密度要求的前提下，检测方法在规定的实验条件下所能准确定量检测分析物的最低浓度或最低量。采用LC-MS定量检测时不建议报告低于LLMI的检测结果。

7.2线性与稀释

线性验证试验方法参见CLSI EP-06。推荐9-11点浓度，2-4次重复。避免逐级稀释（引入系统误差）。采用多元回归方程（如加权最小二乘法）评价线性，记录线性方程和相关系数。进行稀释时，最好使用不含分析物的天然基质作为稀释基质。稀释过程需要验证，基本接受标准为回收率/正确率±15%，精密度≤15%。会有三种稀释情况：（1）定量范围以内稀释如需要改善离子抑制或增强，（2）定量范围以外稀释如当分析物浓度大于ULMI时应进行稀释，此时要注意是对提取物进行稀释，稀释终浓度至少大于3倍LLMI，同时要注意IS浓度变化。（3）小体积样本稀释。小体积的样本（如婴幼儿通常只能采到15~50μL的血清）可能需要稀释以达到最小分析体积的要求，此时需要对原样本进行稀释，注意稀释基质，要考虑不同病理生理状态，稀释终浓度至少大于3倍L

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LMI，如无法达到，应有质控措施（相同水平质控）。

7.3精密度

基本过程参见CLSI EP-05，CLSI EP-15。用于评估方法的重复性（批内）和再现性（批间）。精密度评价的是整个测定过程，包括样本采集、保存、样本前处理、质谱检测等。平进行精密度评价的样本应该性质稳定，临床样本为佳，浓度在定量范围内及医学决定水平±25%。不满足浓度要求时可以稀释或添加，但要注意基质效应。要与临床应用密切结合，考虑实际使用情况。一般要求CV≤15%，LLMI CV小于等于20%。兼顾考虑Tea，建议不超过TEa/3。同时兼顾考虑生物学变异，临床指南文件，地方标准等。

7.4检测干扰

基本过程参见CLSI EP-07。LC-MS仍可受到多种物质的干扰，如药物及其代谢物质、补充剂、样本基质和性状、抗凝剂、促凝剂等，针对目标人群，对已知和潜在干扰进行考察。关注同分异构体或同位素的干扰（方法建立的难点之一）。在方法建立时，推荐使用含高浓度干扰物的临床样本进行干扰评估（CLSI EP-07）。在日常工作中，要积累检测方法建立和验证阶段的数据，以及目标人群样本的可接受范围。监测定量、定性离子通道丰度比，监测峰型、保留时间、分析与内标相对关系的一致性。

7.5正确度（trueness）

检验方法的核心三要素是校准品浓度的准确性、溯源性、测量不确定度。正确度验证有三种方法：方法间比对、分析具有赋值的物质、回收试验（多重）。使用样本优先次序为实际病人样本>混合病人样本>血清基质QC>水溶非生物溶液。根据生物学变异、临床指导原则及当地法规要求确定接受标准。

进行方法间比对时，最具有说服力的方案是与参考方法比对，选择大于40个目标人群病人样本，覆盖AMI。除此之外，也可与常规方比对，其结果仅说明差异程度（difference），不能表示偏倚（bias）。此为传统方案，可以用于参考区间转化，但是存在免疫法与质谱法结果相关性不佳，这与免疫法特异性问题有关。

当分析具有赋值的物质时，可以通过具有参考方法定值的有证参考物质或者可接受的替代品评估正确度。测定有证标准物质，来源为NIST，JCTLM列表，参考方法定值的PT材料。需要验证3~5批，每批重复2次。

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当参考物质与参考方法均无法获得时，可进行加样回收试验。可在购买参考物质与参考方法比对之前进行（预判）。进行过程中，添加已知量的标准品至指控样本或病人样本中，3个浓度水平，至少5个重复。

8液质检验方法的质量保证与质量控制

LC-MS实验室质量管理体系的关键要素是质量保证（QA）和质量控制（QC）。QA要求监测从样本采集、结果检测、结果报告到报告解释的全过程。QC是LC-MS检测方法运行期间的性能评价，旨在保证其能满足预期医学用途。QC样品应与样本经过相同前处理过程，使用相同检测方法。

8.1质控物的选择

8.1.1质控品基质选择

应选择合适的基质，尽可能与病人样本一致，也可选用商品化材料或自配。无论选用哪种基质，必须考虑基质与病人样本的接近程度（脂类、蛋白、药物、透析）、批间和批内均匀性、校准品和质控品分别独立制备。

8.1.2质控品的稳定性评价

质控品的稳定性评价是质控品有效应用的基本前提，要考察短期、长期和冻融稳定性。

8.2质控品浓度和频率

8.2.1浓度

要尽可能覆盖定量范围。推荐至少三个浓度点：3倍LLMI，定量范围的中间以及ULMI 的附近。在LLMI或者医学决定水平附近设置浓度有助于早期发现失控。

8.2.2最小频率

动态管理质控频率取决于方法学性能，某一时间段内检测的样本数量以及错误结果对于临床影响的严重程度。如果方法很稳定可以减少质控的频率。反之，如果方法存在性能下降的情况，需要增加质控频率。推荐每批次>5%样本总数，最少6个质控品（3浓度*2次重复测定）置于分析批的前、中、后。最低要求24小时2个质控。

8.3其他QA/QC样本

8.3.1系统适用性测试

样本类型为非提取样本，一般为分析物或内标的纯溶剂溶液。测定方法至少重复3次，弃去第一次结果。推荐重复7次（参加9.2.1）。检测参数有噪音、分析物信号、保留时间、色谱峰分离度和色谱峰对称性。推荐至少在每个分析批次之前、预防性维护之后、仪器卸真空后或者当系统平衡出现问题时就行系统适用性测试，以确保检测系统处于正常状态。

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8.3.2双空白和单空白

双空白：在采集的离子通道上无峰或峰面积<20%LLMI。

单空白：只含有IS，考察降解的IS对分析物峰面积的影响，要求<20%LLMI。

8.4指控可接受标准的评估

实验室因根据质量目标和临床应用建立本室可接受标准。对于商品化质控样本，生产商提供的可接受标准使用前应进行验证。

8.5失控时的纠正措施

所有失控和纠正措施均应记录。要监控包括数据类和图形类参数。

8.6多项目、多重检测的质控策略

每个分析物分别设定质控参数。主要考虑分析物之间的关联性。

8.7周期性质控程序（参考ISO 17025）

至少要每6个月校正一次或按厂家推荐进行质谱的质量校准/调谐，一般每3个月做一次PPG调谐。实验室同时配备多个LC/MS系统时，至少每6个月检查一次各系统间的相关性。换新色谱柱时序言进行验证。QC、校准品、试剂、流动相的批次更换，实验室可视情况自行确定验证程序。周期性正确度验证，测定参考物质，推荐每半年一次或参加正确度验证计划。

8.8其他质量保证因素

对样本进行追踪。对每一份样本贴上带有可追踪信息及编码的标签，与记录对应。

9实施后监测

9.1能力验证

参加EQA计划，评价实验室检测能力，对能力比对结果进行分析总结，关注比对结果是否产生趋势或偏倚。对于无EQA计划提供的检测项目，与外部实验室相同或相近的方法比对，需要考虑两种方法的检测性能，包括样本可接受范围和定量检测限等。

9.2系统性能监测

系统适应性样品（SSS）应为非提取样品，不经前处理，直接进行检测。推荐7个点、5个高浓度（CV<6%）+1个空白（<20%LLMI）+1个LLMI（S/N >10），分析批前、仪器维护后、断电、失真空、调谐后均要进行系统适应性检测。样品保留时间应为标准品的±

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2.5%，要对校准品和内标的信号进行监控，校准曲线、斜率监控R2≥0.995，同时对离子信号比值进行监控。

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