蛹虫草液体的深层发酵

蛹虫草液体的深层发酵

第３７卷第６期中南大学学报（自然科学版）

Ｖ０１．３７

ＮＯ．６２００６年１２月

Ｊ．ＣＥＮＴ．ＳＯＵＴＨＵＮＩＶ．（ＳＣＩＥＮＣＥＡＮＤＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）

Ｄｅｃ．

２００６

蛹虫草液体的深层发酵

周洪波，肖升木，阮承超，邱冠周

（中南大学资源加工与生物工程学院，湖南长沙，４１００８３）

摘要：以茵丝体质量浓度（干重）和发酵液中甘露醇浓度为指标，研究温度、初始ｐＨ值、培养时间等因素对蛹虫草液体培养的影响，得到蛹虫草摇瓶液体培养的最佳温度为２５．０。Ｃ，初始ｐＨ值为６．１０，培养时间为５ｄ；蛹虫草液体发酵最适培养基的组成为：２０ｇ／Ｌ蔗糖＋５ｇ／Ｌ蛋白胨＋１ｇ／ＬＭｇＳＯ。 ７ＨｚＯ。在此基础上进行小型分批式发酵罐实验，研究有利于蛹虫草生长及活性物质生成的ｐＨ控制策略。研究结果表明，ｐＨ分段控制的液体深层发酵对蛹虫草生长最为有利，茵丝体质量浓度为１７．３１ｇ／Ｌ，甘露醇质量浓度达４３．４７ｇ／Ｌ。

关键词：蛹虫草；液体发酵；甘露醇；茵丝体中图分类号：Ｑ９３９．５

文献标识码：Ａ

文章编号：１６７２—７２０７（２００６）０６—１０９８—０５

ＳｕｂｍｅｒｇｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ

ＺＨＯＵＨｏｎｇ—ｂｏ，ＸＩＡＯＳｈｅｎｇ—ｍｕ，ＲＵＡＮＣｈｅｎｇ—ｃｈａｏ，ＱＩＵＧｕａｎ—ｚｈｏｕ

（ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｉｎｅｒａｌｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇａｎｄＢｉｏｅｎ百ｎｅｅ“ｎｇ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００８３，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓ

ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｉｎｉｔｉａｌｐＨｖａｌｕｅａｎｄｃｕｌｔｉｖａ—ｔｉｏｎｔｉｍｅ

ｏｎ

ｂｉｏｍａｓｓａｎｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍａｎｎｉｔｏｌ

ｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ

ｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．

Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｓ

ｆｏｌｌｏｗｓ：２５．０℃，ｐＨ６．１０ａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆ５ｄ．

ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｍｅｄｉｕｍｉｎｓｕｂｍｅｒｇｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｆｏｒＣｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｏｐｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｉｓ

ａｓ

ｆｏｌｌｏｗｓ：２０ｇ／Ｌｓｕｃｒｏｓｅ＋５ｇ／Ｌｐｅｐｔｏｎｅ＋１ｇ／ＬＭｇＳ０４ ７Ｈ２０．Ｉｎ

ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎａ

１２Ｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔａｎｋｗａｓｕｓｅｄ

ｔｏ

ｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐＨ

ｖａｌｕｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗ

ｔｈａｔ

ａ

ｔｗｏ—ｓｔａｇｅｐＨ

ｅｏｎｔｒｏｌｓｔｒａｔｅｇｙｉｓｂｅｓｔｆｏｒｂｉｏｍａｓｓａｎｄｍａｎｎｉｔｏｌ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｂｉｏｍａｓｓａｎｄｍａｎｎｉｔｏｌｉｎｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｒｅａｃｈ１７．３１ｇ／Ｌａｎｄ４３．４７ｇ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ；ｓｕｂｍｅｒｇｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｍａｎｎｉｔｏｌ；ｂｉｏｍａｓｓ

蛹虫草又名北虫草、北冬虫夏草，属于子囊菌多种功能，对人体具有明显的保护作用，可以作为亚ｆ－Ｉ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ），麦角菌科（Ｃ如机ｃｉ声ｉ抛ｃｅ口ｅ），冬虫夏草的替代品［２曲］。

虫草属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）的模式种，学名为Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ目前，蛹虫草生产仍以固体栽培为主，液体深ｍｉｌｉｔａｒｉｓ。蛹虫草在世界性分布天然资源数量很层发酵研究的时问不长，许多培养条件如培养周期少［１］。蛹虫草含有３０多种元素，主要活性物质包括等的研究还不成熟［７］，但是，液体发酵具有许多如虫草素及甘露醇等，其含量与冬虫夏草含量类似。培养周期短、活性物质易于提取的优点，很多药用大量研究结果表明：蛹虫草与冬虫夏草类似，具有

真菌液体发酵的活性物含量远高于人工栽培的药用

收稿日期：２００６—０４一０７

基金项目：国家自然基金创新研究群体科学基金资助项目（５０３２１４０２）；湖南省青年骨干教师基金资助项目（２００１年）作者简介：周洪波（１９６９一），男，湖南湘潭人，博士，副教授，从事微生物工程研究通讯作者：周洪波，男，博士；电话：０７３１－８８７７２１６（０）；Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｈｂ＠ｍａｉｌ．ＣＳＵ．ｅｄｕ．ＣＦＩ

万　

方数据

蛹虫草液体的深层发酵

第６期周洪波，等：蛹虫草液体的深层发酵

真菌的活性物含量，所提取的活性物含量约为人工栽培活性物含量的１０倍多［１０｜。为此，本文作者研究蛹虫草的液体深层发酵条件。在单因素优化实验的基础上，进行小型分批式发酵罐实验，研究有利于蛹虫草生长及活性物质（甘露醇）生产的ｐＨ控制策略。

１材料与方法

１．１

菌种

蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ）菌种由中南大学

生物冶金教育部重点实验室提供。１．２培养基

固体斜面ＰＤＡ培养基组成为２００ｇ／Ｌ马铃薯（去皮）＋２０ｇ／Ｌ葡萄糖＋１５ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ值不控制。

液体种子培养基组成为［１¨：２０ｇ／Ｌ蔗糖＋

２０

ｇ／Ｌ蛋白胨＋０．５ｇ／ＬＭｇＳＯ。 ７Ｈ：Ｏ，１ｇ／ＬＫＨｚＰＯ。，ｐＨ值不控制。

发酵培养基组成为：２０ｇ／Ｌ蔗糖３－－１０ｇ／Ｌ蛋白

胨＋０．５ｇ／ＬＭｇＳ０４ ７Ｈ２０＋１ｇ／ＬＫＨ２Ｐ０４，ｐＨ

值根据不同实验要求进行调节。１．３实验方法

１．３．１培养条件及方法

摇瓶培养基本条件：摇床转速为１４０ｒ／ｍｉｎ，温度为２５℃，培养时间为５

ｄ。

发酵罐培养基本条件：在容积为１０Ｌ的微生物发酵罐中装入６Ｌ液体培养基，液体接种量为５％（体积分数），摇床转速为１５０ｒ／ｍｉｎ，通气量为２５０

～３００Ｌ／ｈ，温度为２５℃，培养时问为５ｄ。每隔８

ｈ取样１次，每次取样１００ｍＬ，测定菌丝体质量浓度和上层清液中甘露醇的质量浓度。

１．３．２

ｐＨ控制

采用自动流加２ｍｏｌ／ＬＨＣｌ或４ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ

控制ｐＨ值。

１．３．３

茵丝体质量浓度的测定

取一定量的发酵液分装在离心管中，在转速为

４０００

ｒ／ｍｉｎ条件下，离心２０～２５ｍｉｎ。倾去上层清

液，用蒸馏水洗涤１次后，将沉淀置于７０℃烘箱中烘至恒重再称量。

１．３．４甘露醇浓度的测定

这里考察的活性产物为甘露醇。分别取稀释至一定浓度的样品１ｍＬ及空白液１ｍＬ，置于不同的比色管中，用比色法ｍ１测定样品的吸光度，并计算样品中甘露醇的质量浓度。

万　

方数据２结果

２．１摇瓶实验

２．１．１

最适宜温度的确定

分别选择２０，２２，２５，２７和３０℃５种不同的温度进行３组平行实验。在５００ｍＬ摇瓶中装入培养基１００ｍＬ，接种量为５％，摇床转速为１４０ｒ／ｍｉｎ，培养４ｄ，观察蛹虫草的生长情况。４ｄ后，测量菌丝体质量浓度，结果如图１所示。

三－、

■

孙

≤蛙划酒苦

图１温度对蛹虫草生长的影响

Ｆｉｇ．１

Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎ

ｇｒｏｗｔｈ

ｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ

徐桂香等［１３。１４］：蛹虫草在温度为１５～３０℃时都能生长，但温度明显影响蛹虫草的生长速度，且在２８℃其生长速度最快。本实验结果表明：蛹虫草在２０～３０℃时都能生长，且在２５℃左右时其生长情况最好，所得菌丝体质量浓度最高（１９．１５ｇ／Ｌ）。因此，选择２５℃对蛹虫草进行培养。２．１．２初始ｐＨ值对蛹虫草生长的影响

将培养基的初始ｐＨ值分别调至４．１０，４．９０，５．３０，５．７０，６．１０，６．４０和６．８０，进行３组平行实验。培养４ｄ后测定菌丝体质量浓度，结果如图２所

示。

刘丽丽等［１５３的研究结果表明：菌体生长速度随着初始ｐＨ值的升高而加快，在发酵起始ｐＨ值为中性时生长最好。但本实验结果表明，当液体培养基的初始ｐＨ值为６．１０时，菌丝体质量浓度最高（１０．６３ｇ／Ｌ）；当ｐＨ值为中性时，不利于菌丝体生长。

２．１．３

培养时间的确定

在培养时间分别为１，２，３，４，５和６ｄ，培养温度为２５℃，ｐＨ一６．１０时进行３组平行实验，测

蛹虫草液体的深层发酵

中南大学学报（自然科学版）第３７卷

定蛹虫草发酵液的菌丝体质量浓度，结果如图３所示。可见，在前５ｄ的培养过程中，菌丝体质量浓度逐渐增加，尤其是第２～３ｄ菌丝体质量浓度呈直线上升。随后菌丝体质量浓度增长减慢，基本处于稳定期，生长第５ｄ即培养时间为１２０ｈ达到最大

（１７．１３

ｇ／Ｌ）。继续培养，产生菌丝体自溶现象，且

菌丝体质量浓度开始下降，开始进入衰退期。

，

■

钿

≤蝗划波苦

图２初始ｐＨ对蛹虫草生长的影响

Ｆｉｇ．２

ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｉｎｉｔｉａｌｐＨ

ｏｎ

ｇｒｏｗｔｈｏｆ

Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ

，

Ｌ

钿

≤醺

划

坦≮

图３培养时间对蛹虫草生长的影响

Ｆｉｇ．３

Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｔｉｍｅ

ｏｎ

ｇｒｏｗｔｈｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ

２．１．４

不同营养配方对蛹虫草生长的影响

通过不同碳源、氮源及无机离子配方，确定蛹虫草的最适宜发酵培养基。

按表１配方配制９种培养基，２５０ｍＬ摇瓶装液量５０ｍＬ，调节初始ｐＨ至６．１０，２５℃培养５ｄ，测定菌丝体质量浓度和上层清液中甘露醇的浓度。

以菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度为分析指标进行极差分析和方差分析口５｜。

由分析结果可知，碳源、氮源及无机离子的最

万　

方数据佳配方为：２０ｇ／Ｌ蔗糖＋５ｇ／Ｌ蛋白胨＋１ｇ／Ｌ

ＭｇＳ０４ ７Ｈ２０。

表１

蛹虫草培养基配方

Ｔａｂｌｅ１

ＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍＣｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ

ｐ／（ｇ Ｌ－１）

２．２小型发酵罐分批发酵实验

发酵液ｐＨ对微生物的生长和代谢具有重要影

响。因此，在摇瓶发酵实验结果的基础上，考察蛹虫草在小型发酵罐中发酵的ｐＨ控制策略。２．２．１不控制ｐＨ发酵

在实验中不控制ｐＨ，每隔８ｈ取样１次，每次取样１００ｍＩ。，测定菌丝体质量浓度和上层清液中甘

露醇的浓度，结果如图４所示。

时间／ｈ

１

ｐＨ；２一甘露醇质量浓度；３菌丝体质量浓度

图４不控制ｐＨ条件下发酵液ｐＨ、甘露醇浓度

及菌丝体质量浓度随时间的变化

Ｆｉｇ．４

ＶａｒｉａｔｉｏｎｏｆｐＨ，ｂｉｏｍａｓｓａｎｄｍａｎｎｉｔｏｌ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｉｍｅｗｉｔｈｏｕｔｐＨｉｎｃｏｎｔｒｏｌ

由图４可得：

ａ．菌丝体生长曲线和甘露醇质量浓度曲线呈正相关关系，即随着菌丝体的生长，甘露醇质量浓度随之增加；由此可以初步判断，甘露醇为生长偶联型代谢产物。

蛹虫草液体的深层发酵

第６期周洪波，等：蛹虫草液体的深层发酵

ｂ．接种约８０ｈ后，甘露醇质量浓度和菌丝体质量浓度均达到最大值，比陈晋安等口６３报道的菌丝体质量浓度达到最大值时间（１４４ｈ）大大缩短。

Ｃ．在不控制ｐＨ发酵条件下，发酵液的ｐＨ先下降而后上升；当ｐＨ约为５．５时，菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度均达到最大。

ｐＨ值出现这种变化，可能是随着菌丝体的生长，分泌胞外活性物质如有机酸和甘露醇等，使得发酵液的ｐＨ值下降；当菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度达到最大后，由于培养基中养分耗尽，菌丝体开始自溶，开始利用有机酸及甘露醇等作为碳源，ｐＨ上升。２．２．２恒定ｐＨ发酵

由以上实验结果可知，初始ｐＨ为６．１０时最适合菌丝体生长。运用自动流加酸碱的方法控制ｐＨ恒定在６．１０，其他实验条件不变进行发酵实验。实验结果如图５和图６所示。可见，将初始ｐＨ控制为６．１０在发酵初期有利于菌丝体生长，但一直恒定控制ｐＨ为６．１０并不利于菌丝体的生长和甘露醇的生成。

２．２．３分段控制ｐＨ发酵

上述实验结果表明：当菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度达到最大值时，ｐＨ维持在５．５左右。发酵初期将培养基ｐＨ控制在６．１０左右有利于菌丝体生长。因此，设计２阶段控制ｐＨ策略，即开始控制ｐＨ恒定在６．１０，接种后５０ｈ左右再将ｐＨ恒定控制为５．５，其他实验条件不变。实验结果如图５和图６所示。可见，分段控制ｐＨ与不控制（自然）ｐＨ和恒定控制ｐＨ一６．１０相比不仅菌丝体生长速率加快，且菌丝体最大质量浓度也明显增加。甘露醇产

，

Ｌ钿

≤迁划韫≮

１一分段控制ｐＨ；２一恒定ｐＨ＝６．１０；３一不控制ｐＨ图５

３种分批发酵条件下茵丝体质量浓度

Ｆｉｇ．５

Ｍａｓｓｃｏｎｃｅｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｂｉｏｍａｓｓｕｎｄｅｒｔｈｒｅｅ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

万　

方数据二、

■

‰

美链血啵Ｘ

时间／ｈ

１一分段控制ｐＨ；２一恒定ｐＨ＝６．１０；３一不控制ｐＨ圈６３种分批发酵条件下甘露醇的质量浓度

Ｆｉｇ．６

Ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｍａｎｎｉｔｏｌｕｎｄｅｒ

ｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

量的变化与菌丝体质量浓度变化一致。分段控制ｐＨ得到的菌丝体质量浓度与甘露醇质量浓度最大（菌丝体质量浓度为１７．３１ｇ／Ｌ，甘露醇质量浓度为

４３．４７

ｇ／Ｌ），与恒定ｐＨ一６．１０发酵时相比，菌丝

体质量浓度及甘露醇的质量浓度分别增加了８７％和２４％；与不控制ｐＨ发酵时相比，菌丝体质量浓度及甘露醇的质量浓度分别增加了３２％和１４％。因此，在３种ｐＨ控制策略中，分段控制ｐＨ液体深层发酵策略对蛹虫草生长最有利。３

结论

ａ．获得了蛹虫草摇瓶培养最优条件：接种量为５％（体积分数），摇床转速为１５０ｒ／ｍｉｎ，初始液体培养基ｐＨ为６．１０，温度为２５℃，培养时间为５ｄ。

ｂ．菌丝体生长曲线和甘露醇质量浓度曲线呈正

相关关系。以菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度为分析指标，确定了蛹虫草的最适宜发酵培养基组成为

２０

ｇ／Ｌ蔗糖＋５ｇ／Ｌ蛋白胨和１ｇ／ＬＭｇＳ０４ ７Ｈ２０。ｃ．采用ｐＨ分段控制发酵策略，不但菌丝体生长

速度快，菌丝体质量浓度增加，同时甘露醇质量浓度也有明显增加，菌丝体质量浓度达到１７．３１ｇ／Ｌ，甘露醇质量浓度达到４３．４７ｇ／Ｌ。选择ｐＨ分段控制的液体深层发酵方式对蛹虫草发酵最有利。参考文献：

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蛹虫草液体的深层发酵

蛹虫草液体的深层发酵

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

周洪波， 肖升木， 阮承超， 邱冠周， ZHOU Hong-bo， XIAO Sheng-mu， RUAN Cheng-chao， QIU Guan-zhou

中南大学,资源加工与生物工程学院,湖南,长沙,410083

中南大学学报（自然科学版）

JOURNAL OF CENTRAL SOUTH UNIVERSITY(SCIENCE AND TECHNOLOGY)2006，37(6)1次

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相似文献(10条)

1.期刊论文 施明珠.李有贵.李增智.钟石.胡桂燕.计东风.SHI Ming-Zhu.LI You-Gui.LI Zeng-Zhi.ZHONG Shi.HUGui-Yan.JI Dong-Feng 家蚕蛾油对蛹虫草液体发酵培养的影响 -蚕业科学2008,34(1)

通过对蛹虫草茵丝体干产量以及胞外高分子聚合物和胞内多糖含量的测量分析,研究了添加家蚕蛾油对蛹虫草(Cordyceps militaris L.)液体发酵培养效果的影响.添加4%雄蚕蛾油或2%雌蚕蛾油,蛹虫草茵丝体的产量分别增加76.1%和45.9%,胞外高分子聚合物含量分别增加64.2%和43.0%,均达到最大值;添加3%雄蚕蛾油或雌蚕蛾油使胞内多糖含量分别增加46.8%和47.1%,茵丝体产量分别增加145%和102%,均达到最大值.结果表明,添加一定量的家蚕蛾油对蛹虫草液体发酵培养具有促进作用,而在作用效果上,家蚕雄蛾油要优于家蚕雌蛾油.

2.学位论文 施明珠 昆虫激素对蛹虫草液体发酵培养的调控作用及蛹虫草菌丝体的药理学研究 2008

本研究选择昆虫蜕皮激素(ecdysone)和保幼激素(Juvenile hormone)作为添加物探索昆虫激素对蛹虫草(Cordyceps militaris L.)液体培养的调控作用,并利用培养所得菌丝体醇提物作为试验药物,探讨其对外源性糖皮质激素氢化可的松致老龄小鼠肝、肾损伤的保护作用及其可能的机理。

将β-蜕皮激素和保幼激素Ⅲ分别按照1.2 mg/l,4 mg/l和12 mg/l的剂量添加到蛹虫草液体培养基中进行单因子和双因子处理,分析蛹虫草液体发酵过程中β-蜕皮激素和保幼激素Ⅲ对菌丝体产量、胞外多糖产量、单位菌丝体胞外多糖分泌量、菌丝体胞内多糖含量、胞内多糖产量、菌丝体虫草素含量和虫草素产量变化的影响。

β-蜕皮激素对蛹虫草液体发酵有明显的促进效应,在培养过程中测定发现,各处理组菌丝体产量7 d后达到最大值,与对照相比,β-蜕皮激素添加量为1.2 mg/l时,胞内多糖产量增加了29.2％；添加量为4mg/l时,单位重量菌丝体的虫草素含量和虫草素产量增加了65.4％和84.7％；添加量为12 mg/l时,菌丝体、单位重量菌丝体的胞外多糖分泌量和胞外多糖产量增加了18.5％、181.7％和63.2％,显著超过了对照组。在本试验范围内若不考虑β-蜕皮激素的处理浓度,单就β-蜕皮激素对蛹虫草液体培养效果的影响,虫草素产量>胞外多糖产量>胞内多糖产量>菌丝体产量。

保幼激素Ⅲ不同处理组在培养7 d后取样测定,菌丝体产量和虫草素产量较对照组略有提高,分别增加了5.1-9.7％和0.1-21.1％,但胞内多糖和胞外多糖产量明显下降,下降幅度分别为34.5-51.6％和24.9-30.8％。保幼激素Ⅲ影响了蛹虫草液体培养过程中的生长代谢节奏,对照组胞内多糖含量、胞外多

蛹虫草液体的深层发酵

糖产量和虫草素含量在培养7d后达到最大值,而保幼激素Ⅲ不同处理组胞内多糖含量、胞外多糖产量和虫草素含量在培养1d、3 d、3 d取样分析时达到最大值。与此同时,不同浓度的保幼激素Ⅲ在处理初期对蛹虫草菌丝体生长表现出明显的抑制作用,培养1 d后测定,菌丝体产量较对照下降了52.4-59.7％,至培养第5 d,各处理的菌丝体产量才与对照相仿。

β-蜕皮激素和保幼激素Ⅲ共同处理,培养7 d后测定,菌丝体产量比对照组有所提高,提高幅度与β-蜕皮激素单因素处理组相仿：胞外多糖产量较对照组低,且随着保幼激素Ⅲ添加量的增加而下降；另一方面,胞内多糖和虫草素含量均比对照组和单因素处理组高,其中β-蜕皮激素和保幼激素Ⅲ1:4添加组(浓度分别为1.2和4.8mg/l)胞内多糖和虫草素产量比对照组分别增加了68.4％和123.2％。同时,随着复合处理组内保幼激素Ⅲ与β-蜕皮激素浓度比的提高,胞外多糖产量和虫草素含量的高峰期相应提前。

β-蜕皮激素和保幼激素Ⅲ共同处理组与对照组菌丝体醇提物在260 nm和280 nm下检测发现,HPLC图谱中峰值相似,推测β-蜕皮激素和保幼激素Ⅲ仅对蛹虫草菌丝体活性物质的产量产生影响。蛹虫草菌丝体醇提物(EECM)药理试验方法如下：将ICR雄性老龄小鼠随机分为正常组,模型组和蛹虫草菌丝体醇提物低、中、高剂量处理组(0.167,0.334,0.668 g·kg-1·d-1),其中在肾损伤试验中增加了参仙壮肾胶囊药物对照处理组(0.250 g·kg-1·d-1)。除正常组外各处理组均肌注氢化可的松(25mg·kg-1·d-1)造模7d,给药结束后测定小鼠肝组织丙二醛(MDA)含量、ATP酶(Na+K+-ATPase,Ca2+Mg2+-ATPase)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力大小及小鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇(Cor)的水平变化,同时通过光镜观察小鼠肝、肾组织结构病理变化。

EECM可显著提高模型小鼠肝组织中ATP酶(P<0.01)、SOD(P<0.01)和GSH-Px(P<0.05)活力；降低脂质过氧化物MDA含量(P<0.01)：对模型小鼠因肾脏肿胀、体重减小而引起的肾脏系数病理性增大有明显的恢复作用(低、中剂量处理组,P<0.05;高剂量处理组,P<0.01);降低血清尿素氮(P<0.01)和肌酐(中、高剂量处理组,P<0.01;低剂量处理组P<0.05)含量；提高小鼠体重(P<0.01)、血清ACTH(中、高剂量处理组,P<0.01;低剂量处理组P<0.05)和皮质醇水平(P<0.01)：减轻氢化可的松引起的肝、肾组织损伤；表现出与参仙壮肾胶囊相似的修复肾损伤疗效。

通过本研究结果表明,添加β-蜕皮激素,可显著提高蛹虫草液体发酵过程中的菌丝体、虫草素和胞内、胞外多糖产量,对蛹虫草次生代谢产物虫草素的促生成影响大于蛹虫草菌丝体生长和初生代谢产物多糖的生成；添加保幼激素Ⅲ可加快蛹虫草液体发酵过程中的生长代谢节奏；保幼激素Ⅲ和β-蜕皮激素共同添加可进一步提高蛹虫草液体发酵培养过程中的虫草素和胞内多糖产量。保幼激素Ⅲ和β-蜕皮激素就不同产物的影响不尽相同,表现出有协同也有拮抗,并与相互间浓度和比例有关。二者相比,β-蜕皮激素的作用效果大于保幼激素Ⅲ。药理学研究结果表明EECM具有提高机体抗氧化能力,减轻机体因脂质过氧化而导致的肝细胞损伤,并修复细胞膜的正常生理功能来实现对肝脏损伤的保护作用；同时通过诱导机体对下丘脑-垂体-肾上腺轴进行修复,改善阳虚症状,进而增强肾小球滤过性,从而起到减轻肾损伤的效果。

3.会议论文 周广麒.王世龙.万晓星.杨培忠.杨红.孟丹翠.王久远 蛹虫草的保健功能和液体发酵技术 2000

啤酒是低酒精浓度的饮料，泡沫洁白细腻，有浓郁的酒花香味，醇厚爽口，含有多种氨基酸和营养成分，该题首先将蛹草深层液体发酵，再接种啤酒的酵母，进行二次发酵，使啤酒中增加能提高人体免疫功能的虫草多糖和蛹虫草菌素等生物活性物质，从而开发出新的保健啤酒的风格和品种。

4.学位论文 陈磊 蛹虫草(Cordyceps militaris)生物学特性及发酵研究 2009

冬虫夏草是著名的传统中药和保健品，从17世纪开始就作为一种滋补药在东西方国家得到广泛应用。蛹虫草作为我国传统的民间药食两用真菌，由于其活性成分和药理作用与冬虫夏草相似，因此具有很高的开发利用价值。但生长条件的特殊性决定了蛹虫草野生资源稀少，再加上人们的过度采挖，造成了野生蛹虫草资源短缺、价格昂贵，不能满足巨大的市场需求。因而，探讨蛹虫草的高效人工培养方式成为药用真菌研究领域的一大热点。 该论文在本实验室原有研究的基础上对蛹虫草Cordyceps militaris Link．的鉴定、性质及人工培养条件进行了研究。根据供试菌株菌丝的显微结构、子实体形态特征并结合ITS序列明确了其分类地位；以胞外多糖和虫草素为考察指标，对该菌的液体发酵条件(营养因素、环境因子)进行了优化；此外，还对蛹虫草的双向固体发酵进行了初步探讨。

通过观察蛹虫草菌丝和子实体的显微结构，发现野生和人工培养的蛹虫草子实体在外观形态上差别较大；菌丝为有隔菌丝，在菌丝体顶端可形成分生孢子梗，孢子梗顶端不膨大，无分枝，分生孢子呈球状或椭圆状，成串地着生于孢子梗上，这些特征与青霉极为相似；蛹虫草子囊壳呈瓶状，子囊线形、细长，平行排列在子囊壳内；每个子囊内有8个子囊孢子，子囊孢子有隔膜若干，具有拟青霉型产孢结构。同时，ITS序列分析结果表明，该菌株与蛹草拟青霉对应序列的相似度达到了99％。

菌丝固体培养研究结果表明，蛹虫草菌丝在培养时最适的碳源、氮源分别是乳糖(或葡萄糖)和蛋白胨，在pH7.0～8.0、温度28℃、黑暗的环境条件下最适宜菌丝的生长。在摇瓶培养中，以菌丝体生物量和胞外多糖产量为目标产物，应用正交实验确定蛹虫草液体发酵终点为7天，最优碳源、氮源分别为葡萄糖和蛋白胨，蛹虫革菌丝体最适宜在中性营养液中生长，而且当温度为28℃左右时长势最好。此外，在液体发酵中重点考察了添加铵根离子对虫草素含量的影响，结果发现铵根离子能够显著增加虫草素的含量。

最后，首次对蛹虫草的双向固体发酵进行了初步探讨，在固体培养基中添加了六种不同类型药材的提取液，结果显示不同药材提取液对蛹虫草子实体产量、多糖和虫草素含量均具有显著影响。

上述菌丝固体培养和摇瓶培养实验结果可为蛹虫草的工业化生产提供参考，同时蛹虫草的双向固体发酵工程有可能成为中药新药研制的新途径，今后可能会有非常好的应用前景。

5.会议论文 王春华.毛宁.安康.郑莺.丁珊珊 液体发酵和固体栽培蛹虫草产生腺苷和虫草素情况 2007

本文用采用不同的碳氮源(玉米淀粉、大米粉、奶粉、豆饼粉)组合的培养基,液体发酵蛹虫草,以及不同的氮源固体栽培蛹虫草,采用高效液相色谱法检测菌丝体、子实体、以及不同氮源固体栽培后的培养基残基中腺苷和虫草素的含量。结果表明,在所设定的色谱条件下,腺苷和虫草素可以得到很好的分离,R>1.5,并且在一定浓度范围内具有良好的线性关系；蛹虫草人工固、液体发酵菌丝体以及子实体和残基中都含有含有腺苷和虫草素,且虫草素含量高于腺苷的含量。液体发酵时,玉米淀粉和奶粉组合的培养基发酵蛹虫草所得虫草素和腺苷最高,含量分别可以达到3.229mg·g<'-1>和1.902mg·g-1。在所有组合中用玉米淀粉和奶粉的培养基发酵培养蛹虫草,可以获得最大的生物量,其转化率分高达75.73％。固体栽培时,蛋白胨和麸皮是很理想的氮源,子实体中腺苷和虫草素的含量分别高达1.593mg·g<'-1>和9.171mg·g<'-1>,1.980mg·g<'-1>和8.932mg·g<'-1>。

6.学位论文 张志军 人工培养蛹虫草（Cordyceps militaris）SY<,12>新型有效成分的研究 2007

蛹虫草(Cordyceps militaris)是一种久负盛名的药用真菌，营养成分极为丰富，具有卓越的医疗和滋补功效。目前，关于蛹虫草的研究主要集中在虫草素和虫草多糖两种活性成分上，对其他有效成分的研究较少。本文从筛选性状优良的蛹虫草菌株出发，通过优化人工栽培实验和液体发酵条件，首次对人工栽培子实体和发酵菌丝体中类胡萝卜素和黄酮类化合物的提取分析进行了研究。

(1)通过组织分离法对采集的野生蛹虫草菌株进行分离纯化，以人工栽培实验选择优良菌株。菌株SY<,12>子实体的质量最好，子实体平均长度9.10cm，平均直径2.5mm，平均鲜重31.71g，平均生长周期45d，通过连续栽培实验验证，菌株SY<,12>具有良好的遗传稳定性。

(2)以干菌丝体得率为指标，通过单因素和正交实验对蛹虫草液体发酵条件进行优化研究，确定最佳发酵条件为：蔗糖4％、蛋白胨1.5％、硫酸铵0.6％、KH<,2>PO<,4> 0.05％、MGSO<,4>0.02％、VB<,1>微量，温度25℃、初始pH 7.0、装液量100/250mL三角瓶、接种量8.0％、发酵时间96h。在最佳发酵条件下，SY<,12>最大生物量可达18.7g/L。

(3)酸热法是蛹虫草中类胡萝卜素提取的有效方法，通过正交实验得到其提取的最佳工艺条件：盐酸浓度1mol/L、盐酸用量15mL/g、酸浸时间20min、热处理时间4min。在此浸提条件下，蛹虫草中类胡萝卜素含量可达215μg/g。蛹虫草中类胡卜素的紫外—可见光光谱吸收峰值分别在415nm、439nm和468nm处，与类胡萝卜素的紫外特征吸收值相符。

(4)通过单因素实验和正交实验，确定乙醇回流法提取黄酮的最佳条件：乙醇浓度75％、液料比40:1、提取时间60min、提取次数2次。经TLC法结合硅胶柱层析对提取物进行分离，通过颜色反应和紫外特征吸收进行鉴定。

蛹虫草中类胡萝卜素和黄酮化合物的提取分析研究，为蛹虫草的内在有效成分的全面分析及其药用价值的研究提供了重要的参考依据。

7.学位论文 秦建春 蛹虫草发酵物化学成分及生物活性研究 2006

高等真菌中含有丰富的活性物质，在天然产物农药研究迅速发展的今天，其已成为继微生物源农药和植物源农药之后研究的另一热点。从高等真菌中分离纯化活性先导化合物对创制具有我国自主知识产权的新农药具有重要意义。鉴于此，本论文以蛹虫草液体发酵产物——菌丝体和发酵液为研究对象，采用生物活性跟踪法，对其中的化学成分进行抑菌杀虫研究，主要得出以下结论：

1.对蛹虫草发酵液的乙酸乙酯和正丁醇萃取物进行了抗菌实验。结果表明，乙酸乙酯萃取物对细菌中的金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、变形杆菌、巨大芽孢杆菌、北京棒状杆菌和霉菌中的绿色木霉、黄曲霉有明显的抑菌作用；正丁醇萃取物对细菌中的马铃薯芽孢杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌

蛹虫草液体的深层发酵

、灵杆菌和霉菌中的绿色木霉以及黄曲霉有明显的抑菌作用，且提取物的抑菌作用随浓度增大而增强。说明蛹虫草发酵液中具有抗菌活性物质。

2.采用叶碟法测定菌丝体和发酵液以及各萃取物对粘虫3龄幼虫的毒杀活性，结果发现在25mg/mL时菌丝甲醇总浸膏对粘虫有较强的拒食和毒杀活性，饲喂3d的校正死亡率58.25％。乙酸乙酯和正丁醇部分毒杀活性相对较弱，饲喂3d的校正死亡率分别16.67％和30.95％。发酵液各萃取物对3龄粘虫的毒杀活性较弱。

3.另外测定了菌丝体甲醇提取物以及各萃取部分的抗病原菌活性，结果发现甲醇总浸膏在2mg/mL浓度下72h对苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和葡萄炭疽病菌菌丝生长有明显抑制作用。乙酸乙酯部分在1mg/mL浓度下72h对棉花枯萎病、苹果腐烂、葡萄炭疽病菌菌丝生长的抑制率在

60～80％之间；正丁醇部分在1mg/mL浓度下72h对番茄灰霉、番茄早疫菌病菌丝生长的抑制作用在60～70％之间。萃余水相在1mg/mL浓度下72h对苹果腐烂，番茄灰霉、番茄早疫病菌菌丝生长表现出一定的抑制作用。

4.菌丝体乙酸乙酯萃取物经过柱层析分离纯化，鉴定出化合物5个，经GC-MS、EI(FAB)-MS、1HNMR、13CNMR及DEPT等波谱鉴定，并与标准品、文献值以及图谱库对照，确定其为棕榈酸；硬脂酸；油酸；4,6,8(14)，22(23)-四烯-3-酮麦角甾烷；麦角甾醇过氧化物。

8.期刊论文 周广麒.万晓星.侯友松.张长铠 蛹虫草液态深层发酵的研究 -食品与发酵工业2004,30(8)

采用二次饱和D-最优试验设计方法,在30L生物反应器中进行了蛹虫草液态深层发酵.当初始温度为22℃,pH6.3～6.5,搅拌速度180r/min,通风量1.21m3/h,发酵72h和96h,蛹虫草菌丝体(干)产率分别为38.6 g/L和42.3 g/L.用HPLC法检测腺苷和蛹虫草菌素的含量,72 h时分别为湿菌丝体中0.352μg/g和0.134μg/g,发酵液中0.179μg/mL和0.102μg/mL;用比色法在412nm处检测虫草酸的含量,湿菌丝体中为23.406mg/g,发酵液中为6.61mg/mL.

9.学位论文 徐桂香 蛹虫草液体深层通风发酵培养的研究 1998

10.期刊论文 郑婷婷.李多伟.王英娟.令狐昱慰.ZHENG Ting-ting.LI Duo-wei.WANG Ying-juan.LINGHU Yu-wei 蛹虫草液体培养条件优化及有效成分含量分析 -菌物研究2004,2(4)

为优化蛹虫草菌的液体培养条件,对蛹虫草菌丝体进行液体摇瓶培养.以干菌丝体得率为指标,对影响发酵产量的重要因子设计正交试验,得出最佳培养条件.在最优条件下扩大培养,检测此时菌丝体中虫草素及虫草多糖含量.结果表明:蛹虫草菌丝体液体发酵的最适条件为:接种量10%(v/v),发酵初始pH7.0,发酵温度27℃,发酵时间96h.扩大培养后,测得菌丝体中虫草素的含量为51.785 mg/100g,虫草精多糖含量为1.92g/100g.

引证文献(1条)

1.刘小莉.周剑忠.王英.李剑.黄开红 虫草深层发酵的培养条件和培养基优化研究[期刊论文]-江苏农业科学2008(6)

本文链接：http://www.77cn.com.cn/Periodical_zngydxxb200606016.aspx

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