考研中国科学院硕士分子遗传学真题1997年

1997年试题

一、简要解释下列名词或概念

1．promoter, enhancer 2．genome, genome project 3．shuttle vector 4．Western blot, Southern blot 5．gratuitous inducer 6．RNA editing

7．gene, pseudogene 8．α-complementation 9．C0t1/2 10．consensus sequence

11．isoschizomer 12．C value paradox 13．reverse genetics 14．gene-targeting

15．amplified fragment length polymorphism(AFLP)

二、原核生物是如何区分起始密码子AUG与基因内部密码子AUG? 三、扼要说明亚硝酸、甲磺酸乙脂(EMS)和紫外线的诱变机理。

四、以乳糖操纵子(lac operon，由lacI、lacP、lacO、lacZ、lacY 及lacA组成)为例，说明何为顺式作用因子(cis-element)和反式作用因子(trans-element)，以及它们各自如何起作用。

五、生物体合成DNA的忠实性要比其合成蛋白质的忠实性高出至少一个数量级。试解释导致这种差异的分子机理。其生物学意义何在?

六、何谓质粒?何谓其严紧型与松弛型?决定质粒相容性的机理是什么?

七、为了弄清某种重要生命现象(性状)的分子机制，分子遗传学家通常首先进行遗传学研究，即诱变并筛选该生命现象(性状)发生改变的突变体。然而在实际工作中，经常不能获得预期中的突变体。试解释之。

八、基因组工程的完成将使得模式生物的DNA序列被全部测定，从而使得分子遗传学和分子生物学的研究真正进入基因功能鉴定的时代。请设计一种可以实际操作的系统性鉴定基因功能的实验方法。

1997年试题与参考答案

一、简要解释下列名词或概念

1．promoter：启动子。DNA分子上结合RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域，在许多情况下还包括促进这一过程的调节蛋白结合位点。B. Lewin在Genes中这样定义启动子：“Promoter is a region of DNA involved in binding of RNA polymerase to initate transcription.”

enhancer：增强子。远距离调节启动子以增加转录速率的DNA序列，其增强作用与序列的方向无关，与它在基因的上下游位置无关，并且有强烈的细胞类型依赖性。

2．genome：基因组。一个物种的单倍体细胞中所含遗传物质的总和称为该物种的基因组。 genome project：基因组计划。1990年正式出台和实施了“人类基因组计划”，其主要目标是绘制人类的遗传连锁图、物理图、序列图和转录图。现在已有许多国家都参与到基因组计划中，其主要目的是确定包括人在内的一些生物的全部DNA序列，及每个基因的结构和功能的一项宏大的科学研究工程。

3．shuttle vector：穿梭载体。通常是指那些既能在真核细胞(如哺乳动物细胞、酵母)中繁殖又能在原核细胞(如大肠杆菌)中繁殖的载体。因此这类载体必须既含有细菌的复制原点或细菌质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，如SV40的复制原点或酵母的自主复制序列。除上述的两类复制原点之外，穿梭载体同样必须具备可资利用的酶切位点和适合的筛选指标。这样，穿梭质粒既可以用来转化细菌，又可用来转化真核细胞。通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中进行繁殖、连接、再繁殖，最后转化到真核细胞中。

4．Southern blot：Southern印迹。该技术是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E. Southern于1975年首先设计出来的，故又称Southern印迹。

Westem blot：对DNA有Southern印迹法，而对蛋白质则有Western印迹法，这是将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素膜上，然后通过特定的蛋白质抗体进行反应，来检测被转移的蛋白质。

5．gratuitous inducer：安慰诱导物。细胞中的酶有的可以被诱导，有的可以被阻抑。如果某种物质能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱导物。对于β-半乳糖苷酶来说，除了能被分解的半乳糖苷(如乳糖)可以作为诱导物外，一些能被该酶识别但不能被分解的半乳糖苷化合物也能作为诱导物，如异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，简称IPTG)。IPTG有极强的诱导效应，而本身又不被分解，因而被称为安慰诱导物。

6．RNA ediring：RNA编辑。是指RNA转录过程中或转录后发生一些碱基转换、插入或缺失而导致基因密码潜力改变的一种转录后修饰。生成的mRNA分子在编辑区核苷酸序列不同于它的DNA模板相应序列。RNA编辑最早发现于锥虫线粒体中，之后在高等植物线粒体中广泛发现。RNA编辑位点主要是通过比较基因组DNA序列与cDNA序列而获得的，也可以通过比较基因组核苷酸序列与蛋白质氨基酸序列而获得。mRNA编辑的主要形式是C→U，偶尔也发现U→C。RNA编辑的发现是近年来对中心法则的重要补充，也提出了某些概念上的问题，如遗传信息是否都存在于基因序列中，指导RNA编辑的遗传信息是什么，RNA编辑的起源及其进化意义，RNA编辑如何进行加工，在hnRNA合成的哪个阶段进行等。 7．gene：基因。Mendel于1866年在他的豌豆杂交试验论文中首次提出遗传性状是由遗传因子控制的假设，丹麦学者Johannson 1909年第一次提出了“基因(gene)”这一术语。泛指那些控制任何性状，又依孟德尔规律传递的遗传因子。1911年，Morgan通过对果蝇的研究，证明基因在染色体上呈直线排列。经典遗传学把基因看作是一个不可分割的结构单位和功能单位。1944年，O. T. Avery通过肺炎球菌的转化试验，证明基因的化学成分为DNA，基因是DNA分子上的功能单位。后来，S. Benzer根据侵染大肠杆菌的T4噬菌体rⅡ区基因微细结构的分析，证明了基因的可分性，提出了突变子、重组子和顺反子的概念。认为顺反子属于遗传的功能单位，相当于传统意义上的基因，它包括许许多多突变子或交换子。而突变子和重组子经后来证明实际上是一个核苷酸对。顺反子学说彻底否定了基因是决定遗传性状的功能单位和突变、重组的最小单位这样三位一体的概念。顺反子学说认为，一个顺反子就是一个基因，这个基因或者编码蛋白质，或者编码RNA分子(tRNA、rRNA)。

pseudegene：拟基因。是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，却不能合成出功能蛋白质的失活基因。

8．α-complementation：α-互补。人们发现lacZ基因的突变体M15质粒(缺失氨基酸残基11～41)是没有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal能力的。但是如果在M15突变体的抽提物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残基的肽段(α肽)则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能力。这样一种基因内互补现象称为α-互补。

9．C0t1/2：DNA复性是一种双分子二级反应，单链消失的速度可用下面公式表示：(-dC/dt=kc2)，其中C为单链DNA的浓度，单位是每升的核苷酸摩尔数；t是时间，单位是秒；k是二级反应常数，单位是升/moL·秒。在初始t0时，C=C0。上式积分得C/C0=1/(1+k2C0t)，复性的分数C/C0是起始浓度和经过时间的乘积C0t的函数，这样的函数可以绘成图，称为C0t曲线。反应进行到一半时即C0t=1/2时的C0t值定义为C0t1/2，当C/C0=1/2时，C/C0=1/(1+k2C0t1/2)=1/2，C0t1/2=1/K2。当反应进行到一半时，影响DNA复性的因素中只有DNA序列的复杂性(X)是惟一可变的因素，即进行到一半时的C0t值，直接与DNA样品复杂度相关，X是复性能力的函数。

10．consensus sequence：一致序列或同感序列。基因能否有效转录取决于基因前的启动子，而启动子的强弱现已知主要是由两个区域决定的，一个在转录起始点-35处(转录起始处为+1)，另一个在-10处，它们都是AT丰富的顺序，其顺序特点为： 5′ TTGACA 5′ TATAATR AACTGT5′ ATATTAY5′ -35 -10

-10区的R与Y分别代表嘌呤和嘧啶碱基，-35区又称识别区，-10区为Pribnow方框所在处。在不同启动基因中，这两个区的顺序并不完全相同，但功能是一致的，只是引起转录作用的强弱不同，现称此类功能相同而顺序不完全相同的序列为同感序列或一致序列。

11．isoschizomer：同裂酶。有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸序列，这类酶特称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如限制酶Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ是一对同裂酶，共同的靶子

序列是CCGG。

12．C value paradox：C值矛盾。一个物种的单倍体的染色体的数目称为该物种的基因组。一个单倍体基因组的DNA含量总是恒定的，它通常称为该物种的C值。随着生物的进化，生物体的结构与功能越复杂，其C值也就越大。然而在另一方面，在结构、功能很相似的同一类生物中，甚至是在亲缘关系十分接近的物种之间，它们的C值也可相差数10倍乃至上百倍。人们无法用已知功能来解释基因组的如此之大的DNA含量，这就叫C值矛盾。

13．reverse genetics：反向遗传学。用离体定向诱变技术来制造和分析突变，在方法上与经典遗传学方法相反，因此又常被称为“反向遗传学”或“DNA分析遗传学”(genetics by DNA analysis)。反向遗传学的研究方法已在研究基因的表达和调控机制方面做出了很大的贡献，将来在分子遗传学和生物化学的各个领域，特别是蛋白质工程中必然发挥更大的作用。

14．gene-tagging：基因标签法。最早是由Bingharn等人于1981年提出的一种应用于果蝇的新技术(或称方法)，他们把它定义为：用转位因子特异性基因片段做探针，通过杂交分离出由转位因子导致突变的目的基因。

15．amplified fragment length polymorphism(AFLP)：扩增片段长度多态性。AFLP是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。其原理为基因组DNA用限制性内切核酸酶消化，然后连上一个接头(adaptor)，利用两个选择性引物进行PCR扩增，该引物含有接头和酶切位点序列，并且其3′端加上了2～3个随机核苷酸，即引物=接头序列+酶切位点序列+2～3随机核苷酸。这种技术将RAPD的随机性与专一性扩增巧妙结合，又通过选用不同的内切酶以达到选择的目的，故又称之为选择性限制片段扩增标记(selective restriction fragment amplification，SRFA)。

二、原核生物是如何区分起始密码子AUG与基因内部密码子AUG的?

答：原核生物是如何辨别在一个基因开始的AUG密码子和编码内部甲硫氨酸的密码子呢?实验发现：将30个核苷酸长度的大肠杆菌噬菌体R17合成A蛋白的起始区mRNA片段，使其与大肠杆菌多糖体形成复合物。然后把大肠杆菌素E3(Colicin E3)(它可从16S RNA的3′末端切下59个核苷酸)加到复合物中。用表面活性剂处理混合物，解离核糖体释放出RNA。释放出的RNA是mRNA-rRNA杂交分子。在这个杂交分子内，mRNA-rRNA片段通过氢键结合在一起。

早在1975年，Shine等就注意到上述现象，由此提出一种很吸引人的假设来解释起始密码子的识别。他们见到几种细菌16S rRNA 3′末端顺序为：5′PyACCUCCUA-3′，其中Py可以是任何嘧啶核苷酸。它可以和mRNA中离AUG顺序5′侧约10个碱基处有一段富含瞟呤的间隔顺序AGGA或GAGG(后来称此区域为Shine-Dalgarno顺序)互补。现认为正是由这样的配对将AUG(或GUG、UUG)密码子带到核糖体的起始位置上。

进一步支持Shine-Dalgarno假设的证据来自用其他细菌核糖体进行R17A蛋白合成效率的研究。测定了6种细菌16S rRNA分子3′末端顺序，发现碱基配对区的长度和强度(GC对和AU对的比值)是不同的。不同核糖体合成A蛋白的量与碱基对区的稳定性有关。这表明决定起始频率的主要因素是mRNA-16SrRNA碱基配对的强度。

另外原核生物中有两种tRNA能够携带甲硫氨酸。一种是一种是

，它只能识别内部AUG密码子。

，它只能识别起始密码子AUG，

首先与Met结合，然后在Met的NH2上产生

甲酰化作用从而封闭了这个氨基。这个氨酰tRNA可缩写为fMet-tRNAf。起始密码子AUG和GUG均由这种tRNAf所识别。而这两个密码子如果在mRNA的内部则分别由

和tRNAVal所识别。而在真核生

物中，情况有所不同。起始密码子只能是AUG，而没有GUG作为起始密码子的。识别起始AUG与内部AUG的工作同样是由不同的tRNA担任的，负责起始AUG识别的是

，负责内部AUG识别的是

。但Met-tRNAf并不被甲酰化。在哺乳动物线粒体中同样有两类tRNA分别识别起始AUG和内

部AUG，而且起始tRNA上携带的是甲酰化的甲硫氨酸。不同的是线粒体Met-tRNAf还能将AUA、AUC、AUU用作起始密码子。

三、扼要说明亚硝酸、甲基磺酸乙脂(EMS)和紫外线的诱变机理。

答：1．亚硝酸引起的氧化脱氨反应。凡是含有NH2基的碱基(A、G、C)都可以被亚硝酸作用产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，然后改变配对性质，造成碱基转换突变。它与碱基类似物的突变机制相似，差别只在于碱基类似物是在DNA复制时由外界渗入，而亚硝酸是氧化DNA链上已有的碱基。但是它们同样需要两轮复制才能产生稳定的突变。在亚硝酸作用下，胞嘧啶可以变为尿嘧啶，复制后可引起G·C→A·T转换；腺瞟呤可以变为次黄嘌呤(hypoxanthine)，复制后可引起A·T→G·C的转换；鸟嘌呤可以变为黄嘌呤(xanthine)，它仍旧与C配对，因此不引起突变。尿嘧啶和次黄嘌呤都可以为各自的糖基酶修复系统所修复，如果当修复系统还未来得及修复时DNA就开始复制，前二者则导致突变。

2．甲基磺酸乙脂(EMS)为一种烷化剂，它主要引起碱基烷基化。烷基化位点主要在鸟嘌呤的N-7位上和腺嘌呤N-3位上，在腺嘌呤的N-7位有时也可以烷基化。由于鸟嘌呤上N-7的烷基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团，这个季铵基团产生两个效应：一是促进第1位氨基上氢的解离，使G不再与C配对而是与T配对，从而造成G·C→A·T转换。二是当N-7成为季铵基团后，减弱了N-9位上的N-糖苷键，而产生了去嘌呤作用。大部分的无嘌呤位点都可以被无嘌呤内切酶系统所修复，但是有时复制在修复之前进行，则在无碱基的位置上可以插入任何一个碱基。在第二轮复制以后，原来的G·C对可以变为任何碱基对G·C、C·G、A·T、T·A。既有转换，又有颠换。用较低的pH或较高的温度或二者结合去处理噬菌体DNA，则可产生去嘌呤作用。这样处理过的噬菌体DNA在复制时可产生大量的颠换突变，这与烷化剂的作用机制是一致的。

3．紫外线照射DNA时由于高能粒子的直接作用和自由基的间接作用，引起DNA分子的各种损伤，嘧啶二聚体是其中一种重要的损伤。这些损伤，诱发了错误的SOS修复系统，从而导致很高的突变率。 紫外线引起突变包括各种形式的转换和颠换。突变不是完全随机的，G·C→A·T转换最多，而且有某种序列优先性，如C处在TCA序列中产生的C→T转换率要比在ACA序列中高15倍。除碱基替代突变外，紫外线还能引起缺失、重复和移框突变。这些突变可能是直接作用、间接作用和SOS系统共同作用的结果。

四、以乳糖操纵子(lac operon，由lacI、lacP、lacO、lacZ、lacY及lacA组成)为例，说明何为顺式作用因子(cis-element)和反式作用因子(trans-element)，以及它们各自如何起作用。

答：lac操纵子模型最早是由Lacob和Monnd于1961年提出的，它是DNA分子上一段有方向性的核苷酸顺序，由阻抑蛋白基因(lacI)，启动子(P)，操纵基因(O)和编码三个与乳糖利用有关的蛋白质的结构基因(Z、Y、A)所组成。操纵子的大部分核苷酸顺序属于结构基因，调控基因除I基因(1080bp)外，主要为P、O基因，占122bp，其中P与O有重叠部分。此操纵子含有三个编码酶蛋白Z、Y、A，它们在乳糖代谢中分别起不同作用，其中Z基因的产物为β-半乳糖苷酶，它可水解乳糖，生成葡萄糖和半乳糖，以使细菌细胞可以利用；Y基因的产物是与乳糖有关的通透酶，无此酶乳糖无法进入细胞；A基因的产物为半乳糖苷乙酰化酶，是个去毒作用的酶。lacI基因为编码阻抑蛋白的基因，它属于组成型的调控，是经常表达的。启动基因(P)，又称启动子，是转录起始时RNA聚合酶结合部位；操纵基因(O)，是阻抑蛋白结合部位，它们都位于结构基因之前。在此区域内还有一个能与CAP-cAMP复合物结合的部位。位于I基因与P基因之间。

lac操纵子基因平时因受阻抑是关闭的，经变构后可出现一个十字架结构，这是因为阻抑蛋白与O基因结合，O基因顺序中有反转重复顺序，在空间上能妨碍RNA聚合酶转录。当受到诱导物作用时转录即开始，转录酶即RNA聚合酶可同启动子(P)结合，然后向右移动到达一定部位开始转录。

上面所述，操纵基因片段是个反转重复顺序，可形成十字架结构，正好可以接受阻抑蛋白的结合(阻抑蛋白是四聚体)，因而在阻抑状态下的操纵子就不能产生这些与乳糖代谢有关的酶。加入诱导物(如乳糖或某些类似物)后，可与阻抑蛋白形成复合物而使阻抑蛋白构型改变，阻抑蛋白不能再与O基因结合，基因表达开放，经过延长就会转录出一条多顺反子的mRNA链，继而翻译出三个相关的酶。另外在RNA聚合酶结合部位的上游(即P基因上游)处，还有一个CAP-cAMP结合部位，又可进一步诱导加强此操纵子的表达。当细胞内乳糖分解出的葡萄糖被利用后，会使cAMP的浓度上升，因而可结合CAP共同作用于乳糖

操纵子的CAP-cAMP结合部位上。CAP-cAMP是一个正诱导调节因子，故又可使转录产物大量增加。但当有大量葡萄糖供应时，此cAMP浓度会下降，又会妨碍许多分解代谢基因包括乳糖操纵子基因的表达，以减少这类操纵子的表达。CAP-cAMP同DNA结合后的作用，现在认为可能是有利于RNA聚合酶同启动子结合，从而发挥进一步的诱导作用，它们的作用与对阻抑蛋白质诱导作用相辅相成。乳糖操纵子的上述调控方式是很合理的。在葡萄糖供应充分时，细菌即利用葡萄糖作为碳源；在葡萄糖耗尽后而需利用乳糖时，经过一个短的潜伏期就会开放乳糖操纵子产生分解乳糖的酶，由乳糖作为碳源，使细菌能在仅有乳糖的条件下生长。

生物的启动子、终止子、增加子和衰减子等是由若干可区分的DNA序列组成的，由于它们和特定的功能基因连锁在一起，因此称为顺式作用因子。这些序列组成转录的调控区，影响基因的表达。

反式作用因子是指能够直接或间接地识别各顺式作用元件，参与调控靶基因转录效率的一类蛋白质。不同DNA顺式作用元件与相应的反式作用元件的相互作用，以及不同反式作用因子之间的相互作用是基因表达调控机制的基础。在lac操纵子中，启动子P及操纵基因lacO为顺序作用因子，而阻抑蛋白是反式作用因子。

五、生物体合成DNA的忠实性要比其合成蛋白质的忠实性高出至少一个数量级。试解释导致这种差异的分子机理。其生物学意义何在? 答：生物体合成DNA的忠实性要比其合成蛋白质的忠实性高出至少一个数量级，是由于DNA在复制过程中由以下机制来保证其高度的真实性的：(见1996年《分子遗传学》第六题答案)。

因为DNA是遗传信息的载体，也就是说遗传信息是贮存在DNA中，DNA通过复制。使遗传信息代代相传，DNA复制的高度忠实性保证了物种的稳定性。

六、何谓质粒?何谓严紧型质粒与松弛型质粒?决定质粒相容性的机理是什么?

答：质粒是存于细胞质中一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。虽然已发现线形质粒，但已知的绝大多数的质粒都是由环形双链DNA组成的复制子。除了酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒之外，迄今已知的所有质粒无一例外地都是属于这种类型的DNA分子。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定的条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，可将质粒分成两种不同的复制型：一种是低拷贝数的质粒，每个寄主细胞中仅含有1～3份的拷贝，我们称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒；另一类是高拷贝数的质粒，每个寄主细胞中可高达10～60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒。

所谓质粒的不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定共存的现象。在细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥(稀释)掉。这样的两种质粒称为不相容质粒。质粒的不相容性主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻抑蛋白质，其浓度是与质粒的拷贝数成正比例的。阻抑蛋白质通过同其靶序列之间的相互作用，使双链DNA中的一条链断裂，从而导致质粒DNA复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻抑蛋白时，其复制活动便被抑制了；而当质粒处于低拷贝和低浓度阻遏蛋白质的条件下，它的复制反应便会继续进行。

根据这种道理，如果同一个细胞中含有两种相容的质粒，那么每种质粒所产生的阻抑蛋白质都不会影响另一种质粒的复制。因此两种相容的质粒保持着自己正常的拷贝数，而与另一种质粒毫不相关。相反地，如果同一个细胞含有的是两种不相容的质粒，它们各自产生的阻抑蛋白质不仅调节自身的复制，而且会调节另一种与之共存的不相容质粒的复制。这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。其原因是在这种情况下，每一种质粒的复制速率和拷贝数控制都是由一对不相容质粒产生的阻抑蛋白质总浓度联合调控的。

在一个细胞中两种不相容的质粒组成一个统一的质粒库，而拷贝数控制体系又无法辨别它们，只是随机地从中选择一种典型的进行复制。这样一来，尽管细胞中质粒的总拷贝数得到了调节，但两种质粒之间的复制数是有所偏差的。因此经过了几个复制周期和细胞分裂世代之后，不可避免地会出现不相容质粒的分离。

七、为了弄清某种重要生命现象(性状)的分子机制，分子遗传学家通常首先进行遗传学研究，即诱变

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