家畜传染病学教学实习

实习一 猪瘟的诊断

目的

了解和掌握猪瘟的现场诊断和实验室诊断方法

内容及方法

猪瘟的诊断程序

人工感染或自然病例 观察症状 剖检 观察病理变化 兔体交互免疫试验 荧光抗体诊断 扁桃体、淋巴结、脾 采集病料 脾脏 称重、匀浆 冷丙酮固定4°C10min 猪瘟荧光抗体染色 37°C作用30min PH 8.0PBS液涮洗5min 0.1％伊文斯兰复染3sPH8.0 PBS液涮洗2min 碳酸盐缓冲液封裱 观察测温7天 耳静脉注射100倍稀释的猪瘟兔化弱毒1mL/只 测温4天，每天4次 绘制两组兔的体温曲线 判定结果 对照组家兔3只，注射生理盐水5mL/只 肌肉注射实验家兔3只，5mL/只 加双抗4℃下作用6h 制备1：10的组织悬液 冰冻切片 荧光显微镜下观察 判定结果 一 猪瘟病例的人工感染

（一） 种毒：为购自中国兽药监察所的猪瘟中国石门系强毒，采集高热期抗凝血保存，或采集病死猪的脾脏、淋巴结研磨处理，按稀释1：10倍稀释，加双抗处理后使用。

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（二） 感染用猪：应选用断奶后未经猪瘟疫苗免疫的猪。

（三） 感染方法：用血毒或脾、淋毒，肌肉注射、滴鼻、口服，每头共计4mL。 （四） 感染时间：最好于试验前6～7天（1周）进行。一般2～3天潜伏期，7天后就可死亡。

二 观察临床症状，剖检观察病理变化，采集病料 （一）临床症状

最急性型：突然发病，症状急剧，主要表现高温稽留，皮肤和黏膜有紫绀和出血，与一般败血症无异，一至数天死亡。 急性型：

1．突然发病，食欲显著减少或完全停食，喂食时，不表现饥饿感，徐徐走近食槽，缓慢嚼食，但食数口后，即退出卧下，有的病猪连续多天完全停食，有时呕吐。

2．精神高度沉郁，伏卧嗜眠，肌肉震颤，常挤卧于一隅或钻入草堆，呈怕冷状，触动时或发低沉的叫鸣而不动，或徐徐站起，走几步后，又卧地，或表现敏感，发出尖锐的叫声，站立或行走时，背腰弓起，四肢软弱无力，发抖，行动缓慢，摇摆不稳。

3．体温升高至41℃以上，高的可达42℃以上，稽留不退，死前降至常温以下，在体温升高时，白细胞减少，约13000以下，甚至仅有3000，一般以发病后4～7天最低，血小板也减少。

4．两眼无神，开张不全，常有多量粘液—浓性分泌物，清晨可见两眼粘封，不能开张，结膜潮红发炎，后期结膜苍白，常有出血斑点，口腔黏膜苍白或发绀，唇内面、齿龈、口角、会厌、喉头和阴道等处的黏膜可能有出血斑点。

5．皮肤通常充血，末期多呈现贫血状态，有些部位如鼻端、嘴唇、耳、下颌、四肢、外阴等处，可能出现紫绀区或出血变化，公猪包皮内积有尿液，挤压时流出浑浊发臭的尿液。 6．初便秘后腹泻，初期粪便干结，呈小球状，后期腹泻状粪便，病程长的便秘和腹泻交替出现。

7．病程为1～3周，后期常并发细菌感染，以肺炎和坏死性肠炎最为多见。

8．有的病猪主要表现神经症状，嗜眠、磨牙、全身痉挛、体躯强直、不易起立、运动障碍。 亚急性型：似急性型，但较缓和，有时好转，病程约3～4周。

慢性型：消瘦，贫血，衰弱，伏卧，时有轻热，食欲不振。便秘和腹泻交替，有的皮肤有紫斑或坏死痂，病程在一月以上。 （二）病理变化 急性型：

1．淋巴结的变化比较特殊，以腹腔淋巴结最为明显，表现肿大充血，呈暗红色，切面多汁，呈弥漫性出血，边缘部分尤为显著，杂有贫血变化，因而呈大理石状。 2．肾色较淡，出血斑点分布在皮质，髓质少见，肾盂和肾乳头也常见到。

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3．脾不肿大，边缘呈出血性梗死，有突起小块，色紫黑。有时为边缘性出血带。 4．胆囊黏膜可能有出血斑点或坏死。 5．肺充血出血、支气管肺炎。

6、扁桃体常有炎症，初期轻，后期发展成为两侧性坏死性炎症。 7、喉头和膀胱黏膜也常见出血点。

慢性型：主要为坏死性肠炎，一般见于回肠末端，盲肠和结肠的黏膜上，炎症从淋巴滤泡开始，向外发展，因而形成同心轮层状的钮扣状溃疡，突出于黏膜面，色褐或黑，中央低陷，有的有剥脱现象。

（三）病料采集：脾、淋巴结、扁桃体、肝、肾。 三、病料研磨与处理

脾 称重 剪碎 研磨 稀释（W/V）1：10 反复冻融3次 双抗处理（1000u/mL）4℃作用6h以上 离心取上清液-20℃保存。 四、病料冰冻切片

1．连接好半导体致冷器和切片机后，检查水管是否接好，先开冷却水，再开致冷器，预热３min~５min。

２．将致冷键置于刀台共冷上，调节电流到15~20mＡ处，刀台即开始逐渐冷却。 ３．调节切片厚度至４um～５um。

４．待台上结霜后将修好的组织块贴于台上，待组织块冻实后，转动手动摇把，先修正组织块，再切片，迅速将切下的组织薄片贴于玻璃片上。 ５．自然干燥或风干后，用冷丙酮固定，４℃１５min。

6．取出晾干或风干，贴标签，用纸包好，外用厚而不漏水的塑料袋密封，置４℃保存。 五．病料上清液接种家兔（兔体交互免疫试验）

一组6只 观察测温3天，2-3次/天 健康家兔12只 体温应正常 二组6只 试验组3只 接种病料上清液肌注5mL/一组

对照组3只 测温5~7天 8h一次，3次/日 试验组3只

二组 接种生理盐水5mL/只 对照组3只 注意：测温要认真，仔细。 六．猪瘟荧光抗体染色、观察

1．在固定好的冰冻切片上滴加数滴猪瘟荧光抗体，置37℃水浴箱中作用30min。 2．用pH7.2的PBS漂洗3次,每次5 min～10min 。

3．干后滴加甘油缓冲液，加盖玻片封闭，用荧光显微镜检查。

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4．如细胞胞浆内有弥漫性，絮状或点状的亮黄绿色荧光，为猪瘟；如仅见暗绿或灰蓝色，则不是猪瘟。

5．试验设已知含猪瘟病毒材料压印片和不含猪瘟病毒材料压印片，作为阳性和阴性对照。 6．标本染色和漂洗后，浸泡于5%吐温80—PBS（pH7.2，0.01mol／Ｌ）中１h以上，可除去非特异染色，晾干后用0.1％伊文思蓝复染15~~30min，检查判定同上。 七、猪瘟兔化弱毒接种试验家兔 （一）猪瘟兔化弱毒

1．猪瘟兔化弱毒疫苗：生药厂生产，在有效期范围内

2．家兔猪瘟兔化弱毒脾脏：采自具有定型热或轻型热反应的家兔，称重 研磨 反复冻融3次 离心取上清液 双抗处理 备用。

（二）接种方法

试验组与对照组家兔耳静脉注射1mL/只，注意缓慢注射。 （三）接种后的管理与观察 1．观察注射后家兔的反应。

2．测温：每6h测温一次，4次/日，连续测温3天，当出现典型的定型热或轻型热反应后，于体温下降至常温前扑杀，采毒。

八、猪瘟兔体交互免疫试验的结果判定 （一）几个概念

1．常温：家兔接种前数次体温的平均值。

2．潜伏期：由接种时算起，到体温上升超过常温的间隔时间。

3．稽留期：从体温超过常温0.5℃以上算起，到体温下降或接近常温时的间隔时期。 （二）体温反应的类型

热型 定型热 轻型热 可疑热反应 无热反应 潜伏期 24h～48h 24h～72h 温差 ＞1℃ ＞0.5℃ 体温正常 温次 ＞3次 ＞2次 稽留期 18h～36h 12h～36h ＜24或＞72，体温曲线起伏不定＜12h或＜36h （三）判定标准

1．试验成立的条件：当对照组家兔注射猪瘟兔化弱毒后发生定型热或轻型热反应，则说明试验成立，即所注射的就是猪瘟兔化弱毒。 2. 根据试验组家兔发生的热反应，进行判定。 接种病料后 － + － + 接种兔化毒后 － － + + 结果 +（猪瘟） －（病料内有兔化弱毒） －（非猪瘟，不含猪瘟病毒） －（非猪瘟，含非猪瘟病毒的致热物质） 4

实习二 鸡新城疫的诊断

目的

1． 掌握鸡新城疫的临诊诊断要点。

2． 系统地了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和免疫监测技术。

内容与方法

鸡新城疫的诊断程序

实验鸡选择 病毒增殖 人工感染鸡 临床症状观察 剖检、病理变化观察病料采集 肝、脾、法氏囊、盲扁、肾 4℃保存 冰冻切片 脾、脑、肝 称重、匀浆、制成1：5悬液 冷丙酮固定4℃10min 加双抗4℃处理6h 新城疫荧光抗体染色 37℃作用30min PBS液涮洗5min 0.1%伊文思兰复染5s PBS洗2min 碳酸盐缓冲甘油封裱 荧光显微镜观察 5 接种9～11日龄鸡胚尿囊腔 37℃～38℃孵育72h 收集鸡胚尿囊液 做血凝试验检测尿囊液的血凝性 做血凝抑制试验 判定结果

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