试验中常用试剂的配制和注意事项

RT-PCR实验操作步骤

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退火温度：这与你要PCR的模板DNA有关，不同的模板有不同的最适退

火温度。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。

一.所用试剂

1.0.01MPBS缓冲液,PH7.4 ：高压灭菌，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。 2.焦碳酸二乙酯(DEPC)：sigma公司，40C保存。

3.0.1TPC处理的灭菌去离子水：100ml去离子水中加入0.1mlDEPC，剧烈振荡混匀，让DEPC充分进入溶液中，370C放置过夜，高压蒸汽灭菌30分钟除去DEPC。40C保存。

4.单相细胞裂解试剂TRizoL：Invitrogen生命技术公司，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

5.氯仿：用新开封的，10ml分装，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。 6.异丙醇：用新开封的，20ml分装，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

7.0.1TPC处理的75％乙醇：无水乙醇75ml加0.1TPC处理的灭菌去离子水至100ml，4C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。 8.cDNA反转录试剂盒：MBI公司，－200C保存。 9.2xPCR试剂：MBI公司，－200C保存。

10.5xTBE RNA电泳缓冲液：因为Tris碱可与DEPC发生反应并使之失活，所以含Tris碱的电泳缓冲液可用DEPC处理的灭菌去离子水配制，0.22um滤器过滤除菌。室温保存，临用前用DEPC处理的灭菌去离子水10倍稀释。使用本室RNA专用电泳槽，每次需配制0.5x电泳缓冲液500ml。

11.50xTAE DNA电泳缓冲液：室温保存，临用前用去离子水50倍稀释。使用本室DNA专用电泳槽，每次需配制1x电泳缓冲液1000ml。

12.6x上样缓冲液：1.5mlDEPC处理的灭菌离心管中称取2.5mg溴酚蓝，加入0.3ml甘油，DEPC处理的灭菌去离子水定容至1ml，40C保存。

13.1.5％琼脂糖：RNA电泳，1.5g琼脂糖加入0.5xTBE RNA电泳缓冲液中;DNA电泳, 1.5g琼脂糖加入1xTAE DNA电泳缓冲液中。微波炉煮沸熔化后，冷却至600C左右，每100ml胶加入溴化乙啶(EB,10mg/ml)5ul。

14.溴化乙锭（10mg/ml）：在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。 15.人淋巴细胞分离液：上海华精生化试剂厂。 二.总RNA提取

[注]1.本方法采用Chomczynski一步法，用单相细胞裂解试剂TRizoL破碎细胞和灭活细胞中内源性RNA酶同步进行，可同时分离RNA、DNA和蛋白质。TRizoL中含有酚、强变性剂硫氰酸狐和溶解剂等。本法所提取的RNA可用于RT-PCR、Northern印迹杂交等。 2.最好单独存放用于RNA实验的试剂，以防止污染。

3.耐高温的匀浆器、研钵及研棒用锡箔纸包好，2000C干烤5小时，灭活外源性RNA酶。

4.离心管、枪头等塑料制品用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡12小时以上灭活外源性RNA酶。再用去离子水浸泡10分钟x3次，以去除DEPC，然后70-800C烤干，高压蒸汽灭菌30分钟除去残留的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。 5.提取RNA所用的去离子水及配制试剂均要经含0.1TPC处理。

6.如果是从完整包装中新取出的塑料制品，一般无外源性RNA酶污染，可以直接使用。 7.实验者的双手是外源性RNA酶的重要污染源，因此务必戴手套进行操作。

8.DEPC为可疑致癌物，且有芳香性挥发气味，使用时应戴手套、口罩，并打开排气扇。 9.RNA紫外分光光度计定量所用石英比色皿使用后，在1：1盐酸甲醇中浸泡30分钟以上，再用0.1TPC处理去离子水冲洗干净，凉干。

10.用于RNA电泳的电泳槽用去污剂清洗干净，自来水冲洗数次，再用去离子水冲洗1次，无水乙醇擦洗，干燥。然后灌满3％的双氧水室温放置10分钟，最后用DEPC处理的去离子水冲洗3次。 11.提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳后，28S rRNA和18S rRNA应当能清楚地在紫外分析仪下看到，也应当能看到一条由tRNA, 5.8S rRNA和5S rRNA组成的，较模糊迁移较快的带。如果RNA没有被降解，28S rRNA的亮度应当是18S rRNA亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。加样孔附近有条带表明产物中混有DNA。 (一).培养细胞中RNA提取

1.贴壁生长的细胞：倒出培养液，加5ml无菌冰冷的PBS缓冲液冲洗细胞2次。倒出PBS缓冲液(尽量空干)，加入1mlTRizoL,用力振荡培养瓶或培养皿(贴壁较牢固的细胞可用细胞刮刀刮取细胞)，使细胞完全脱落，用加样器吹打均匀，吸入1.5ml离心管中，漩涡混匀器振荡30秒，室温静置5分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。悬浮生长的细胞：细胞悬液倒入10-15ml离心管，2000转/分离心10分钟收集细

胞，倒出培养液，加2ml无菌冰冷的PBS缓冲液，混匀使细胞沉淀重悬洗涤细胞2次。再2000转/分离心10分钟收集细胞，倒出PBS缓冲液(尽量空干)，加入1mlTRizoL,用加样器吹打均匀，吸入1.5ml离心管中，漩涡混匀器振荡30秒，室温静置5分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。 2.加氯仿200ul,漩涡混匀器振荡30秒，冰盒上静置10分钟，

3.高速冷冻离心机（温度设定40C）12000/分离心15分钟，使混合物分为两相(RNA留在水相，DNA和蛋白质被抽提进氯仿层)，吸取上层水相0.5ml移至一个新的1.5ml离心管中，加异丙醇0.5ml。充分混匀，冰盒上静置10分钟，使RNA充分沉淀。

4.高速冷冻离心机（温度设定40C）12000/分离心15分钟,弃去上清液,加入冰冷75%乙醇1ml洗涤RNA沉淀,漩涡混匀器振荡30秒.

5.高速冷冻离心机（温度设定40C）8000/分离心5分钟,弃去上清液,沉淀快速风干。但不要完全干燥这一点非常重要，否则RNA沉淀溶解度会大大降低。可通过在55－600C加热并用枪头反复吹打溶液增加RNA的溶解度。

6.提取的RNA加适量DEPC处理去离子水溶解(组织及培养细胞所提RNA加水50－100ul外周血白细胞所提RNA加水10－15ul)。取5ul+1ul6x电泳上样缓冲液点样，电压120-130V电泳30分钟左右，如在紫外分析仪下可见5S、18S及28S三条带出现，说明已提出RNA。5S条带较模糊迁移较快。如果RNA没有被降解，28S rRNA的亮度应当是18S rRNA亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。加样孔附近有条带表明产物中混有DNA。RNA纯度鉴定及定量可用紫外分光光度计，取2ul＋148ul去离子水测A260nm/280nm，比值应在1.8-2.0之间。RNA浓度(ug/ml)=A260x稀释倍数x40。对大多数细胞株来说，一个100ml培养瓶中培养细胞的RNA收率为100－200ug。RNA原液浓度=A260×稀释倍数×40（ng/μl）

7.如暂时不做反转录，,立即放-800C冰箱冻存 二).组织中RNA提取

1.组织收集：新鲜组织立即放入液氮中30分钟以上后，可在-800C冰箱保存，数月内不会影响RNA的产量及质量。

2.取组织50-100mg放入1ml玻璃匀浆器中，加入1mlTRizoL,在冰浴中研磨，悬液转入1.5ml离心管中，室温静置5分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。高速冷冻离心机（温度设定40C）12000/分离心5分钟，上清液倒入另一1.5ml离心管中。 3.以下步骤同培养中细胞RNA提取法(2-7)。 (三)外周血白细胞RNA提取

1.抽取静脉血5ml,注入0.5ml 3.8％枸橼酸钠（血液：抗凝剂＝10：1）的抗凝管中，加盖颠倒混匀2-3次。

2.将上述抗凝血倒入15ml离心管中，加5mlPH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）等量稀释。 3吸取5ml淋巴细胞分离液（上海华精生物技术公司生产）加入另一15ml离心管中。

4.将稀释后的抗凝血10ml沿管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上，水平离心机2000转/分离心20分钟。 5.吸取中间白细胞层至另一15ml离心管中，加入5mlPH7.4PBS缓冲液混匀（洗涤白细胞），4000转/分离心5分钟。弃去上清液，所得白色沉淀即为单个核细胞，如暂时不提取RNA,立即-800C冰箱冻存。 6.加入TRizoL(Invitrogen生命技术公司生产)1ml,用加样器吹打均匀，吸入1.5ml离心管中，漩涡混匀器振荡30秒，室温静置5分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。 7.以下步骤同培养中细胞RNA提取法(2-7)。 三.反转录

参见不同厂家试剂盒说明书，以本室使用的Fermentas MBI公司(#K1621)cDNA反转录两步法试剂盒为例。一步法是将反转录及PCR反应的所有试剂加在一个反应体系(EP管)，缺点是试剂用量大，反应条件不好掌握；两步法是先反转录，然后进行PCR反应。

反转录反应

（1）在超净台中，取DEPC处理的200μlPCR管置冰上，依次加入 总RNA 1μg(2ul) 随即引物(0.5μg/μl) 1μl

无RNA酶水 9ul至总体积12μl 混匀，用微量离心机离心3000转/分30秒。 （2）置PCR仪上70℃5分钟变性，取出置冰上冷却。

（3）PCR管置冰上，依次加入

5×RT Buffer 4μl RNase inhibitor(20U/μl) 1μl 10mM dNTP Mix 2μl 混匀，用微量离心机离心3000转/分30秒。

（4）置PCR仪上25℃5分钟。取出置冰上冷却。

（5）加入M-MuLV逆转录酶（200U/μl）1μl至终体积20μl。

（6）置PCR仪上按以下条件进行

25℃ 10分钟 42℃ 60分钟 70℃ 10分钟

立即冰上冷却，产物cDNA即用于PCR或置-20℃冰箱保存。 四.PCR反应

（1）取200μIPCR管依次加入

2×PCR Master Mix 12.5μl cDNA 2.0μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl

灭菌去离子水 8.5ul至25μl 用微量离心机离心3000转/分30秒混匀。

（2）按以下条件进行PCR反应： 94℃ 5分钟 预变性 94℃ 30秒 变性 55-60℃ 45秒 退火

72℃ 45秒 延伸，共30-35个循环 72℃ 7分钟 最终延伸。 五.实验对照

1.阳性对照：采用已知高表达细胞的总RNA进行逆转录和PCR扩增。

2.阴性对照：用灭菌去离子水代替总RNA的反应体系进行逆转录和PCR扩增。

3.内参照：以引物进行PCR反应的同时，以β-actin引物(或者GAPDH引物)进行PCR反应。 六.琼脂糖凝胶电泳

取内参照扩增产物及PCR产物15ul+3ul 6x上样缓冲液，同时用相应的5-8ul DNA Marker,2%琼脂糖凝胶电泳，电压110-120V，30-45分钟。

七.紫外分析仪观察、数码照相

于紫外透视仪下观察有无特异性扩增带，并照相记录。 β-actin扩增产物大小540bp，340 bp。 GAPDH扩增产物大小142bp。

在ddH2O中加入0.1％的DEPC，用搅拌子搅拌2小时，使DEPC充分溶解在水里。然后将EP管,tip头及大离心管etc浸入以上水中，后放入37度培养箱中过夜，第二天倒掉液体后高压。（不是仅仅DEPC处理的水冲洗就可以的）。DEPC处理的水我们不重复使用。

经DEPC处理好的东西如EP管,应先在70-80度烤干后，再高压;剪刀 玻璃制品可以用DEPC处理后180-200度干烤2小时

酶活力单位

酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

Polyclar-AT is insoluble PVP, also called as PVPP (PolyVinylPolyPyrrolidine). It binds phenols etc more efficiently than PVP and is easily removable by filtration or a low speed spin.

关于HEPES缓冲溶液的配制，不同的文献资料有不同的说法。根据用途，一种是单纯的HEPES＋NaOH，另一种是HEPES＋盐。各种配制方法总结如下：

一、500ml 1 M HEPES, pH = 7.0 Stock solution的配制

119.15 g HEPES 溶解在400ml蒸馏水中，加0.5~1M的NaOH水溶液调节至少所需pH（HEPES的有效pH范围是6.8~8.2），然后用蒸馏水定容至500ml，于4摄氏度保存。 二、加少量盐的HEPES Buffer配方（500ml）

HEPES 6.5g、NaCl 8.0g、Na2HPO4.7H2O 0.198g、用0.5M NaOH水溶液调节pH值，最后定容。 三、2×HEPES缓冲盐溶液的配制

将1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2HPO4.2H2O、0.2g葡聚糖(glucan ordextran)和1g HEPES溶解在90ml的蒸馏水，用0.5MNaOH调节至所需pH值，再用蒸馏水定容至100ml即可。

DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇。分子式为C4H10O2S2，分子量为154.25，纯度>99%。 常用还原剂，有抗氧化作用，进口分装。DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近。但DTT价格略高一些。 megabecquerels 兆贝可［勒尔］(放射性强度单位)

放射性是延须知:

(1) 放射性实验室自我检查及防护 (2) 放射性实验应急措施

(3) 放射性化合物的贮存和使用: 放射性物质有两种分解方式,化学分解和放射性衰变引起的诱发分解.

(4) 放射性强度(或放射性活度) (5) 比活度

(6) 放射性单位换算 (7) 文献资料

(1) 放射性实验室自我检查及防护

1） 做放射性实验之前，必须戴双层一次性塑料手套

2） 如果发现或感觉到有放射性物质污染手套，应立即退下一层塑料手套

3） 尽量减少放射性物质直接暴露于空气的时间。用完以后，应立即盖上试剂瓶

4） 做完放射性实验以后，用擦拭法检查做实验过程中用过的实验台，地板和仪器，一般检查6至10个点

5） 擦拭检查的草纸放在塑料小管中，加入液体闪烁液 6） 用MicroBeta仪测量各个检查点的放射性浓度

7） 注意: 低放射性元素, 如氚和碳14, 塑料手套和皮肤足以阻挡beta射线, 无需额外保护装置

(2) 放射性实验应急措施

1） 如果发现有放射性物质溢漏，应首先界定范围

2） 如果是在衣服和鞋袜上，应立即脱掉有污染的衣服和鞋袜，然后用草纸吸收和收集液体和固体的放射性物质。所有放射性垃圾应放入专门的垃圾箱中。

3） 被污染的皮肤在用草纸清洁以后，用湿的草纸再擦洗一遍，然后再用肥皂擦洗。

4） 如果放射性物质在地板或实验台上，应先用草纸吸收和收集液体和固体的放射性物质。 5） 然后用乙醇和草纸擦洗污染地点。

6） 清洗完毕以后，用擦拭法检查污染地点是否还有放射性物质 7） 如果还有，必需继续清洗，直到没有为止。

8） 清洗结束以后，必须报告污染经过给实验负责人。

(3) 放射性化合物的贮存和使用: 放射性物质有两种分解方式,化学分解和放射性衰变引起的诱发分解.

1) 从供应商处取货后, 一般存放在至少-20C的冰箱, 最好在-70C.

2) 在做实验之前, 确定大致实验需要与进度, 对放射性化合物进行分装.

3) 每次只需要从低温冰箱取一支分装的放射性化合物. 4) 控制每支分装样品, 解冻复冻次数小于5次. (4) 放射性强度(或放射性活度)

放射性同位素不断地衰变，它在单位时间内发生衰变的原子数目叫做放射性强度（radioactivity）.

放射性同位素衰变值的计算: A=Aoe^(-lt); l = (ln2)/T1/2; T1/2为半衰期 ; Ao己知源强度 ; A是经过时间t后的强度.

在国际单位制（SI）中，放射性强度单位用贝柯勒尔（becquerel）表示，简称贝可，为1秒钟内发生一次核衰变，符号为Bq。

因为这单位太小, 所以有: 1KBq = 10^(3) Bq; 1MBq = 10^(6) Bq; 1GBq = 10^(9) Bq. 放射性强度的常用单位是居里（curie），表示在1秒钟内发生3.7×10^(10)次核衰变，符号为Ci。

1居里(Ci) = 3.7×10^(10) Bq = 37 GBq 1毫居(mCi) = 3.7×10^(7) Bq = 37 MBq 1微居(μCi) = 3.7×10^(4) Bq = 37 KBq

1分钟内发生的核衰变次数，符号为dpm (decay per minute). 1 Bq = 1 dps = 60 dpm

1居里(Ci) = 3.7×10^(10) dps = 2.22 × 10^(12) dpm 1毫居(mCi) = 3.7×10^(7) dps = 2.22 × 10^(9) dpm 1微居(μCi) = 3.7×10^(4) dps = 2.22 ×10^(6) dpm (5) 比活度

比活度是单位质量（固体）或体积（液体气体）的活度。 活度是单位时间内放射性元素衰变的次数。

当这种核素的丰度是100％时，它的比活度就是本征比活度。

比活度是最终产品的比活度，这个比活度值和活度值一样，不同时间是不同的，随着时间衰变。时间对长寿命同位素如氚, 碳14影响不大.

比活度的单位, 常见的有: Ci/mmol; Ci/μmol; Ci/g; 等等. 放射性比活度的测定方法是：

1) 用活度计测定放射性活度，从而计算出放射性浓度。

2) 用分析HPLC做产品取样分析，进样量要准确，用色谱的定量测定方法测出待测物质的物质的量（mol）。

3) 由放射性浓度和进样体积计算出进样活度，除以刚才测出的物质的量, 就是这种药物在放射性活度标定时间的比活度。

(注意: 这两者所用为同一数量的样品, 如不一样, 通过换算也可以) (6) 放射性单位换算 公式和换算

1 Curie (Ci) = 2.22 x 10(12) disintegrations/min (dpm) = 37 GBq 1 mCi = 2.22 x 10+9 dpm = 37 MBq

1 μCi = 2.22 x 10+6 dpm = 3.7 X 10+4 Bq = 37 kBq

1 Becquerel (Bq) = 1 disintegration/s (dps) = 2.7 x 10-11 Ci = 2.7 x 10-5 μCi 1 GBq = 27 mCi 1 MBq = 27 μCi 1 kBq = 27 nCi

Radioactive decay equation

A=Aoe-( 0.693t/[T1/2] ) Ao- original activity T1/2 - half-life t - elapsed time

System International (SI) Units for Ionizing Radiation Activity, Becquerel (Bq) = Disintegrations/sec 1 Bq = 2.7 x 10-11 Ci

Absorbed Dose, Gray (Gy) = Joule/kilogram 1 Gy = 100 rads

Dose Equivalent, Sievert (Sv) = Joule/kilogram 1 Sv = 100 rems (7) 文献资料 (1) 辐射安全

(a) 国家电离辐射防护与辐射源安全基本标准

(b) 关于辐射安全地使用放射性同位素专著放射性保护 (2) 高压液相溶剂选择 控制HPLC溶剂的pH (3) 测定结合常数 Thrombin Receptor

Hydroxysteroid Dehydrogenase (4) 同位素示

K-Pi Buffer (pH 7.8 100mM)

K2HPO4?3H2O 2.28g+ddH2O→100ml取出46.8ml KH2PO4 1.36g+ddH2O→100ml取出3.2ml

由C18对水溶性基质中大多数的有机物质都具有保留性能，因此C18选择性最小，常被用来处理含有多种结构或是结构相差很大的分析物样品。由于C18的长链效应，填料的极性作用比其它吸附剂都小，通常可以用C18小柱代替离子交换柱对一些小分子和一些中等大小分子脱盐，因为C18填料对盐没有任何保

留。主要用于反相萃取，适合于非极性到中等极性的化合物，如抗菌素、巴

比妥酸盐、酞嗪、咖啡因、药物、染料、芳香油、脂溶性维生素、杀真菌

剂、除草剂、环境农药、PAH和PCB残留、食品添加剂、碳水化合物、对羟基

甲苯酸取代脂、苯酚、邻苯二甲酸酯、类固醇、表活化剂、茶碱、水溶性维

生素。

固相萃取小柱的使用方法一般包括：活化、过柱、洗脱三步。首先，用活化剂将柱子活化，以增强柱子对目标物的吸附；第二步：过柱，将样品溶液注入固相萃取小柱，加压或其他方式使样品通过小柱，目标物吸附。第三步，洗脱，用洗脱

液将吸附在固相萃取柱上的目标物洗脱下来，就可以检测了。以前做黄芪注射液指纹图谱时用过C18小柱，每次实验结束后，我都会将使用过的小柱浸泡在甲醇溶液中。小柱可以重复使用至少3次

ctab即十六烷基三甲基溴化胺，别名溴化十六烷基三甲基胺,鲸腊基三甲基溴化胺，分子式c19h42nbr，理化性质为白色或黄色膏体或固体粉末,有刺激气味.熔点32℃,hlb值15.8,熔于热水、乙醇、三氯甲烷,易熔于异丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于醚.加热至多24.5—25.2℃分解。有良好的表面活性、稳定性、杀菌性及生物降解性。在强酸及强碱中穏定,耐热、耐光。与非离子及两性离子表面活性剂有良好的配伍性,对多种油脂具较好的乳化作用.对皮肤及粘膜刺激性小,有轻微脱脂作用。是一种阳离子去污剂，广泛用于润湿、杀菌、抗静电、去污、增溶等方面。可用作纤维高效抗静电剂。工业及油田水处理中用作杀菌灭藻剂、粘泥剥离剂。牙膏中用作口腔杀菌剂。用于香波及护发素,可使头发易于梳理、光滑、柔软。还右用作矿物浮选剂、电镀液缓蚀剂、沥青乳化剂、硬表面清洗剂及有机合成相转移催化剂等。还具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，ctab与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，ctab可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌

PEG是聚乙二醇英文名polyethylene glycol的简称，一种化学药品，被广泛的应用于化妆品行业。

Tris：三羟甲基氨基甲烷

三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为Tris）是一种有机化合物，其分子式为(HOCH2)3CNH2。分子式: (HOCH2)3CNH2

分子量.: 121.14

Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。例如，在生物化学实验中常用的TAE和TBE缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。由于它含有氨基因此可以与醛发生缩合反应

Tris为弱碱，在室温（25℃下，它的pKa为8.1；根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到9.2之间。

Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于Tris的pKa的影响。

由于Tris缓冲液为弱碱性溶液，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性。人们常常在Tris盐酸缓冲液中加入EDTA制成“TE缓冲液”，TE缓冲液被用于DNA的稳定和储存。如果将调节pH值的酸溶液换成乙酸，则获得“TAE缓冲液”（Tris/Acetate/EDTA），而换成硼酸则获得“TBE缓冲液”（Tris/Borate/EDTA）。这两种缓冲液通常用于核酸电泳实验中。

5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液 成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 445 mmol/L Tris碱 445 mmol/L 硼酸盐 10 mmol/L EDTA 水 54g 27.5g 硼酸 20 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 补足1L

1 Rnase是一种蛋白酶，能够降解RNA。

2我们的手上皮肤上有很多，应该是对我们的身体起保护作用。保护不被RNA病毒感染？或者什么的。

3 这个酶高效稳定。要么在DEPC水中处理n小时，要么在160度高温烘烤6小时。此酶才会失效。

4 所谓DEPC，是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。有毒啊。所谓DEPC水，一般指两种状态，a，配制 好未消毒；b，配制好已消毒。通过高压消毒，该物质会降解，从而无毒。

1 无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室温搅拌4小时以上至完全溶解，高压灭菌20分钟，冷却备用。这个是DEPC水的b状态。

2 如果你要用DEPC水处理Tips等等东东，那么就要用高压前的水，即DEPC水的a状态。把枪头管子等完全浸泡至少8小时，我一般都是过夜的，或者平时就泡在里面备用。

RNA提取必须创造无RNase的环境，所有仪器与试剂均按照以下方法进行处理 ：研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在180℃烘干4h以上； 电泳槽、胶板、梳子、用0.1 %～0.2TPC水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用0.5%的SDS (Sodium dodecyl sulfate，抑制RNase的活性)浸泡过夜，然后用ddH2O冲洗干净，晾干备用；离心管，枪头等塑料器皿要用0.1%～0.2TPC水处理之后(DEPC有致癌之嫌，须小心操作)。37℃保温12h以上，然后高压灭菌，灭活DEPC

( Diethypyrocarbonate )；溶液都需用经DEPC处理过的水配置， RNA提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。

我们研究所里提RNA用的枪头和EP管都是高压两遍的，没有用DEPC水处理。 1、 有灭菌过的DEPC水，这一般是用来配75%乙醇用，因为乙醇若高压灭菌会挥发，所以乙醇是新开封专用的。

2、 没有经高压灭菌的DEPC水，这主要是用于配你提RNA所用的其他试剂（所说的试剂是可以经高压灭菌的），总的来说，都得经过高压灭菌，目的就是要去除DEPC，以防止它以随后实验的干扰。

3、 DEPC处理水：无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室温搅拌4小时以上，121 度高压灭菌20分钟，冷却备用。

凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂. 为啥在28s之后还是有影影约约的片断？和模糊的smear？

这都与非变性电泳方式有关。RNA 的电泳，严格讲是要使用变性电泳的，我们平时所知道的 RNA 电泳的知识，实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变性电

泳实在是太方便了，同时，就一般检测而言，完全可以替代变性电泳，所以我们日常检测就都使用非变性电泳了。

电泳时间太长了容易产生降解。最好是在120V左右。操作的时候有没有注意戴口罩和手套，注意，手套要经常换，不要太节约了。那样也会影响RNA的质量。无论你是提什么RNA只要是用异丙醇沉淀的，都得用75％的酒精洗涤一次。 1 样品不要太多，抽提务必充分，室温放置5min； 2 200ul氯仿 剧烈振荡20s，室温放置2－15min； 3 13000g 离心 15min;

4 取上层水相,一般400-450ul就足够了，千万不要贪多！*** 5 加入500ul异丙醇 摇匀，室温放置10min； 6 12000g 离心 10min；

7 75％乙醇 1000ul 洗涤沉淀；

8 7500g 离心 5min；（12000转速太高了吧，沉淀不容易溶解的）

9 弃乙醇，吸干净残余的微量乙醇， 室温干燥3－5min；（时间太久沉淀不易溶解）

10 适量DEPC水溶解沉淀。 电泳的上样量1ug，电泳buffer用DEPC处理的水配制，电泳时间不要太久，95V，10－15min足够了。

建议跑RNA电泳。先用2％琼脂糖胶，若分离效果不好，可用甲醛变性胶。在上样缓冲液中注意加入RNA酶抑制剂。注意观察带形，质量较好的RNA亮度 。28S:18S应为2:1。还要注意观察，在加样孔或刚出加样孔附近，有没有带， 若有，可能为基因组DNA污染。 OD值只有1.5，可能为基因组DNA污染。参考一下分子克隆3。上面有OD值与 污染DNA的关系。建议，酚氯仿抽提后，上清可少吸一些。提取后的RNA样品可用无RNA酶的DNA酶消化一下。注意该酶的buffer中有一种物质在OD260有吸光度，应严格按照其protocol操作，减少误差。

配1000ml的DEPC处理水，加1mlDEPC。 磁力搅拌器搅拌 过夜 。第二天 高压蒸汽灭菌 121c，25min DEPC分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。 最好分装小瓶来用，尽量避免污染。 搞一次也不容易

DNA的碱基数大于5000bp而RNA一般只有28s条带和18s条带可见,它们的碱基数在600bp到5000bp之间且28s的亮度大概是18s的1.5倍,5s一般看不到

RNA的琼脂糖凝胶电泳而且28S为5000kb左右，18S为2000Kb少一点

RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。

三、实验材料、器具及药品

蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。

四、实验步骤

（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。

RNA的变性琼脂糖凝胶检测 试剂：

（1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3）甲醛。

（4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1TPC水冲洗。

操作：

（1） 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。 （2） 配制琼脂糖凝胶。

①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。 ②待胶凉至60--70 ℃，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。 ③灌制琼脂糖凝胶。 （3） 样品准备：

① 取DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品4.5ul,混匀。

② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。 ③ 向管中加入3ul 上样染料，混匀。 （4）上样。

（5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。 （6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。

做如何用DEPC处理EP管和枪头呢？是不是EP管放在一个大烧杯里，加入0.1%的DEPC水，封口，37度过夜浸泡，之后放到高压灭菌锅里高压两次，每次一小时，然后打开封口，倒掉水，再高压一次，然后烘干？感觉有点不太对劲啊

灭一次菌就可以了，但要单独灭菌，盒子也要用DEPC水处理，盒子各枪头各灭菌，枪头一般放在铝饭盒里灭菌，用时再放到枪头盒中。

电泳缓冲液也都要用DEPC处理的水来配制（先灭好DEPC处理的水，再配）。

电泳槽和制胶的玻璃板用处理也要处理。电泳槽先用双氧水浸一晚，再用DEPC处理的水洗。制胶的玻璃板用专用的处理液处理一下就好

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