山东大学微生物各个章节学习辅导 - 图文

山东大学微生物复习题

第一章： 绪论 重点与难点剖析

1、微生物及其共性——微生物的研究对象以及它们区别于其他生物的特征（微生物的共同特征） 微生物：是肉眼看不清、微小生物的统称。

其研究对象包括：病毒、古菌、细菌、真菌、许多单细胞藻类和原生动物。其中病毒属于非细胞类特殊类群，古菌和细菌属于原核生物， 真菌、,单细胞藻类和原生动物属于真核生物。

微生物以其独特的共性特征而区别于其他生物，归纳为五大共性： （1）体积小, 结构简单，表面积/体积比值大; （2）代谢活力强, 吸收多, 转化快; （3）生长旺, 繁殖快;

（4）分布广, 种类多（多样性）; （5）适应性强, 易变异。

体积小、比表面积大特别有利于它们和周围环境进行物质、能量、信息的交换。微生物的其它很多属性都和这一特点密切相关。微生物的主要特征贯穿于基础微生物教学的各个章节中。

2、微生物学(Microbiology)

微生物学是研究微生物以及其独特的相关研究技术的科学。

3、微生物的发现

1676年，微生物学的先驱荷兰人列文虎克（Antony van leeuwenhoek）首次观察到了细菌。列文虎克的兴趣和爱好就是利用业余时间制造显微镜，并具有高超的使用技术。据说他曾制作过400多架单式显微镜和放大镜，放大率一般为50~200倍。

4、微生物学的建立（巴斯德与柯赫对微生物学发展的重要作用与意义-奠基者） 法国人巴斯德（Louis Pasteur）（1822～1895）和德国人柯赫（Robert Koch）（ 1843～1910）被誉为微生物学的奠基人，是由于他们伟大的贡献。他们的工作为今天的微生物学奠定了科学原理和基本的方法。 1)、巴斯德的主要贡献及意义：

巴斯德开辟了微生物领域，并以倡导疾病细菌学说、发明预防接种方法而闻名，具体贡献为：

(1) 以著名的曲径瓶试验彻底否定了“自然发生”学说；巴斯德简单而完美的实验奠定了一种科学而理性的基础，表明微生物可以通过理性的科学的方法进行研究。自生说被否定的意义之一是：既然不是自生的，就必然已经存在，人们就可以去探索它，寻找它。由此将微生物的探索方法由一项科学性观察转向成了一项实验科学，打开了研究感染性疾病病因的方法之门。

(2) 在免疫学的预防接种方面，发现传染疾病的微菌，在特殊的培养之下可以减轻毒力，变成防病的药苗。首次制成狂犬疫苗；

(3) 发现并证实发酵是由微生物引起的； (4)其他贡献，如巴斯德消毒法等 2)、柯赫的主要贡献及意义

（1） 对病原细菌的研究作出了突出的贡献：包括具体证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌；发现了肺结

核病的病原菌（1905年获诺贝尔奖）；提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则 ——著名的柯赫原则，即 ① 在每一相同病例中都出现这种微生物；② 要从寄主分离出这样的

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微生物并在培养基中培养出来；③ 用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生；④ 从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。

（2） 微生物学基本操作技术方面的贡献包括：细菌纯培养方法的建立；设计了各种培养基，实现了在

实验室内对各种微生物的培养；流动蒸汽灭菌；染色观察和显微摄影等技术。

柯赫根据巴斯德的工作，证明了微生物是疾病的原因，并进一步表明：特定的疾病是由特定的微生物引起的。进一步将微生物研究推向更高的一种科学水平上，形成了疾病确定的“柯赫原则”。与此同时柯赫还向微生物学贡献了一系列研究技术。“柯赫原则”以及柯赫发明的纯培养技术，促进了微生物学的极大发展。

5、微生物学的发展及贡献

(1)多学科交叉促进微生物学全面发展，使微生物学发展成为生命科学领域内一门发展最快，影响最大、体现生命科学发展主流的前沿科学。 (2)微生物学推动生命科学的发展。.促进许多重大生命理论问题的突破；对生命科学研究技术的贡献，如细胞的人工培养、突变体筛选、DNA重组技术和遗传工程、.微生物与\人类基因组计划\等。

第二章： 纯培养技术和显微技术

重点与难点剖析

一、 纯培养技术 1、分离获得微生物的纯培养物是研究利用微生物的基础。获得纯培养物涉及的相关技术包括：无菌技术、 微生物的分离与分离纯化技术和微生物培养和保藏技术。

2、无菌技术：包括培养基和物品的各种灭菌技术和微生物各种接种过程的无菌操作技术等。重点在实验课中掌握相关的技术原理和操作规范，以牢固树立“无菌”的思想和概念。

3、固体培养基分离纯培养物的基本方法和原理

纯培养指的是只有一种微生物组成的细胞群体。自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本原理：首先采用方法将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。进行微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基由于能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体-即纯培养，而成为常用而简便的分离介质和营养介质。

固体培养基分离纯培养物由于稀释方法的差异和接种平板的方式差异而分为以下几种方法： （1）划线平板法

将合适的无菌培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板，按以下方法划线：

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平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。 （2）倾注平板法和涂布平板法

这两种方法的共同点就是在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，参考下图：

随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。

稀释倾注平板法的操作是：选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液与灭完菌冷却到50-55°C的培养基混合均匀，一起倒入无菌培养皿中，冷却形成平板后，培养。

稀释倾注平板法操作较麻烦。在进行微生物分离纯化时，该方法需要样品与热的培养基混合，因此对热敏感微生物的影响明显；该方法操作过程中，样品中的微生物有的分布于平板表面，有的则裹在培养基中，后者则会影响严格好氧微生物的生长；而且，对于同一种微生物，平板表面的菌落形态与培养基内的菌落形态会存在着明显的差别，影响菌落形态的判别。在进行微生物计数时，该方法细胞分散均匀，计数较准确。

稀释涂布平板方法的操作是：首先将灭完菌冷却到50-55°C的培养基倒入无菌培养皿中冷却形成平板，然后选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液加到平板中央，以三角刮刀将之均匀地涂布于整个平板上，培养。

稀释涂布平板方法操作相对简单，它克服了倾注平板方法对热敏感微生物、严格好氧微生物和培养基内部菌落带来的不利影响，是实验室中经常使用的常规分离方法。其存在的问题是有时会由于菌液太多或者涂布不均匀而使细胞分散不充分，影响计数结果和分离纯化效果。 （3）稀释摇管法

主要用于厌氧微生物的分离纯化，是稀释平板法的一种变通。其基本操作流程为：试管培养基融化 ? 50度保温 ? 样品梯度稀释后加入试管培养基中 ? 摇匀冷却凝固 ? 石蜡油封闭 ? 培养。细胞固着于试管的琼脂柱中，再加以石蜡覆盖，就可以进行厌氧菌的分离纯化。由于氧的存在对严格厌氧微生物有毒害作用，因此严格厌氧菌的培养往往需要专业的厌氧操作设备。因此，稀释摇管法在虽然观察和挑取菌落时比较困难，但是在缺乏专业设备的条件下，此法仍是一项方便有效地进行厌氧微生物分离、纯化和培养的低成本方法。

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所有以稀释为基础达到分离纯培养物的方法，其前提条件是该类群的微生物细胞必须在群体中占有数量上的优势，才能够在不断的稀释中不被淘汰而保留下来。 4、液体培养基分离纯培养的原理

液体培养基分离纯培养物仍然基于稀释的基本原理，但是需要高度稀释，致使一支试管中分配不到一个微生物细胞，至多只有一个细胞，这样才能够在液体培养基中获得纯培养物。因此根据统计学原理，采用稀释法进行液体分离纯培养物时，必须要求在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）试管中表现为不生长，这时表现为生长的试管中为纯培养的可能几率就增大（据统计计算，若同一稀释度的试管中有95%表现为不生长，在有细菌生长的试管中培养物来源于一个细胞（即纯培养）的几率为97.5%。来源于两个细胞的几率为2.44%，来源于三个细胞的几率为0.04%） 5、选择培养分离与富集培养

所有以稀释为基础达到分离纯培养物的方法，其前提条件是该类群的微生物细胞必须在群体中占有数量上的优势，才能够在不断的稀释中不被淘汰而保留下来。非数量优势微生物类群的分离纯化则可以首先通过选择培养与富集培养的方式使其数量增加，成为数量优势菌群后，再通过上述各种平板法进行分离和纯化。

选择培养就是通过添加抑制剂，抑制大多数其它微生物的生长；或者选择特定的营养物，使得需要的微生物易于快速生长。

——没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。

富集培养就是利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。

6、 微生物的保藏技术

性状稳定的菌种纯培养物是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异 b）污染 c）死亡 基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱。

基本方法：生活态: 培养基传代培养(斜面、平板、半固体); 寄主传代培养 休眠态’ 冷冻(液氮、低温冰箱); 干燥(沙土管、冷冻真空干燥) 其它方法：滤纸片;明胶片;蒸馏水

对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。

二、显微技术

由于微生物微小，多数肉眼无法看见，因此对于微生物世界的认识必须借助于显微技术。显微技术不仅与显微镜自身的原理和特点有关，也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术。因此显微技术是微生物学的重要内容之一，在了解各种显微工具及其原理和应用优势后，还必须紧密结合试验课程熟练掌握微生物学研究的常规显微工具。 1、显微镜的分辨率

显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨率（Resolution）有关， 它是决定观察效果的最重要的指标。

分辨率（力)（Resolution，R) 指的是显微镜能够分辨两点之间最小距离能力。能够分辨的距离越小，分辨率越高，反之越低。 依据德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距离被称为最小距离（d）

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0.5 λ

最小可分辨距离： d = —————— n sin θ 公式解析： （l）所用光源的光波波长（λ），是影响最小可分辨距离的最主要因素。可见光光线的波长为400-700nm，，其中蓝光的波长最短（400-500nm），最小可分辨距离最小，所提供的分辨率最高（所以为什麽大多数显微镜的滤光片都是蓝色的）。

（2）θ: 为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离。

（3）n：玻片（样品）与物镜间介质的折射率(空气：干燥物系；香柏油：油浸物系)。

（4）n sinθ : 被称为数值口径（Numerical Aperture, NA)，它是决定物镜性能的最重要的指标。

分辨率从定义上讲，与可分辨的最小距离（d）成反比，可表示为：Ｒ?（１／ｄ）。以这种方式将最小可分辨距离与分辨率作为两个概念分开理解，比较容易理解提高分辨率的相关措施（获得最小分辨距离 ? 提高分辨率）：

（1）减短光波波长（λ）。

（2）增加镜口角(θ),这是增加数值口径的因素之一。

（3）增加介质的折射率(n)，这是增加数值口径的重要因素。如，利用油镜进行显微观察时，以香柏油取代空气，其重要作用就是提高介质折射率，使数值口径和分辨率均得到提高，同时香柏油与玻璃的折射率相近，使得很多原来在透镜和载玻片表面因折射和反射而损失的光线可以进入物镜，提高照明亮度，改善观察效果。 2、明视野显微镜

明视野显微镜即常用的普通光学显微镜，其照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。解决的措施，一方面是对观察的样品进行改造，发展出各种染色技术，通过特殊的染色方法使细胞着色，增加与背景的反差，便于观察；另一方面进行显微镜的改造，由此发展出不同种类的显微镜，适用于不同的观察目的。 3、暗视野显微镜

暗视野显微镜则利用特殊的聚光器遮挡中心光源，实现斜射照明，使照射到样品上的透射光线无法进入物镜，但由样品反射或折射的光线进入物镜，因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的，由此达到增加反差，便于观察的目的。并且，使用暗视野显微镜，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，仍然可以发现其存在。 4、相差显微镜

光波的长短表现为颜色差别，光的振幅高低表现为明亮程度的不同。观察样品各部分厚薄、密度不同，光线通过时直射光和衍射光的光程产生差别，导致出现相位差。相差显微镜配备了特殊的光学装置，利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见，因此相差显微镜很适合观察活的细胞以及细胞内的一些细微结构。相差显微镜实现这一目的的特殊的光学装置主要是环状光圈和相板。 5、荧光显微镜

紫外线光源照射在具有荧光素的样本上，荧光素激发出荧光，使标本在暗的视野中显现出光亮的物体，不同的荧光素还表现为不同的颜色，由此可以进行定性和定量的研究。主要应用于免疫学、环境微生物学和分子生物学等方面。

6、电子显微镜——透射电子显微镜与扫描电子显微镜 电子显微镜与光学显微镜的差异：

1） 以电子波(波长最短可达到0.005 nm)代替光源，由于波长的极大缩短而大大提高了分辨率。光镜的最高分辨率可达到0.2μm，这种局限是由可见光的性质决定的，与显微镜自身的性能无关。电镜实际的分辨率比光镜提高约1000倍。

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2）电镜镜筒中要求高真空（在电子的运行中如遇到游离的气体分子会因碰撞而发生偏转，导致物象散乱不清）。电子显微镜因需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物。

3）以电子透镜（电磁圈）代替光学透镜，通过电磁圈使电子“光线”汇聚、聚焦。 4）电子像人肉眼看不到，需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。 电子显微镜按结构和用途可分为：

透射电子显微镜(transmission electron microscope): 电子束穿过薄切片 扫描电子显微镜(scanning electron microscope): 观察样品的表面结构 7、扫描隧道显微镜

是目前分辨率最高的显微镜，其横向分辨率可以达到0.1-0.2 nm，纵向分辨率可以达到0.001 nm，足以对单个的原子进行观察。由于在扫描时不接触样品，又没有高能电子束轰击，因而可以避免样品的变形。不仅可以在真空，而且可以在保持样品生理条件的大气及液体环境下工作， 所以对生命科学研究领域具有十分重要的意义。 8、细菌染色法

由于微生物细胞微小，含水量多，因此在光学显微镜下为透明状态，与背景没有反差，无法进行观察，因此通过各种染色方法提高其反差。 细菌菌体(等电点一般pH 2-5)在中性\\碱性\\或弱酸性溶液中带负电荷，易于碱性染料(正电荷)进行结合，所以常用碱性染料进行染色。常见碱性染料:结晶紫，番红，美蓝，孔雀绿；中性红等。 常用的染色方法：

染色操作的基本程序为：

制片?干燥?固定?染色?水洗?干燥?镜检

?

革兰氏染色（C.Gram于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。）

结晶紫初染 ? 碘液媒染 ? 酒精脱色?番红复染

第三章：微生物细胞的类群、形态、结构与功能------原核微生物

重点与难点剖析

1、微生物的主要类群：

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2、原核微生物

指细胞核无核膜包裹，只存在由裸露DNA组成的核区（nuclear region) 的原始单细胞生物。主要类群包括细菌与古生菌。细菌又称真细菌（eubacteria），包括普通细菌、放线菌、蓝细菌、 支原体、立克次氏体和衣原体等 (三菌三体）。古生菌，在进化谱系上与真细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与真细菌较为接近，同属于原核生物。 3、细菌细胞的基本形态

基本形态：球状、 杆状、螺旋状和其他形状。

球状菌：细胞个体呈球形或椭圆形，球菌在细胞分裂时形成的不同空间排列方式，常被作为分类依据。 杆状菌：细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，可作为分类依据；而长度和排列方式常因生长阶段和培养条件不同而发生较大变化，一般不作为分类依据。

螺旋状：包括（1）弧菌，其菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。（2）螺菌, 菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异(1-20)。鞭毛二端生。细胞壁坚韧，菌体较硬。（3）螺旋体菌,菌体柔软，螺旋数目因种而异(3-70)。用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。 其它形状：包括柄杆菌、星形细菌、方形细菌及各种条件下细胞正常发育受阻而产生的异常形态 4、细菌细胞的大小

一般细菌大小的度量单位为微米（micrometer, μm）， 目前发现的细菌中最小的与无细胞结构的病毒相仿（约50 nm）；最大的肉眼可见（0.75 mm）。一般细菌的大小范围：球菌，0.5 ~ 1μm （直径）；杆菌0.2~ 1μm （直径） × 1~ 80μm（长度）；螺旋菌0.3~ 1 mm （直径） × 1~ 50 mm（长度）(长度是菌体两端点之间的距离，而非实际长度)。 5、细菌细胞的基本结构

6、细胞壁的主要功能

①固定细胞外形和提高机械强度，从而使其免受渗透压等外力的损伤。

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②为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需。失去了细胞壁的原生质体，也就丧失了这些重要功能； ③阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤；

④赋予细菌具有特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性。 7、革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）细菌细胞壁的化学组成和结构特点 革兰氏阳性（G+）菌细胞壁特点：厚度大（20~80nm），化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸。肽聚糖是真细菌细胞壁中的特有成分。磷壁酸为革兰氏阳性细菌细胞壁中特有的一种酸性多糖。

革兰氏阴性（G-）细菌细胞壁特点结构分为肽聚糖层和外膜层。其特点是肽聚糖层薄 (2-3nm)，层次多，化学组分复杂，强度低。

8、肽聚糖单体的化学组成和结构

肽聚糖单体中的化学组成：①双糖单位，由由N-乙酰胞壁酸（ NAM or M ）和 N-乙酰葡萄糖胺（ NAG or G ）l两种单糖之间以β-1,4-糖苷键[ M(1)-G(4)]连接形成。该糖苷键很容易被溶菌酶 (lysozyme) 所水解，从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的“散架”而死亡。双糖单位是肽聚糖中糖链骨架的基本结构单位。②四肽侧链，由四个氨基酸分子按L型与D型交替方式连接而成，连接于糖骨架的N-乙酰胞壁酸分子上。③肽桥连接一条肽侧链的4位氨基酸和另一条肽侧链的3位氨基酸，变化多样，是不同微生物肽聚糖多样性的基础。目前所知的肽聚糖已超过100种，主要的变化发生在肽桥上。（附结构示意图）

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9、磷壁酸

革兰氏阳性细菌细胞壁上特有的化学成分，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。

膜磷壁酸(又称脂磷壁酸)跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的，由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共价结合后形成。其含量与培养条件关系不大。可用45%热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。

壁磷壁酸，它与肽聚糖分子间进行共价结合，含量会随培养基成分而改变，一般占细胞壁重量的10%，有时可接近50%。用稀酸或稀碱可以提取。 磷壁酸的主要生理功能 (p41)

①其磷酸分子上较多的负电荷可提高细胞周围Mg2+的浓度，进入细胞后就可保证细胞膜上一些需Mg2+的合成酶提高活性； ②贮藏磷元素；

③增强某些致病菌如A族链球菌(Streptococcus)对宿主细胞的粘连、避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用；

④赋予革兰氏阳性细菌以特异的表面抗原； ⑤可作为噬菌体的特异性吸附受体；

⑥能调节细胞内自溶素(autolysin)的活力，借以防止细胞因自溶而死亡。因为在细胞正常分裂时，自溶素可使旧壁适度水解并促使新壁不断插入，而当其活力过强时，则细菌会因细胞壁迅速水解而死亡。

10、革兰氏阴性细菌的细胞壁 （1） 肽聚糖

它的肽聚糖埋藏在外膜层之内，是仅由1~2层肽聚糖网状分子组成的薄层(2~3nm)，含量约占细胞壁总重的10%，故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱。 四肽尾的第3个氨基酸不是L-lys，而是内消旋二氨基庚二酸(m-DAP),一种只有在原核微生物细胞壁上才

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有的氨基酸。 没有特殊的肽桥，其前后两个单体间的连接仅通过甲四肽尾的第4个氨基酸——D-ala的羧基与乙四肽尾的第3个氨基酸——mDAP的氨基直接相连 ,只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套。 （2）外膜

位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干种蛋白质组成的膜，有时也称为外壁。 a 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）

位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（8~10nm）的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖(core polysaccharide)和O-特异侧链（O-specific side chain，或称O-多糖或O-抗原）三部分组成。 Man, mannose, 甘露糖

Abe, abequose, β-脱氧岩藻糖 Rha, rhamnose,鼠李糖 Gal, galactose, 半乳糖 Glu, glucose, 葡萄糖

GluNac, N-acetylglucosamine, N-乙酰葡萄糖胺 Hep, heptoses,庚糖

KDO, 2-keto-3-deoxyotonate, 2-酮-3-脱氧辛酮酸

脂多糖的主要功能

① LPS结构的多变，决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性；

②因其负电荷较强，故与磷壁酸相似，也有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细胞表面浓度的作用； ③类脂A是革兰氏阴性细菌致病物质——内毒素的物质基础； ④是许多噬菌体在细胞表面的吸附受体；

⑤具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能；可透过若干种较小的分子（嘌呤、嘧啶、双糖、肽类和氨基酸等），但能阻拦溶菌酶、抗生素（青霉素等）、去污剂和某些染料等较大分子进入细胞膜。 b 外膜蛋白(outer membrane protein)

嵌合在LPS和磷脂层外膜上的蛋白。有20余种，但多数功能尚不清楚。

孔蛋白（porins）是由三个相同分子量（36000）蛋白亚基组成的一种三聚体跨膜蛋白，中间有一直径约1nm的孔道，通过孔的开闭，可对进入外膜层的物质进行选择。 非特异性孔蛋白：可通过分子量小于800~900的任何亲水性分子

特异性孔蛋白：只容许一种或少数几种相关物质通过，如维生素B12和核苷酸等。 C 周质空间(periplasmic space, periplasm)

又称壁膜间隙。在革兰氏阴性细菌中，一般指其外膜与细胞膜之间的狭窄空间（宽约12~15nm），呈胶状。 周质空间是进出细胞的物质的重要中转站和反应场所

在周质空间中，存在着多种周质蛋白(periplasmic proteins)：水解酶类；合成酶类；结合蛋白；受体蛋白；

周质空间：壁膜间隙，也有观点认为革兰氏阳性细菌中同样存在。 11、古细菌的细胞壁特点

在古生菌中，与真细菌类似功能但化学成分差别甚大的细胞壁。已研究过的一些古生菌，它们细胞壁中没有真正的肽聚糖，而是由多糖（假肽聚糖）、糖蛋白或蛋白质构成的。因此，古生菌类群细胞壁成份多样，差异大。

（1）假肽聚糖(pseudopeptidoglycan)细胞壁：代表菌——甲烷杆菌属( Methanobacterium )。 （2）独特多糖细胞壁：代表菌——甲烷八叠球菌( Methanosarcina ) （3）硫酸化多糖细胞壁：代表菌——盐球菌（Halococcus）

（4）糖蛋白(glycoprotein)：代表菌——盐杆菌属( Halobacterium)

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（5）蛋白质细胞壁： 有的是由几种不同蛋白组成，如甲烷球菌( Methanococcus )和甲烷微菌

( Methanomicrobium )；有的则由同种蛋白的许多亚基组成， 甲烷螺菌属( Methanospirillum )。 12、缺壁细菌

缺壁突变—L-型细菌实验室或宿主体内形成缺壁细菌基本去尽-原生质体（G+）人工去壁部分去除—球状体（G-）在自然界长期进化中形成——支原体

（1）L型细菌（L-form of bacteria）：细菌在某些环境条件下（实验室或宿主体内）通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异型。

因英国李斯德（Lister）预防研究所首先发现而得名（1935年，念珠状链杆菌 Streptobacillus moniliformis）

大肠杆菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌、分枝杆菌和霍乱弧菌等20多种细菌中均有发现，被认为可能与针对细胞壁的抗菌治疗有关。

特点：没有完整而坚韧的细胞壁，细胞呈多形态；有些能通过细菌滤器，故又称“滤过型细

菌”；对渗透敏感，在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落（直径在0.1mm左右）； （2）原生质体（protoplast）

在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。 特点：对环境条件变化敏感，低渗透压、振荡、离心甚至通气等都易引起其破裂；

比正常有细胞壁的细菌更易导入外源遗传物质，是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。 （3）球状体(sphaeroplast) ，又称原生质球

采用上述同样方法，针对革兰氏阴性细菌处理后而获得的残留部分细胞壁（外壁层）的球形体。与原生质体相比，它对外界环境具有一定的抗性，可在普通培养基上生长。 （4）枝原体(Mycoplasma)

在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。因它的细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇，所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度。 13、细菌细胞膜的特点

细胞质膜是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约7～8nm，由磷脂（占20%～30%）和蛋白质（占50%～70%）组成。膜蛋白包括具运输功能的整合蛋白）或内嵌蛋白；具有酶促作用的周边蛋白或膜外蛋白等。细菌细胞膜是一个重要的代谢活动中心，其膜蛋白约占细菌细胞膜的50%～70%，比任何一种生物膜都高，而且种类也多。真核生物细胞膜中一般含有胆固醇等甾醇，含量为5%-25%。原核生物与真核生物的最大区别就是其细胞膜中一般不含胆固醇，而是含有（hopanoid）。由磷脂分子形成的双分子膜中加入甾醇类物质可以提高膜的稳定性 14、细菌细胞膜的生理功能

①选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送； ②是维持细胞内正常渗透压的屏障；

③合成细胞壁和糖被的各种组分（肽聚糖、磷壁酸、LPS、荚膜多糖等）的重要基地；

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④膜上含有氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢的酶系，是细胞的产能场所； ⑤是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转的供能部位.

15、古生菌的细胞质膜——重点在于其独特性和多样性

在本质上也是由磷脂组成，但它比真细菌或真核生物具有更明显的多样性。 ① 亲水头（甘油）与疏水尾（烃链）间是通过醚键而不是酯键连接的；

②组成疏水尾的长链烃是异戊二烯的重复单位（如四聚体植烷、六聚体鲨烯等），它与亲水头通过醚键连接成甘油二醚（glycerol diether）或二甘油四醚(diglycerol tetraether)等，而在真细菌或真核生物中的疏水尾则是脂肪酸；

③古生菌的细胞质膜中存在着独特的单分子层膜或单、双分子层混合膜，而真细菌或真核生物的细胞质膜都是双分子层。具体地说，当磷脂为二甘油四醚时，连接两端两个甘油分子间的两个植烷（phytanyl）侧链间会发生共价结合，形成了二植烷(diphytanyl)，这时就形成了独特的单分子层膜（图3-12）。目前发现，单分子层膜多存在于嗜高温的古生菌中，其原因可能是这种膜的机械强度要比双分子层质膜更高。 ④在甘油的3C分子上，可连接多种与真细菌和真核生物细胞质膜上不同的基团，如磷酸酯基、硫酸酯基以及多种糖基等。

⑤细胞质膜上含多种独特脂类。仅嗜盐菌类即已发现有细菌红素（bacterioruberin）、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、视黄醛[（retinal），可与蛋白质结合成视紫红质(bacteriorhodopsin)]和萘醌等。

16、细胞内储存物与其存在的意义

①聚-β-羟丁酸(poly-β-hydroxybutyrate, PHB)，类脂性质的碳源类贮藏物。它无毒、可塑、易降解,被认为是生产医用塑料、生物降解塑料的良好原料。

②多糖类贮藏物，包括糖原颗粒和淀粉颗粒。在真细菌中以糖原为多，糖原颗粒较小，不染色时需用电镜观察，用碘液染成褐色，可在光学显微镜下看到。有的细菌积累淀粉粒，用碘液染成深兰色。

③异染粒(metachromatic granules)，是无机偏磷酸的聚合物，一般在富磷的环境下形成，贮藏磷元素和能量，并可降低细胞的渗透压，用美兰或者甲苯胺兰染色可呈现紫红色而得名。 ④藻青素（cyanophycin），一种内源性氮源贮藏物，同时还兼有贮存能源的作用，通常存在于蓝细菌中。 ⑤ 硫粒（sulfur globules），在环境中还原性硫素丰富时，很多真细菌在氧化H2S，硫代硫酸盐时，常在细胞内形成折光性很强的硫粒，积累硫元素。当环境中环境中还原性硫缺乏时，可被细菌重新利用作能源。

微生物储藏物的特点及生理功能：

①不同微生物其储藏性内含物不同.例如厌气性梭状芽孢杆菌只含PHB，大肠杆菌只储藏糖原，但有些光和细菌二者兼有;

②微生物合理利用营养物质的一种调节方式. 当环境中缺乏能源而碳源丰富时，细胞内就储藏较多的碳源类内含物，甚至达到细胞干重的50%，如果把这样的细胞移入有氮的培养基时，这些储藏物将被作为碳源和能源而用于合成反应。

③储藏物以多聚体的形式存在，有利于维持细胞内环境的平衡，避免不适合的pH，渗透压等的危害。例如羟基丁酸分子呈酸性，而当其聚合成聚-β-羟丁酸（ PHB）就成为中性脂肪酸了，这样便能维持细胞内中性环境，避免菌体内酸性增高。

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④储藏物在细菌细胞中大量积累，还可以被人们利用。 17、细菌芽孢

（1）基本概念：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢（endospore或spore，偶译“内生孢子”）。产芽孢的细菌多为杆菌，也有一些球菌。芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重要指标。 （2）芽孢的构造

（3）芽孢的形成与萌发

芽孢形成的7个阶段：轴丝形成；隔膜形成，产生前孢子；前孢子被吞没，双层膜形成，抗辐射力提高；皮层形成；芽孢衣形成；孢衣完成，折光性和抗热性增强-芽孢成熟；芽孢囊裂解，成熟芽孢释放。

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由休眠状态的芽孢变成营养状态细菌的过程，称为芽孢的萌发。包括 活化(activation)、出芽(germination)和生长(outgrowth)3个阶段。 4）芽孢的耐热机制

渗透调节皮层膨胀学说：芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差， 皮层的离子强度很高，产生极高的渗透压夺取芽孢核心的水分，结果造成皮层的充分膨胀。皮层含水量约70%，核心部分的细胞质高度失水含水量极低（10%～25%），因此，具极强的耐热性。 其他学说：

针对在芽孢形成过程中会合成大量的为营养细胞所没有的DPA-Ca，不少学者提出Ca2+与DPA的螯合作用会使芽孢中的生物大分子形成一种稳定而耐热性强的凝胶。

总之，有关芽孢耐热机制是一个重要的有待进一步深入研究的基础理论问题。 5）伴孢晶体（parasporal crystal）

少数芽孢杆菌，例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体——δ内毒素，称为伴孢晶体。它的干重可达芽孢囊重的30%左右，由18种氨基酸组成。由于伴孢晶体对200多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用。 6）芽孢研究意义

①芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类、鉴定中的重要形态学指标 ②利用芽孢的耐热特性，提高芽孢产生菌的筛选效率

③芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变成为营 养态细胞；

芽孢菌的长期保藏

④芽孢是抗逆性最强的生命体，是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）产生肉毒素， pH＞7.0时在100℃下要煮沸5.0～9.5h； 115℃下进行加压蒸汽灭菌，需10～40min才能杀灭；121℃下则仅需10min。这就要求食品加工厂在对肉类罐头进行灭菌时，应掌握在121℃下维持20min以上。

破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生破伤风毒素，121℃灭菌10min或115℃下灭菌30min才可。 18、糖被

包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质，称为糖被。糖被按其有无固定层次、层次厚薄又可细分为荚膜、微荚膜、粘液层和菌胶团 糖被的化学成分：

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荚膜的功能

①保护作用：?其上大量极性基团可保护菌体免受干旱损伤； ?防止噬菌体的吸附和裂解；

?一些动物致病菌的荚膜还可保护它们免受宿主白细胞的吞噬;

?作为透性屏障或（和）离子交换系统，可保护细菌免受重金属离子的毒害； ②贮藏养料，以备营养缺乏时重新利用； ③表面附着作用 细菌糖被的研究意义

①糖被的有无及其性质的不同可用于菌种鉴定

②葡聚糖制备“代血浆”或葡聚糖生化试剂(如 “Sephadex”)；

③黄原胶(xanthan或Xc，又称黄杆胶，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的胞外多糖，可用于石油开采、印染、食品等工业中；

④产生菌胶团的细菌在污水的微生物处理过程中具有分解、吸附和沉降有害物质的作用（活性污泥）。 ⑤有些细菌的糖被也可对人类带来不利的影响。

19、鞭毛

（1）鞭毛: 生长在某些细菌体表的长丝状、波曲的蛋白质附属物，数目为一至数十条，具有运动功能。鞭毛的有无和着生方式具有十分重要的分类学意义：单端鞭毛；端生丛毛；两端生鞭毛；周生鞭毛。P60 （2）观察和判断细菌鞭毛的方法： ①电子显微镜直接观察

②光学显微镜下观察：鞭毛染色和暗视野显微镜

③根据培养特征判断：半固体穿刺、菌落（菌苔）形态 （3）鞭毛的结构：

由基体、鞭毛钩和鞭毛丝三部分组成。革兰氏阳性细菌基体：L, P 和S-M环； 革兰氏阴性细菌基体：S-M环。在S-M环下方的Fli蛋白，起开关作用，控制鞭毛正转或者逆转，在S-M环旁侧的Mot蛋白，通过消耗能量，驱动S-M环的快速旋转。马达能量来源：细胞膜上的质子势。

鞭毛的生长方式是在其顶部延伸；鞭毛蛋白亚基螺旋状缠绕而成，每周为8～10个亚基。

20、放线菌的基本概念

放线菌（Actinomycetes）是具有菌丝、以孢子进行繁殖、高G+C/mol％（60-72）、革兰氏染色阳性的一类原核微生物。

21、放线菌的形态与结构

单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成；菌丝直径与杆菌类似，约1mm；细胞壁组成与细菌类似，绝大多数革兰氏染色阳性；细胞的结构与细菌基本相同，

按形态和功能可分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。

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1、营养菌丝(基内菌丝, 基丝, 初级菌丝体)：匍匐生长于培养基内，吸收营养，一般无隔膜，不断裂，直径0.2-0.8 mm，长度差别很大，有的可产生色素。

2、气生菌丝(二级菌丝体)：营养菌丝发育到一定阶段，伸向空间形成气生菌丝，叠生于营养菌丝上，可覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下观察，颜色较深，直径较粗（1-1.4 mm），有的产色素。

3、孢子丝：气生菌丝发育到一定阶段，其上可分化出形成孢子的菌丝，即孢子丝，又称产孢丝或繁殖菌丝。孢子丝形状和排列方式因种而异，常被作为对放线菌进行分类的依据。绝大部分菌具有生长发育良好的菌丝体，以孢子进行繁殖，菌落特征类似于霉菌。

4、孢子：孢子形状有圆形、椭圆形、杆状或柱形, 不稳定； 孢子表面形状: 光滑、瘤状、鳞片状、刺状、毛发状，稳定。 孢子的形状、颜色和表面纹饰是分类的特征之一。 22、放线菌的生长与繁殖

孢子在适宜的条件下萌发，长出1-3个芽管，形成营养菌丝，渐次分化出气生菌丝和繁殖菌丝（孢子丝），孢子丝释放孢子。

23、放线菌的菌落形态

能产生大量分枝和气生菌丝的菌种（如链霉菌）菌落质地致密，与培养基结合紧密，小而不 蔓延，不易挑起或挑起后不易破碎。丝绒状，粉末状。

不能产生大量菌丝体的菌种（如诺卡氏菌）粘着力差，粉质，针挑起易粉碎 24、放线菌的分布特点及与人类的关系

①放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界，土壤中最多，其代谢产物使土壤具有特殊的泥腥味。

②能产生大量的、种类繁多的抗生素（抗生素8000多种, 其中80%是由放线菌产生, 放线菌产生的90%

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由链霉菌产生）.

③有的放线菌可用于生产维生素、酶制制；此外，在甾体转化、石油脱蜡、烃类发酵、污水处理等方面也有应用.

④少数寄生型放线菌可引起人、动物（如皮肤、脑、肺和脚部感染）、植物（如马铃薯和甜菜的疮痂病）的疾病。

25、蓝细菌的基本概念

蓝藻或蓝绿藻（blue-green algae），分布广泛，是一类含有叶绿素a、能以水作为供氢体和电子供体、通过产氧型光合作用将光能转变成化学能、同化CO2为有机物质的光合细菌。

以前曾归于藻类，因为它和高等植物一样具有光和色素----叶绿素a，能进行产氧型光合作用。 原核，无叶绿体，70S核糖体，细胞壁中有肽聚糖（对溶菌酶敏感）。 其形态学特点:

1）具有原核生物的典型细胞结构，细胞壁构造相似于Gˉ 菌; 2）形态差异极大，有球状、杆状和丝状等形态；

3）细胞中含有叶绿素a，存在于丰富的内膜系统上，进行产氧型光合作用；

4）许多水生种类细胞质中有气泡，使菌体漂浮，保持在光线最充足的地方，以利光合作用。 5）无鞭毛，但能在固体表面滑行，趋光性。

6）分泌粘液层、荚膜或形成鞘衣，因此具有强的抗干旱能力。 7）细胞中常有各种贮存物：糖原，聚磷酸盐，PHB，氮源（藻青素）。 8）细胞的几种特化形式。 蓝细菌细胞的几种特化形式 异形胞（heterocyst）：一般存在于成丝状生长的种类中，位于细胞链的中间或末端，数目少而不定。光学显微镜下壁厚、色浅、多少中空的细胞，与邻近细胞间有孔道相同。固氮场所。 静息孢子：厚壁细胞，休眠构造，可以萌发成营养体。 链丝段（hormogonia）：长形细胞断裂而成的短片段，具有繁殖功能。

26、支原体、立克次氏体和衣原体 支原体（Mycoplasma），立克次氏体（Rickettsia），衣原体（Chlamydia），革兰氏阴性细菌，其大小和特性均介于通常的细菌与病毒之间。 （1） 支原体（Mycoplasma） 不具细胞壁，只有细胞膜，细胞柔软；滤过性；对渗透压敏感(但其抗性大于去细胞壁的原生质体)；形态多变,小球状?丝状；非常小,150nm~300nm，勉强可在光学显微镜下看到； 细胞膜上有甾醇；可以自主生长(人工培养基可培养), 菌落“油煎蛋”形,小(?? 0.1~1mm)；除肺炎支原体外，支原体一般不使人致病，但较多的支原体能引起牲畜、家禽和作物的病害。 （2）立克次氏体（Rickettsia）

体内酶系不完全，是一类严格的活细胞内寄生的原核微生物； CW呈Gˉ 反应；细胞球状、球杆状，大小为0.3-0.6×0.8-2um, 光学显微镜下可见； 无滤过性。

立克次氏体主要以节肢动物（虱、蜱、螨等）为媒介，寄生在它们的消化道表皮细胞中，然后通过节肢动物叮咬和排泄物传播给人和其他动物。有的立克次氏体能引起人类的流行性斑疹伤寒、恙虫热、Q热等严重疾病，而且立克次氏体大多是人兽共患病原体。 （3）衣原体 (Chlamydia)

介于立克次氏体与病毒之间，能通过细菌滤器，专性活细胞内寄生的一类原核微生物。过去误认为“大病毒”，但它们的生物学特性更接近细菌而不同于病毒(细胞结构,同时含有DNA和RNA)。

体内缺乏产能系统，专性活细胞内寄生的一类原核微生物，又称能量寄生物；CW呈Gˉ 反应； 细胞呈球形或椭圆形，直径0.2-0.3 um，有滤过性；在宿主细胞内生长繁殖具有独特的生活周期，即存在原体

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和始体两种形态。

衣原体广泛寄生于人类、哺乳动物及鸟类，仅少数致病，如人的沙眼衣原体，鸟的鹦鹉热衣原体。有的还是人兽共患的病原体。1956年，我国微生物学家汤飞凡等应用鸡胚卵黄囊接种法，在国际上首先成功地分离培养出沙眼衣原体。现衣原体可用多种细胞培养。

支原体、立克次氏体、衣原体与细菌、病毒的比较

特 征 细 菌 支 原 体 立克次氏体 衣 原 体 病 毒 直径(μm) 0.5-0.2 0.2-0.25 0.2-0.5 0.2-0.3 ＜0.25 可见性 光学显微镜 光镜勉强可见 光学显微镜 光镜勉强可见 电子显微镜

过滤性 不能过滤 能过滤 不能过滤 能过滤 能过滤

革兰氏染色 阳性或阴性 阴性 阴性 阴性 无

细胞壁 有坚韧的细胞壁 缺 与细菌相似 与细菌相似 无细胞结构 繁殖方式 二均分裂 二均分裂 二均分裂 二均分裂 复制 培养方法 人工培养基 人工培养基 宿主细胞 宿主细胞 宿主细胞

核酸种类 DNA和RNA DNA和RNA DNA和RNA DNA和RNA DNA或RNA

核糖体 有 有 有 有 无

大分子合成 有 有 进行 进行 只利用宿主机器

产生ATP系统 有 有 有 无 无 增殖过程中结保持 保持 保持 保持 失去

构的完整性

入侵方式 多样 直接 昆虫媒介 不清楚 决定宿主细胞性质

对抗生素 敏感 敏感(青霉素例外) 敏感 敏感 不敏感 对干扰素 某些菌敏感 不敏感 有的敏感 有的敏感 敏感 第四章：微生物细胞的类群、形态、结构与功能------真核微生物

重点与难点剖析

1、真核生物

凡是细胞核具有核膜、能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器的生物，称为真核生物。具有上述特征的微小生物，称为真核微生物。 2、真核微生物类群及特点

真核微生物包括真菌，单细胞藻类和原生动物。真菌的主要类群有酵母、霉菌和蕈菌。 其中真菌的特点为：

1.具有细胞核，进行有丝分裂；

2.细胞质中含有线粒体但没有叶绿体，不进行光合作用，无根、茎、叶的分化； 3.以产生有性孢子和无性孢子二种形式进行繁殖； 4.营养方式为化能有机营养（异养）、好氧；

5.不运动（仅少数种类的游动孢子有1-2根鞭毛）； 6.种类繁多，形态各异、大小悬殊，细胞结构多样；

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2、酵母(yeast)

酵母菌是一群单细胞的真核微生物。通常指以芽殖或裂殖来进行无性繁殖的单细胞真菌，以区分霉菌。有些可产生子囊孢子进行有性繁殖。 3、酵母的形态与结构

个体细胞形态：卵圆、圆、圆柱、梨形等单细胞，其细胞直径一般比细菌粗10倍左右。有的酵母菌子代细胞连在一起成为链状，称为假丝酵母。其细胞的模式构造见下图：

酵母的群体——菌落形态：与细菌菌落类似，但一般较细菌菌落大且厚，表面湿润，膏状，易被挑起。菌落质地均匀，颜色一致。多为乳白色，少数呈红色，黑色（褐色）。一般有悦人的香味。

4、酵母细胞壁结构

酵母菌细胞壁的厚度为25～70nm，重量约占细胞干重的25%，主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和少量几丁质、少量脂质。它们在细胞壁上自外至内的分布次序是甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖。

蜗牛酶中含有纤维素酶，甘露聚糖酶，葡糖酸酶，几丁质酶和脂酶等30多种酶，可水解酵母菌细胞壁，制备酵母原生质体，或者水解子囊壁，释放子囊孢子。

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5、酵母的液泡

液泡内含有一些水解酶代谢中间产物，金属离子，聚磷酸，类脂等物质； 其功能储存营养物， 如糖原和脂肪； 含有多种酶类， 如蛋白酶、核酸酶、纤维素酶等； 持细胞渗透压。 6、酵母的生长繁殖 （1）无性繁殖

①芽殖，是酵母主要的无性繁殖方式，成熟细胞长出一个小芽，到一定程度后脱离母体继续长成新个体。 ②裂殖：少数酵母菌可以象细菌一样借细胞横割分裂而繁殖，例如裂殖酵母。

③无性孢子：某些酵母菌可以产生芽孢子(假丝酵母), 掷孢子(掷孢酵母), 厚壁孢子(假丝酵母)等无性孢子进行繁殖。 （2）有性繁殖

酵母菌以形成子囊和子囊孢子的形式进行有性繁殖，其过程为：①两个性别不同的单倍体细胞靠近，相互接触；②接触处细胞壁消失，两个细胞的细胞质融合，称为质配；③两个细胞的细胞核融合，形成二倍体核，称为核配。二倍体核进行减数分裂时，形成4个或8个子囊孢子，而原有的营养细胞就成为子囊。子囊孢子萌发形成单倍体营养细胞。

7、霉菌——丝状真菌 霉菌（mold）是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。霉菌菌体均由分枝或不分枝的菌丝（hypha）构成。许多菌丝交织在一起，称为菌丝体（mycelium）。 8、霉菌细胞壁结构 如图所示：

四层真菌细胞壁结构：A，细胞膜；B，几丁质（甲壳质）微纤维镶嵌在无定形的蛋白质、甘露糖和糖原

组分中；C，不连续蛋白质层；D，糖蛋白层；E，不定形糖原层。

9、霉菌的鞭毛结构

鞭毛：“9+2”结构 ，微管二联体。

10、霉菌的菌丝类型： 如图所示：

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（a）无隔膜菌丝：整个菌丝为长管状单细胞，细胞质内含有多个核。其生长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多以及细胞质的增加。

(b) 有隔膜菌丝：菌丝由横隔膜分隔成成串多细胞，每个细胞内含有一个或多个细胞核。有些菌丝，从外观看虽然像多细胞，但横隔膜上有小孔，使细胞质和细胞核可以自由流通，而且每个细胞的功能也都相同。

11、霉菌的菌丝形态：

霉菌菌丝分为：营养菌丝，气生菌丝，繁殖菌丝。霉菌菌丝直径约为2~10um，比一般细菌和放线菌菌丝大几到几十倍 12、菌丝的特化

营养菌丝和气生菌丝对于不同的真菌来说，在它们的长期进化过程中，对于相应的环境条件已有了高度的适应性，并明显地表现在产生各种形态和功能不同的特化结构上。也称菌丝的变态。

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（1）特化的营养菌丝

① 假根,匍匐菌丝: 类似树根，吸收营养; 匍匐延伸。

② 吸器：一些专性寄生真菌从菌丝上分化出来的旁枝，侵入细胞内分化成指状、球状或丝状，用以吸收细胞内的营养。

③ 附着枝：若干寄生真菌由菌丝细胞生出1-2个细胞的短枝，以将菌丝附着于宿主上，这种特殊的结构即附着枝。

④ 附着胞：许多植物寄生真菌在其芽管或老菌丝顶端发生膨大，并分泌粘性物，借以牢固地粘附在宿主的表面，这一结构就是附着胞，附着胞上再形成纤细的针状感染菌丝，以侵入宿主的角质层而吸取营养。 ⑤ 菌环：菌丝交织成套状 菌网：菌丝交织成网状

捕虫菌目（Zoopagales）在长期的自然进化中形成的特化结构，特化菌丝构成巧妙的网，可以捕捉小型原生动物或无脊椎动物，捕获物死后，菌丝伸入体内吸收营养。

⑥ 菌核：是一种休眠的菌丝组织。由菌丝密集地交织在一起，其外层教坚硬、色深，内层疏松，大多呈白色。

⑦ 菌索：根状菌丝组织。

（2）特化的气生菌丝----子实体

子实体：菌丝交织成垫状、壳状的子座, 在子座外或内可形成孢子。 ① 结构简单的子实体：

锁状联合：担子菌在一般的培养基上不产生子实体，但是有种特殊的构造----锁状联合。 ② 结构复杂的子实体：

子囊果：在子囊和子囊孢子发育过程中，从原来的雌器和雄器下面的细胞上生出许多菌丝，有规律地将产囊菌丝包围形成了一定结构的子囊果。

子囊果的三种方式：闭囊壳，子囊壳，子囊盘。

13、霉菌的孢子

真菌的繁殖力极强, 细胞碎片可以繁殖. 但是正常自然条件下,真菌的繁殖主要是通过各种形形色色的无性或有性孢子来进行繁殖的.

（1）无性孢子：节孢子，后垣孢子，孢囊孢子，分生孢子，芽孢子

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（2）有性孢子：卵孢子，接合孢子，子囊孢子，担孢子 霉菌有性孢子繁殖的特点：

1）霉菌的有性繁殖不如无性繁殖那么经常与普遍，多发生在特定条件下，往往在自然条件下较多，在一般培养基上不常见。

2）有性繁殖方式因菌种不同而异，有的两条营养菌丝就可以直接结合，有的则由特殊的性细胞（性器官）----配子囊或由配子囊产生的配子来相互交配，形成有性孢子。

3）核配后进行减数分裂，因此菌体染色体数目为单倍，双倍体只限于接合子。

14、异核现象和准性生殖

有一些霉菌，至今尚未发现其生活史中有有性繁殖阶段，这类真菌称为半知菌.

异核现象：即不同类型的核存在于同一个体的现象。异核现象来源：由两个不同基因型核的菌丝融合而成； 或者菌丝中少数细胞核突变； 或者少数单倍体核融合成二倍体核。

异核现象是许多霉菌，尤其是半知菌存在的一种普遍现象。由于没有发现半知菌的有性生殖，所以异核现象成为这类型真菌遗传重组的一个重要机制。一旦异核体形成，准性生殖重组就有可能发生。

准性生殖(无性重组)过程：①质配：异核现象； ②核配：双倍体化； ③单倍体化：一系列有丝分裂中

-5-7

一再发生的个别染色体的减半,直至最终形成单倍体的过程。 频率低10-10，区别于减数分裂。

15、霉菌的菌落特征

由粗而长的分枝状菌丝组成，菌落疏松，呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，表面有颗粒状孢子比细菌菌落大几倍到几十倍，有的没有固定大小。

各种霉菌，在一定培养基上形成的菌落大小、形状、颜色（营养菌丝和孢子堆表现出不同的颜色）等相对稳定，所以菌落特征也为分类依据之一。

根霉 曲霉 青霉

第五章 病毒 重点与难点剖析

一、 病毒的概念

病毒是一类没有细胞结构但有遗传复制等生命特征，主要由核酸和蛋白质组成的大分子生物，是比细菌更小的专性细胞内寄生的微生物，大多数能通过细菌过滤器。其特点 1）不具有细胞结构，具有一般化学大分子的特征。

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2）一种病毒的毒粒内只含有一种核酸，DNA或者RNA。

3）大部分病毒没有酶或酶系极不完全，不含催化能量代谢的酶，不能进行独立的代谢作用。

4）严格的活细胞内寄生，没有自身的核糖体，没有个体生长，也不进行二均分裂，必须依赖宿主细胞进行自身的核酸复制，形成子代。

5）个体微小，在电子显微镜下才能看见。 6）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。

非细胞生物 病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分

亚病毒 类病毒：只含具侵染性的RNA组分。

卫星病毒：具有核酸基因组，借助于Help病毒

卫星RNA：只含有不具侵染性的RNA组分，借助于Help病毒 朊病毒：只含蛋白质

二、 病毒的分类

病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性。根据寄主细胞的不同可分为：动物病毒、植物病毒和噬菌体。

病毒的分离纯化因其宿主不同而异。噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即噬斑（forming unit of plaques，pfu）。如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对噬菌体的数目进行估算。 三、 病毒的结构

病毒细胞外感染形式称为毒粒。它由自主复制的遗传物质和蛋白质外壳组成，有些病毒还含有脂质和糖类。蛋白质外壳保护遗传物质免遭环境破坏，遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞。一种毒粒内只含有一种核酸DNA或RNA；病毒的蛋白质可分为结构蛋白和非结构蛋白。

裸露的二十面体毒粒；

毒粒由4种主要结构类型 裸露的螺旋毒粒；

有包膜的二十面体毒粒； 有包膜的螺旋毒粒；

四、 病毒的复制周期

病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。

病毒的复制周期依据其发生的事件顺序可分为5个阶段：吸附、侵入、脱壳、病毒大分子的合成（包括病毒基因组的表达和复制）、装配和释放。 五、 病毒生长曲线

以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，离心除去未吸附的病毒，或以抗病毒抗血清处理病毒—细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。

病毒生长曲线分为三个阶段

（1）吸附期:游离的噬菌体吸附到宿主细胞。

（2）潜伏期:从噬菌体吸附细胞到释放出新噬菌体的最短时期。 （3）裂解期:随着菌体不断破裂，新噬菌体数目增加，直到最高值。

在潜伏期的前一段，受染细胞内检测不到感染性病毒，后一阶段，感染性病毒在受染细胞内的数量急剧增加。自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间为隐蔽期。不同病毒的隐蔽期长短不同，例如，DNA动物病毒的隐蔽期为5～20小时，RNA动物病毒为2～10小时。隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系，从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成熟，而不是通过双分裂方式产生。 病毒的非增殖性感染（non-productive infection）：病毒进入敏感细胞后的某一阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然亦可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。

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六、 整合的病毒基因组

感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环（lytic cycle），即烈性噬菌体；感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。这一现象称做溶源性（lysogeny）现象，即温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenic phage）；在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如λ噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体）。整合到细菌染色体或以质粒形式存在的温和噬菌体基因组称作前（原）噬菌体(Prophage)。在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。溶源性细菌经自发裂解或诱发裂解，进入裂解循环。细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称做溶源性细菌（lysogenic bacteria） 七、 亚病毒因子

凡在核酸和蛋白质2种成分中，只含其中之一的分子病原体，成为亚病毒因子。包括类病毒、卫星病毒、卫星RNA、朊病毒。

1、类病毒：小分子RNA，能在敏感细胞内自我复制，不需要辅助病毒，没有蛋白质外壳，不形成病毒颗粒。如马铃薯纺锤性块茎类病毒。

2、卫星病毒：具有核酸基因组，但依赖于辅助病毒提供复制酶进行复制，并且编码壳体蛋白。如腺联病毒；卫星烟草坏死病毒。

3、卫星RNA：必须依赖于辅助病毒进行复制的小分子单链RNA片断，它们被包装在辅助病毒的壳体内，与辅助病毒基因组无同源性，对辅助病毒复制是非必需的。

4、朊病毒：一类引起哺乳动物亚急性海绵样脑病的致病因子，引起人与动物的致死性中枢神经系统的疾病。具有不同于病毒生物学性质和理化性质。

朊病毒是亚病毒的一种，具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。其致病

csc

作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP改变折叠状态为PrP所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。

Prusiner (1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒（proteinaceous infectious particle），并将之称做Prion。

第六章 微生物的营养

重点与难点剖析

一、 微生物的营养要求

1、微生物为了生存必须从环境中吸收营养物质，通过新陈代谢将这些营养物质一部分转化成自身的细胞物质，另一部分转化成代谢产物，并从代谢过程中获得生命活动的能量，这种满足微生物生长、繁殖和完成各种生理活性的物质称为营养物质，而微生物获得和利用营养物质的过程称为营养。

2、碳源构成微生物细胞碳水化合物中碳架的营养物质，供给微生物生长发育所需能量。大多数微生物的碳源和能源一致，不同种类微生物的碳源差异很大。但是有些以CO2为唯一或主要碳源的微生物生长所需要的能源则并非来自于碳源物质。氮源构成微生物细胞物质代谢产物中氮素来源的营养物质，一般不提供能量。在碳源物质缺乏的情况下，某些厌氧微生物在厌氧条件下可以利用某些氨基酸作为能源物质。无机盐主要用来构成酶的组成成分，维持酶的活性，调节细胞渗透压、pH、Eh，某些矿质元素作为自养菌的能源。生长因子是微生物生长代谢所必需,但微生物本身又不能合成的微量的特殊营养物，通常作为辅酶的组成结构；水为生物细胞生长必不可少，可以作为溶剂、热导体、维持生物大分子的结构及细胞形态，参与生化反应等。 二、 微生物的营养类型

根据所利用的碳源和能源、电子供体的不同，可将微生物划分为：

光能自养型：以光为能源，不依赖任何有机物即可正常生长，如兰细菌。 光能异养型：以光为能源，但生长需要一定的有机营养，如红螺菌。

化能自养型：以无机物的氧化获得能量，生长不依赖有机营养物，如铁细菌、硝化细菌等。

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化能异养型：以有机物的氧化获得能量，生长依赖于有机营养物质， 如腐生菌等。 1．光能无机自养型（光能自养型）

能以CO2为主要唯一或主要碳源,进行光合作用获取生长所需要的能量,以无机物如H2、H2S、S等作为供氢体或电子供体，使CO2还原为细胞物质。

例如：藻类及蓝细菌等和植物一样，以水为电子供体（供氢体），进行产氧型的光合作用，合成细胞物质。红硫细菌，以H2S为电子供体，产生细胞物质，并伴随硫元素的产生。 2．光能有机异养型（光能异养型）

不能以CO2为主要或唯一的碳源，以有机物作为供氢体，利用光能将CO2还原为细胞物质；在生长时大多数需要外源的生长因子。

例如，红螺菌属中的一些细菌能利用异丙醇作为供氢体，将CO2还原成细胞物质，同时积累丙酮。 3．化能无机自养型（化能自养型）

生长所需要的能量来自无机物氧化过程中放出的化学能，以CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源进行生

+

长时，利用H2、H2S、Fe2、NH3或NO2-等无机物作为电子供体使CO2还原成细胞物质。 4．化能有机异养型（化能异养型）

生长所需要的能量均来自有机物氧化过程中放出的化学能，生长所需要的碳源主要是一些有机化合物，如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等。 三、 培养基配制

1、培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水。培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；有些成分需要进行分别灭菌，或过滤除菌。培养基配制时应选择适宜的营养物质和适当的浓度和配比，根据微生物的需要调整pH.

2、培养基根据物质状态不同可分为液体、固体和半固体， 根据其用途可分为基础、加富、鉴别、选择、分析等。

实验室用于培养细菌的牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）（pH 7.0-7.5）； 培养放线菌的高氏1号合成培养基培养；培养酵母菌的麦芽汁培养基（pH 5.0-6.5）；培养霉菌的查氏合成培养基。

四、 影响微生物生长的因素

微生物生长受多种因素的影响，除了必须的营养物质外，不同微生物对其培养基中的水要求不同，常用水活度αw表示。微生物一般在αw为0.60～0.99的条件下生长, αw过低时,微生物生长的迟缓期延长,比生长速率和总生长量减少。微生物不同，其生长的最适αw不同。氧化还原电位也是营养微生物生长的重要因素，根据对氧气的需求，微生物可分为好氧、厌氧和耐氧。 五、 营养物质进入细胞的方式

1、扩散：物质跨膜扩散的能力和速率与该物质的性质有关,分子量小、脂溶性、极性小的物质易通过扩散进出细胞.

扩散并不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式,水是唯一可以通过扩散自由通过原生质膜的分子,脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些气体分子(O2、CO2)及某些氨基酸在一定程度上也可通过扩散进出细胞。 2、促进扩散：被动的物质跨膜运输方式，其特点是： （1）物质运输过程中不消耗能量；

（2）参与运输的物质本身的分子结构不发生变化；

（3）不能进行逆浓度运输；运输速率与膜内外物质的浓度差成正比。

（4）通过促进扩散进行跨膜运输的物质需要借助与载体(carrier)的作用才能进入细胞，而且每种载体只运输相应的物质，具有较高的专一性。

（5）载体只影响物质的运输速率，并不改变该物质在膜内外形成的动态平衡状态；这种性质都类似于酶的作用特征，因此载体蛋白也称为透过酶。透过酶大都是诱导酶,只有在环境中存在机体生长所需的营养物质时，相应的透过酶才合成。

3、主动运输：在物质运输过程中需要消耗能量，可以进行逆浓度运输。主动运输是广泛存在于微生物中的一种主要的物质运输方式。

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不同微生物运输物质所需能量来源：

好氧型微生物与兼性厌氧微生物直接利用呼吸能；厌氧型微生物利用化学能(ATP)；光合微生物利用光能。嗜盐细菌通过紫膜(purple membrane)利用光能。

（1）初级主动运输:由电子传递系统、ATP酶或细菌的视紫红质引起的质子运输方式(质子外排),是一种质子的运输方式.呼吸能，化学能及光能的消耗，使质子由细胞内到细胞外，造成细胞内外的质子浓度差，使膜处于充能状态。

（2）次级主动运输：能化膜在质子浓度差消失的过程中，偶联其他物质的运输。 包括同向运输、逆向运输、单向运输。

（3）ATP结合性盒式转运蛋白系统， 又称作ABC-转运蛋白：主要用来转运糖、氨基酸和微生物B12等。

ABC转运蛋白通常有两个疏水性跨膜域与位于质膜内的两个核苷酸结合结构域形成复合物，两个疏水性跨膜域在质膜上形成一个孔，两个核苷酸结合结构域课余ATP结合。ABC转运蛋白可以专一性的与溶质结合蛋白结合，溶质结合蛋白位于周质空间和附着在质膜外表面。溶质结合蛋白携带被转运的溶质分子在质膜外表面鱼ABC转运蛋白结合，ATP 结合在核苷酸结构域，ATP水解产生能量，是跨膜结构域构想发生改变，被转运的溶质分子进入胞内。 （4）基团转运（group translocation）：有一个复杂的运输系统来完成物质的运输，物质在运输过程中发生化学变化。

基团转位主要存在于厌氧型和兼性厌氧型细菌中，主要用于糖的运输。脂肪酸、核苷、碱基等也可通过这种方式运输。

（5）Na+,K+-ATP酶(Na+,K+-ATPase)系统

细胞膜上一种重要的离子通道蛋白。利用ATP的能量将Na+泵到细胞外，并将K+泵到细胞内,该酶有大小两个亚基,大亚基可被磷酸化.

4、膜泡运输：膜泡运输主要存在于原生动物中，特别是变形虫(amoeba)，是这类微生物的一种营养物质的运输方式。

第七章 微生物的代谢 重点与难点剖析

一、 代谢的概念

1、代谢是细胞内发生的所有化学反应的总称，包括分解代谢和合成代谢，分解代谢产生能量，合成代谢消耗能量。

2、生物氧化：生物体内发生的一切氧化还原反应。在生物氧化过程中释放的能量可被微生物直接利用，也可通过能量转换储存在高能化合物（如ATP）中，以便逐步被利用，还有部分能量以热的形式被释放到环境中。生物氧化的功能为：产能（ATP）、产还原力[H]和产小分子中间代谢物。

3、异养微生物利用有机物，自养微生物则利用无机物，通过生物氧化来进行产能代谢。 二、异养微生物产能代谢

发酵

生物氧化 有氧呼吸

呼吸 无氧呼吸

1、发酵：有机物氧化释放的电子直接交给本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。

发酵过程中有机化合物只是部分地被氧化，因此，只释放出一小部分的能量。发酵过程的氧化是与有机物的还原相偶联。被还原的有机物来自于初始发酵的分解代谢，即不需要外界提供电子受体。

发酵的种类有很多，可发酵的底物有碳水化合物、有机酸、氨基酸等，其中以微生物发酵葡萄糖最为重要。生物体内葡萄糖被降解成丙酮酸的过程称为糖酵解（glycolysis）。糖酵解是发酵的基础，主要有四种途径：EMP途径、HMP途径、ED途径、磷酸解酮酶途径。

27

主要发酵类型

（1）酵母菌乙醇发酵的三种类型 一型发酵：

Glucose Pyr Alcohol 二型发酵：当环境中存在NaHSO4，与乙醛结合，而不能受氢，不能形成乙醇。 磷酸二羟丙酮 a-磷酸甘油 甘油 三型发酵：在碱性条件下，乙醛发生歧化反应 产物：乙醇、乙酸和甘油。 （2）乳酸发酵

同型乳酸发酵（EMP途径）：

葡萄糖 丙酮酸 乳酸

异型乳酸发酵（PK或HK 途径，肠膜状明串珠菌）

葡萄糖 乳酸 + 乙酸或乙醇（HK 途径） 戊糖 乳酸 + 乙酸（PK途径） 两歧双歧途径（ PK+HK 途径，两歧双歧途杆菌）

葡萄糖 乳酸 + 乙酸 （Hk 和PK途径） （3）氨基酸发酵产能（Stickland 反应）

在少数厌氧梭菌如Clostridium sporogenes, 能利用一些氨基酸同时当作碳源、氮源和能源，其机制是通过部分氨基酸的氧化和另一些氨基酸的还原向偶联，这种以一种氨基酸做氢供体和以另一种氨基酸做氢受体而发生的产能的独特发酵类型，称为Stickland 反应。 作为氢供体的氨基酸：Ala; Leu, Ile, Val, Phe, Ser, His, trp 作为氢受体的氨基酸：Gly, Pro, Ori, OH-Pro, Arg, trp. 发酵中能量产生

发酵仅是专性厌氧菌和兼性厌氧菌在无氧条件下的一种生物氧化方式，产能是以底物水平磷酸化形式。

底物水平磷酸化形式：在发酵过程中形成高能磷酸键化合物，将其高能磷酸根交给ADP而生成ATP的过程.

2、呼吸作用：微生物在降解底物过程中，将释放出的电子交给NAD（P）+、FAD或FMN等电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程，称为呼吸作用。 包括

有氧呼吸（aerobic respiration）：以分子氧作为最终电子受体。 无氧呼吸（anaerobic respiration）：以氧化型化合物作为最终电子受体。

(1) 有氧呼吸：葡萄糖经EMP途径和TAC循环被彻底氧化生成CO2和水，释放大量能量。

TCA循环：电子传递系统：由一系列氢和电子传递体组成的多酶氧化还原体系。NADH、FADH以及其他还原性载体上的氢原子，以质子和电子的形式在其上进行定向传递，其组成酶系是定向有序不对称的排列在细菌的细胞质膜上或真核生物的线粒体膜上。

电子传递系统有两种功能：从电子供体接受电子并将电子传递给电子受体；二是合成ATP，并把电子传递过程中释放的部分能量保存起来。

--2-2-（2）无氧呼吸：无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是NO3、NO2、SO4、S2O3、CO2等无机物，或延胡索酸（fumarate）等有机物。

无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴随有磷酸化作用，也能产生较多的能量用于生命活动。由于部分能量随电子转移传给最终电子受体，所以生成的能量不如有氧呼吸产生的多。

硝酸盐呼吸：以硝酸盐作为最终电子受体的生物学过程，也称为硝酸盐的异化作用。有些菌可将NO进一步将其还原成N2，这个过程称为反硝化作用。硝酸盐还原菌的反硝化作用对农业生产及地球物质循环都具有重要意义。

28

2-

1）反硝化作用可使土壤中植物能利用的氮（硝酸盐NO3-）还原成氮气而消失，从而降低了土壤的肥力，对农业生产不利。克服反硝化作用的有效方法之一是松土，保持土壤的疏松状态，排除过多的水分，保证土壤中有良好的通气条件（此时菌行有氧呼吸）。

2）反硝化作用在氮素循环中也有重要作用。硝酸盐是一种容易溶解于水的物质，通常通过水从土壤流入水域中。如果没有反硝化作用，硝酸盐将在水中积累，会导致水质变坏，与地球上氮素循环的中断。 三、自养微生物的生物氧化

将CO2先还原成[CH2O]水平的简单有机物，然后再进一步合成复杂的细胞成分。化能自养微生物所需的无机物氧化过程中主要通过氧化磷酸化产生ATP。

如果作为电子供体的无机物的氧化还原电位足够低，也在氧化磷酸化的过程中产生还原力，但大多数情况下都需要通过电子的逆向传递，以消耗ATP为代价获得还原力。

2-1、氨的氧化：NH3、亚硝酸（NO）等无机氮化物可以被某些化能自养细菌用作能源。

亚硝化细菌：将氨氧化为亚硝酸并获得能量。 硝化细菌：将亚硝酸氧化为硝酸并获得能量。

这两类细菌往往伴生在一起，在它们的共同作用下将铵盐氧化成硝酸盐，避免亚硝酸积累所产生的毒害作用。这类细菌在自然界的氮素循环中起者重要的作用，在自然界中分布非常广泛。

2-NH3、NO的氧化还原电势均比较高，以氧为电子受体进行氧化时产生的能量较少，而且进行合成代谢所需要的还原力需消耗ATP进行电子的逆呼吸链传递来产生，因此这类细菌生长缓慢，平均代时在10h以上。

2、 硫的氧化：硫细菌（sulfur bacteria）能够利用一种或多种还原态或部分还原态的硫化合物（包括硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、多硫酸盐和亚硫酸盐）作能源。 硫细菌在进行还原态硫的氧化时会产酸（主要是硫酸），因此它们的生长会显著地导致环境的pH下降，有些硫细菌可以在很酸的环境，例如在pH低于1的环境中生长。

与硝化细菌一样，硫细菌也是通过电子的逆呼吸链传递来生成还原力。

3、铁的氧化：以嗜酸性的氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillus ferrooxidans）为例：从亚铁到高铁状态的铁氧化，对于少数细菌来说也是一种产能反应，但从这种氧化中只有少量的能量可以被利用。因此该菌

3+

的生长会导致形成大量的Fe （Fe(OH)3）。

氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillus ferrooxidans）在富含FeS2的煤矿中繁殖，产生大量的硫酸和Fe(OH)3，从而造成严重的环境污染。

4、氢的氧化：氢是微生物细胞代谢中的常见代谢产物，很多细菌都能通过对氢的氧化获得生长所需要的能量。

能以氢为电子供体，以O2为电子受体，以CO2为唯一碳源进行生长的细菌被称为氢细菌：

氢的氧化可通过电子和氢离子在呼吸链上的传递产生ATP和用于细胞合成代谢所需要的还原力。氢细菌都是一些呈革兰氏阴性的兼性化能自养菌。它们能利用分子氢氧化产生的能量同化CO2，也能利用其它有机物生长。

化能自养微生物以无机物作为能源，一般产能效率低，生长慢，但从生态学角度看，它们所利用的能源物质是一般化能异养生物所不能利用的，因此它们与产能效率高、生长快的化能异养微生物之间并不存在生存竞争。 四．能量转换

1、底物水平磷酸化

物质在生物氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物，而这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成。

2、氧化磷酸化

物质在生物氧化过程中形成的NADH和FADH通过位于线粒体和细菌膜上的电子传递系统将电子传递给氧或其他氧化性物质,在这个过程中偶连ATP的生成. 3、光合磷酸化

当一个叶绿素分子吸收光量子时，叶绿素性质上即被激活，导致其释放一个电子而被氧化，释放出的电子在电子传递系统中逐步释放能量，这就是光合磷酸化的基本动力。

29

光合磷酸化和氧化磷酸化一样都是通过电子传递系统产生ATP。

光能营养型生物 产氧 真核生物：藻类及其它绿色植物

原核生物：蓝细菌

不产氧 （仅原核生物有）：光合细菌

（1）环式光合磷酸化 （不产氧型光合作用）

光合细菌主要通过环式光合磷酸化作用产生ATP。不是利用H2O，而是利用还原态的H2、H2S等作为还原CO2的氢供体，进行不产氧的光合作用；电子传递的过程中造成了质子的跨膜移动，为ATP的合成提供了能量。

（2）非环式光合磷酸化：产氧型光合作用，绿色植物、蓝细菌等以裂解水，提供细胞生长的还原能力。含有两种类型的反映中心，连同天线色素、初级电子受体和供体一起构成了光合系统PI和PII，这两个系统偶联，进行非环式光合磷酸化。

非环式光合磷酸化的反应式：

2NADP+＋2ADP＋2Pi＋2H2O→2NADPH＋2H+＋2ATP＋O2 （3）非环式光合磷酸化

绿色细菌的非环式光合磷酸化（不产氧型光合作用）

+

NAD++H2S+ADP+Pi NADPH+H+ATP+S （4）嗜盐菌紫膜的光合作用

一种只有嗜盐菌才有的，无叶绿素或细菌叶绿素参与的独特的光合作用。

嗜盐菌的细胞膜可分成红色和紫色二部分，前者主要含细胞色素和黄素蛋白等用于氧化磷酸化的呼吸链载体，后者在膜上呈斑片状独立分布，其总面积约占细胞膜的一半，这就是能进行独特光合作用的紫膜。含量占紫膜75%是一种称为细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）的蛋白质，它与人眼视网膜上的柱状细胞中所含的一种蛋白质—视紫红质（rhodpsin）十分相似，二者都以紫色的视黄醛（retinal）作为辅基。

目前认为，细菌视紫红质与叶绿素相似，在光量子的驱动下，具有质子泵的作用，产生质子的跨膜运输而形成ATP。嗜盐菌只有在环境中氧浓度很低和有光照的条件下才能合成紫膜。这时，通过正常的氧化磷酸化已无法满足其能量需要，转而由紫膜的光合磷酸化来提供。 通过紫膜的光能转化而建立的质子梯度除了可驱动ATP合成，还可为嗜盐菌在高盐环境中建立跨膜的钠离子电化学梯度，并由此完成一系列的生理生化功能。 五、耗能代谢

1、合成代谢：微生物利用分解代谢产生的能量、中间产物以及从外界吸收的小分子，合成复杂的细胞物质的过程。

合成代谢需要能量：ATP和质子动力。

中间产物：丙酮酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸和三磷酸甘油醛等。 合成小分子物质：糖类、氨基酸、脂肪酸、嘌呤、嘧啶等。

2、兼用代谢途径：微生物细胞在正常生长情况下，需要从分解代谢途径中取得大量中间代谢物才能满足其合成细胞物质的基本需要。对分解代谢来讲，需要回补中间代谢产物。在分解代谢和合成代谢中具有双重功能的途径，称兼用代谢途径。 （1）乙醛酸循环

用乙酸等2碳化合物合成草酰乙酸，以乙酸、乙醇、烃类或脂肪酸等为唯一碳源的微生物，其产生草酰乙酸的回补顺序是由乙醛酸循环完成。

乙醛酸循环中两种关键酶：异柠檬酸裂合酶、苹果酸合成酶。

该循环常与TCA同时存在，充分发挥TCA循环的产能功能和乙醛酸循环的中间代谢物回补功能。 （2）Calvin 循环，又称核酮糖二磷酸途径

除绿色植物、兰细菌和多数光合细菌，还包括好氧性化能自养微生物如硫细菌、铁细菌和硝化细菌，利用Calvin 循环，将CO2固定产生碳水化合物。

核酮糖二磷酸羧化酶和磷酸核酮糖激酶是本途径的特有酶。

30

Calvin 循环包括：CO2的固定、被固定的CO2还原、CO2受体的再生三个阶段。 （3）生物固氮

微生物将N2还原成氨的过程，称为生物固氮。生物固氮是某些原核生物所特有。至今已研究过的有50多属和100多种。目前尚未发现真核生物具有固氮作用。 根据固氮微生物与植物及其他生物的关系，可分为三类： 自生固氮体系；共生固氮体系；联合固氮体系 ①自生固氮体系

好氧自生固氮菌（Azotobateriaceac）

厌氧自生固氮菌（脱硫弧菌, Clostridium） 兼性厌氧自生固氮菌（Enterococcus） 大多数光合细菌（光合细菌、兰细菌）

②共生固氮体系 由两种生物形成的共生体共同将分子态氮还原为氨的过程。例如在根瘤菌与豆科植物的根形成的根瘤中将分子氮固定为NH3。

根瘤菌（Rhizobium）与豆科植物；弗兰克氏菌（Frankia）与非豆科树木共生；兰细菌与某些真菌---地衣； 肠杆菌与白蚁。 ③联合固氮体系

不生成共生固氮特殊结构，有较强的寄主专一性，如雀稗固氮菌与雀稗根系 固氮反应的必要条件

1、ATP的供应，1molN2要消耗10~15mol ATP.

2、还原力[H]及载体：电子载体Fd or Fld传递钼铁蛋白。

3、固氮酶 有组分I—钼铁蛋白,真正的固氮酶,具有催化活性;组分II,铁蛋白,或固氮铁氧还蛋白,传递电子.固氮酶对氧气敏感。不同来源的铁蛋白和钼铁蛋白结合在一起具有固氮酶活性。

固氮酶的底物专一性不强，用乙炔还原生成乙烯来测量固氮酶活性。 4、还原低物N2， 5、镁离子。

6、严格的厌氧环境。 固氮的生化途径

（4）微生物结构大分子---肽聚糖的合成

根据肽聚糖合成的部位，可分成三个阶段：细胞质、细胞膜和细胞膜外。 （1）细胞内主要合成N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸，及park-N-乙酰胞壁酸。 （2）在细胞膜上的合成

由“Park”核苷酸合成肽聚糖单体分子是在细胞膜上进行的。由于细胞膜疏水性，所以，耍把在细胞质中合成的亲水性化合物“Park”核苷酸穿入细胞膜并进一步接上N—乙酰葡糖胺和甘氨酸五肽“桥”，最后把肽聚糖单体(即双糖肽亚单位)插入到细胞膜外的细胞壁生长点处．必须通过一种称作细菌甾醇的类脂载体运送。

类脂载体是一种含有11个异戊二烯单位的C55类异戊二烯醇，通过两个磷酸基与N-乙酰胞壁酸分子相连，使糖的中间代谢物呈疏水 （3）细胞膜外

31

六、微生物次级代谢与次级代谢产物

1、初级代谢：微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所必需的物质和能量的过程，称为初级代谢。

2、次级代谢：某些生物为了避免在初级代谢过程中某种中间产物积累所造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型。可以认为是某些生物在一定条件下通过突变获得的一种适应生存的方式。

通过次级代谢合成的产物通常称为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等类型。 3、初级代谢与初级代谢的关系 1、存在范围及产物类型不同 2、对产生者自身的重要性不同

3、同微生物生长过程的关系明显不同

4、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同 5、相关酶的专一性不同

6、某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型

第八章 微生物的生长繁殖及其控制

重点与难点剖析

一、微生物生长繁殖的概念

微生物的生长是指细胞物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。当细胞个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加即繁殖。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但对低等特别是单细胞的微生物，由于细胞小，这两个过程紧密联系、很难划分，因此，微生物的生长繁殖，一般指群体生长，这一点与研究动物、植物有所不同。 1、 细菌一般没有有性繁殖，多采用二分裂方式。

2、 真菌除了进行无性繁殖，产生大量孢子如分生孢子、节孢子、厚垣孢子、孢囊孢子等外，还能进行

有性繁殖，产生有性孢子如卵孢子、接合孢子、孢囊孢子等。 二、微生物生长的测定

微生物生长：单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的变化

个体计数

微生物生长的测定： 群体重量测定

群体生理指标测定

（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定

通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）。

1、培养平板计数法

样品充分混匀后，取一定量的稀释液涂布或倾注在平板上，进行培养，统计平板上长出的菌落数。注意： 1） 同一稀释度三个以上重复,取平均值；

2） 每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；

一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。 2、膜过滤培养法

当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。 3、The most probable number method（液体稀释法） 1）未知样品进行十倍稀释；

2）取三个连续的稀释度平行接种多支试管并培养； 3）长菌的为阳性，未长菌的为阴性；

32

4）查表推算出样品中的微生物数目； 4、显微镜直接计数法

采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数，计算一定容积里样品中微生物的总数量。

缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；

（二）以生物量为指标测定微生物的生长 1、比浊法

在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。多应用于单细胞微生物的培养。 2、重量法

以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量。或通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；

该方法适合于测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法。 3、 生理指标法

微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。

样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。 三、生长曲线(Growth Curve)：

细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。一条典型的生长曲线可以分为：迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期四个生长时期。 1、 延缓期（Lag Phase）:

将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零，该时期又称延迟期、适应期。 迟缓期出现的原因：

微生物接种到一个新环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。 在生产实践中缩短迟缓期的常用手段

(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短； (2)利用对数生长期的细胞作为种子；

(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； (4)适当扩大接种量

2、指数生长期(exponential phase)：

以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。

对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。

几个重要的生长参数：

代时(Generation time)通常以G表示，是指在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doubling time）。

n

Nt= N0 X 2

繁殖一代所需的时间：

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t1 – t0 0.639

G = —————— = ————— n μ

μ：比生长速率：单位时间内生长的速度。 纳米细菌（nanobacteria），三天才分裂一次；

3、稳定生长期(Stationary phase)：又称恒定期或最高生长期：

由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。稳定生长期是细胞重要的分化调节阶段。

1） 开始储存糖原等内含物；

2） 形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌）；

3） 发酵过程积累代谢产物的重要阶段；某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期 4、衰亡期（Death phase）

营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。 衰亡期特点：

1） 细菌代谢活性降低； 2） 细菌衰老并出现自溶；

3） 产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。

4） 菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴

性反应 5、二次生长：

不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH4+等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。 四、同步培养(Synchronous culture)

使群体中的细胞处于一致，生长发育均处于同一阶段，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。

获得同步培养细胞的方法：

离心方法

机械方法 过滤分离法

硝酸纤维素滤膜法

温度

环境条件控制技术 培养基成份控制

其他（如光照和黑暗交替培养）

同步培养常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。 五、连续培养 (Continous culture )

在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。

培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。

恒浊连续培养：不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定。 连续培养 恒化连续培养：保持恒定的流速

六、环境对微生物生长的影响

影响微生物生长的外界因素很多，除营养条件外，还有许多物理条件。其中最主要的有温度、pH和氧气。

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1、 营养物质

2、水活性 微生物在生长过程中对培养基的aw有一定要求。

细菌 0.91；酵母菌 0.88；霉菌 0.80；嗜盐细菌 0.76；嗜盐真菌 0.65；嗜高渗酵母 0.60

3、温度

最低生长温度（一般为-5~-10℃，极端为-30℃） 嗜冷菌（≤20℃） 生长温度的三基点 最适生长温度 中温菌（20~45℃）

嗜热菌（≥45℃）

最高生长温度（一般为80~95℃，极端为105~300℃） 4、氧气

专性好氧菌：在正常情况下（0.2巴）进行好氧呼吸和产能 好氧菌 兼性厌氧菌：以呼吸为主，兼营发酵产能 以呼吸为主，兼营厌氧呼吸产能 微生物与氧 微好氧菌：只能在0.01~0.03巴的大气压下生活。

厌氧菌 耐氧菌：只能以发酵产能，分子氧无毒害。

厌氧菌：只能生长在无氧或基本无氧的情况下，氧剧毒。

表6-1氧气对微生物的作用 微生物 SOD H2O2酶 好氧和兼性厌氧 + + 耐氧性 + - 专性厌氧菌 - - 5、 pH

微生物作为一个整体，生长的pH极广，绝大多数种类生长在pH5~7之间。 嗜碱性微生物，如硝化细菌、尿素分解菌、根瘤菌和放线菌。 PH生长微生物 耐碱性微生物，链霉菌 嗜酸微生物，如硫杆菌，

耐酸微生物，如乳酸杆菌，醋酸杆菌。 同一微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程，有不同的pH值要求。如Aspergillus niger在pH2~2.5范围内有利于产柠檬酸，在pH2.5~6.5范围内以菌体生长为主;在pH5.5~7.0范围内,以合成草酸为主.

微生物的外环境中pH变化很大,其内环境中的pH却相当稳定,一般都接近中性. 由此避免了DNA、ATP和叶绿素等重要成分的破坏。

一般胞内酶的最适pH都接近中性，而周质空间的酶和胞外酶则接近环境的pH。pH通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。 七、微生物生长繁殖的控制 （一）控制微生物的化学物质

一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质

非选择性 消毒剂(Disinfectant) （对所有细胞均有毒性） 防腐剂(Antisepsis)

抗微生物剂 抗代谢药物

有选择性 抗生素

（对病原微生物毒性更强） 中草药有效成分

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1、防腐剂和消毒剂

消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。

防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。

各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：

石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）。 石炭酸广泛用于一些热敏感的或无法进行高温灭菌的物品或场所的灭菌。 2、抗代谢物(Antimetabolite)

有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物相似，以至可以和特定酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行，这些物质称为抗代谢物。 磺胺药物作用机理：

磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物.磺胺的抑菌作用是因为很多细菌需要自己合成叶酸而生长。磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶----二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。 3、抗生素(Antibiotic)

由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。

半合成抗生素：通过微生物发酵生产母核，再通过化学修饰在母核上连接不同的侧链。 作用机制：

根据抗生素作用的部位可划为不同种类：

抑制细菌细胞壁合成：青霉素、杆菌肽、D-环丝氨酸、万古霉素 破坏细胞质膜：多粘菌素是细胞膜上的蛋白质释放。 作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化：短杆菌肽

抑制蛋白质和核酸合成：链霉素、新霉素、卡那霉素、四环素、嘌呤霉素 最终结果抑制或杀死微生物的生长和繁殖。

青霉素β-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构相似，从而能占据D-丙氨酸的位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链之间无法彼此连接，抑制了细胞壁的合成。

由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同抗生素的抗菌谱各异。 （二） 控制微生物的物理因素

1、干热灭菌 烘箱内热空气灭菌，160℃，2小时

火焰灼烧

2、湿热灭菌：借助于水蒸气的灭菌方式。

湿热比干热灭菌更好：1）更易于传递热量；2）更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构； 湿热灭菌常见以下几种方式：

1）巴斯德消毒：60-85℃处理15秒至30分钟 2）煮沸消毒：100℃ 30min 3）间歇灭菌：杀死芽孢

4）常规高压灭菌：121℃，15分钟；或115℃，30分钟；

5）连续加压灭菌：135-150℃，5-15秒，工业上发酵培养基；135-150℃，2-6秒，牛奶或其它液态食品 3、辐射作用

辐射灭菌(Radiation Sterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波 杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。

用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和γ-射线等 4、过滤作用

空气和不耐热的液体培养基的灭菌

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第九章 微生物遗传 重点与难点剖析

一．遗传的物质基础 1．转化实验 1928, Griffith

RII + SIII(加热杀死) ? 小鼠死 ? 血液中分离出SIII

1944, Avery等 证明只有SIII的DNA才能将RII转化为SIII, DNA是遗传物质.

RII ? SIII的DNA SIII型细菌 SIII的DNA+除DNA酶以外的酶 SIII的DNA+DNA酶

SIII的RNA RII型细菌 RII型细菌 SIII的蛋白质 SIII的荚膜多糖

2．噬菌体感染实验

1952年Hershey 证明T2噬菌体的DNA含有整套遗传信息 3．烟草花叶病毒拆分实验烟草花叶病毒拆分实验

1956年Fraenkel-Conrat 烟草花叶病毒拆分实验证明RNA是遗传物质

二．微生物的基因组 基因组（genome）：

一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称.细胞或病毒中的所有基因以及非基因的DNA序列的总称, 包括结构基因,调控序列,功能目前尚不清楚的DNA序列. 基因：编码多肽、rRNA和tRNA的多核苷酸序列。

细菌、真核生物、古生菌基因组主要特点比较： 染色体特点 遗传信息连续性 操纵子结构 结构基因拷贝数/重复序列 负责信息传递功能的基因（复制、转录、翻译） 细菌类 细菌 Escherichia coli 的基因组 真核 染色体为双链环状一般不含内含的DNA分子（单倍体） 子，遗传信息是连续的而不是中断的 典型的真核染色体结构 有间隔区（即非编码区）和内含子序列，断裂基因 同细菌 大量存在 单拷贝 重复序列少而短 高度重复 Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母)的基因组 古生菌没有明显的操纵子结构 同细菌 真核生物类 Methanococcus jannaschii (詹氏甲烷球菌)的基因组

染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）； 另外有有5个组蛋白基因，暗示其染色体同细菌 类似于真核生物 37

结构类似与真核生物 三．质粒

质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。

1．质粒的分子结构：通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）

2．质粒的检测：

? 提取所有胞内DNA后电镜观察； ? 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；

? 对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。 对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象（提取质粒时造成或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。

3．质粒的主要类型

质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，

从而使宿主得到生长优势。

质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应: 致育因子（Fertility factor，F因子）

抗性因子（Resistance factor，R因子，抗药、抗重金属 ） 产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 毒性质粒（virulence plasmid） 代谢质粒（Metabolic plasmid） 隐秘质粒（cryptic plasmid）

高拷贝数(high copy number)质粒（每个宿主细胞中可以有10-100个拷贝）----松弛型质粒(relaxed plasmid)

低拷贝数(low copy number)质粒（每个宿主细胞中可以有1-4个拷贝）--— 严谨型质粒(stringent plasmid)

窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制） 广宿主范围质粒(broad host range plasmid)（可以在许多种细菌中复制）

4．质粒的不亲和性

某些质粒可以在同一个细菌中并存，能并存的质粒属于不同的不亲和群（亲和现象），不能并存的质粒属于同一不亲和群（不亲和现象）。

四、转座因子

转座因子（transposable element）：位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。

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遗传学效应

① 插入突变（无义，有义）；

② 导致染色体畸变（不同位置上的2个转座因子发生同源重组，导致的染色体DNA缺失、倒位）； ③ 基因移动和重排。

原核生物中的 3类 : IS（insertion sequence）;Tn转座子（transposon）; 特殊病毒 1．IS

最简单的转座因子，250-1600bp，只含有转座所必须的转座酶基因，分布在细菌的染色体、质粒和某些噬菌体DNA上。引起无义突变，可以回复。 IR（inverted terminal repeat） 2．Tn转座子

授予宿主某些遗传特性的基因，如抗生素，抗毒物基因，乳糖发酵基因等。 2种类型 ①复合转座子，2端为顺向或反向的IS，其他基因位于中部， Tn5 ②复杂转座子，2端为IR（30-50bp），其他基因位于中部，Tn3

整合子(integrons) 是存在于细菌中可移动的基因捕获和表达的遗传单位,通过转座子或质粒在细菌中传播遗传物质。

大多数细菌的耐药性都是由于获得外源耐药基因而引起的.近年来,国外学者通过大量实验证明,整合子是细菌,尤其是革兰阴性杆菌多重耐药性迅速发展的主要原因。 3．特殊病毒 Mu-噬菌体

E．coli 的温和噬菌体，可以溶源化，也可裂解生长，含有噬菌体生长繁殖的必需基因，同时含有转座所必须的基因，因此是目前发现的最大转座因子。全长39kb，2端无反向重复序列。

五．基因突变

突变：可以通过复制遗传的DNA结构的任何改变.

2类 : 基因突变: 1个基因内部DNA结构的任何变化 染色体畸变: 大片段DNA的缺失、重复和倒位.

DNA结构的任何改变可以通过DNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，这取决于修复作用和其它多种因素。

1．基因突变类型及其分离

密码子: 3个碱基对应1个氨基酸,是生物内负载遗传信息的基本单位. 特点: ① 三联体密码子; ② 简并性 4种碱基? 64个三联体密码( 3个终止密码 , UGA, UAG, UAA,

61个密码子, 20氨基酸); ③ 非重叠性

碱基改变与基因突变: 同义突变, 无义突变, 移码突变, 错义突变 统一图

表型变化及其分离

表型: 可以观察、检测到的个体性状或特征，是基因型在一定环境条件下的表现。 基因型：DNA的碱基顺序

几种常用的表型变化的突变型及其分离: 营养缺陷型;抗药性突变型;条件致死突变型;其他突变型. ① 营养缺陷型（auxotroph）

一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。

表型判断的标准：在基础培养基上不能生长(负选择标记)

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影印平板（Replica plating）法: Lederberg在1952年建立

+

营养缺陷型的表示方法：在具体使用时多用 hisCˉ 和 hisC ，分别表示缺陷型和野生型 ② 抗药性突变型（resistant mutant）

基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。

特点：正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）

rs

表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示, str 和str 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

③ 条件致死突变型（conditional lethal mutant）

在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。

常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（temperaturesensitive）表示，这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如25-30℃）下得到这种突变。(负选择标记)

影印平板法分离, 和营养缺陷型不同的是培养基, 完全培养基 ④ 其它突变类型: 形态, 菌落形态、颜色、噬菌斑形成，etc.

非选择性突变, 突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。

2．基因突变的分子基础 突变

-6-9

自发突变 环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-10 。 诱变 某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。 (1). 自发突变

特点:非对应性(自发性，随机性); 稀有性; 规律性; 独立性; 遗传和回复性; 可诱变性

88

突变率：每单位群体繁殖一代形成突变体的数目。如突变率为1×10?，既意味着当10个细胞分裂一次平均形成一个突变体。

三个经典实验: 变量实验、涂布实验、影印实验

证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！突变是自发产生的!

分子基础 :

自发突变的原因 : DNA聚合酶产生的错误; DNA的物理损伤; 重组 ; 转座; 等 主要原因: 碱基的互变异构; 移码突变; 转座因子插入突变. 移码突变的遗传学效应 ：① 插入突变（无义，有义）；② 导致染色体畸变；③ 基因移动和重排。

RNA基因组的突变 :

高于DNA基因组1000倍以上。

部分原因: RNA复制酶没有纠正活性；没有类似于DNA的修复机制。

(2). 诱发突变

许多化学、物理和生物因子（称为诱变剂mutagen) 能够提高突变频率，诱发突变并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率。 诱变剂 ：

? 碱基类似物(Base analog)：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤 ? 插入染料(intercalating dye) ：溴化乙锭和吖啶橙 ? 直接与DNA碱基起化学反应的诱变剂：

? 亚硝酸:引起含NH2基的碱基(A.G.C)产生氧化脱氨反应，造成碱基置换。 ? 羟胺:几乎只和胞嘧啶发生反应，因此只引起GC→AT的转换.

40

? 烷化剂:甲磺酸乙酯和亚硝基胍烷基化鸟嘌呤和腺嘌呤, 烷化后的碱基也像碱基结构类

似物一样能引起碱基配对的错误。

? 辐射和热 ：紫外线：T-T二聚体，SOS修复

χ-射线，γ-射线：DNA单链断裂；自由基。 热：胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶

? 生物诱变因子 ：

诱变剂与致癌物质——Ames试验 诱变剂的共性原则：

化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。

超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用；90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。 美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验

具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(hisˉ)的回复突变率。 (3) 回复突变(reverse mutation或back mutation)：

突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。

由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试验的准确率达80-90%。

六、DNA损伤及其修复

主要的四种类型：光复活作用；切除修复；重组修复； SOS修复 光修复（光能）：光复活作用 暗修复（ATP）：切除修复，重组修复，SOS修复 1. 光复活作用：光解酶在黑暗中专一性识别嘧啶二聚体，并与之结合，形成酶-DNA复合物，当有光照时，酶利用光能将二聚体拆开，恢复原状，酶再释放出来 2. 切除修复

暗修复的一种，是细胞内主要的 修复系统。四种蛋白质联合作用：UvrA，UvrB，UvrC和UvrD

3. 重组修复：越过损伤而进行的修复。DNA的嘧啶二聚体仍然需经过其他的修复系统加以修复，或经过细胞的分裂而稀释。 4. SOS修复

DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。 涉及一批修复基因及产物：

recA（RecA，单链DNA的结合活性，以及由此而出的蛋白酶活性）

lexA（LexA，调节蛋白，与操作子结合阻止基因的转录,可以被RecA –DNA切割成2个部分,此时无阻遏功能）

uvrA（UvrA） uvrB（UvrB） uvrC（UvrC）

RecA与DNA的结合能够抑制DNA聚合酶III的3’-5’外切酶活性,使DNA聚合酶顺利通过损伤部位,以错误为代价的快速修复过程,导致突变而保存生命.

七、细菌基因转移和重组 细菌的四种水平基因转移形式

接合：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导） 转导：由噬菌体介导

转化：游离DNA分子 + 感受态细胞

41

原生质体融合：细胞原生质体融合

1．细菌的接合作用(conjugation) 机制 (大肠杆菌的接合机制)

7(

接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导，F因子的分子量通常为5×1094.5kb)，上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。 含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛； 不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛。

F因子既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上. F因子的四种细胞形式:

+

? Fˉ 菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F）；

+

? F菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。

? Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。

? F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体

基因的F因子，特称为F′因 子。 细胞表面同样有性菌毛。

(1) F+×Fˉ杂交

F+菌株的F因子向Fˉ细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。 杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞

理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成Fˉ菌株 (2) Hfr ×Fˉ杂交（参见P 217） Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。

Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与Fˉ细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细

胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×Fˉ杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是Fˉ。 (3) F′×Fˉ杂交

Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。

F′×F-与F+×F-的不同：给体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞 a）与染色体发生重组；

b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体； 细胞基因的这种转移过程又常称为性导(sexduction），F因子转导（F-duction），F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。

2． 细菌的转导（transduction）

由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。

能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体 细菌转导的二种类型：普遍性转导，局限性转导 (1) 普遍性转导（generalized transduction）

噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程 (2) 局限性转导（specialized transduction）

温和噬菌体感染，整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化，溶源菌因诱导而发生裂解时，

42

在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上（几率一般仅有10），部分缺陷的温和噬菌体，把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中。

3．细菌的遗传转化（genetic transformation）

同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程

自然遗传转化（natural genetic transformation） 人工转化（artificial transformation） 进行转化必要的二方面条件：

感受态的受体细胞:自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；

人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA

导入细胞内。

外源游离DNA分子:

转染(transfection)：噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒。特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。

4．原生质体融合

两个亲本菌株去除细胞壁后的一种体细胞杂交育种方法 (1) 亲本及其遗传标记选择

营养缺陷、抗性标记、荧光染色标记等 (2) 原生质体制备

? 高渗溶液：无机盐（KCl, NaCl, MgSO4）、

有机物(蔗糖、甘露醇、山梨醇)

? 水解酶： 溶菌酶\\蜗牛酶、纤维素酶、葡聚糖酶） (3) 原生质体融合

化学融合法：30%-50%PEG(1000-6000)诱导，渗透压，低速离心1000-2000g

电融合:细胞在电场作用下,细胞内产生偶极化,促使细胞排列成串,外加瞬间高频直流强电压作用,原生质膜穿孔复原 (4) 原生质体再生

再生培养基高渗，无机盐/有机物，防止机械损伤 (5) 融合子选择

营养缺陷型, 抗性, 荧光染色标记, 钝化选择(亲本一方融合前50℃2-3h) ；连续传代几次

四种方法比较

类型 受体\\供体是否接触 接合 转导 转化 原生质体融合 是 否 否 原生质体 + F因子 噬菌体 无 原生质体 DNA传递媒介 重组涉及 DNA大小 部分染色体 一个或少数几个基因 一个或少数几个基因 2个细胞的基因组 -6

八．微生物与基因工程

基因工程（genetic engineering）或重组DNA技术(recombinant DNA technology)：是指对遗传信

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息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。 对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术： DNA的特异切割；DNA的分子克隆（人工转化方法的建立）；DNA的快速测序；DNA合成技术；聚合酶链式反应（PCR）（DNA的体外扩增）；DNA的定位诱变技术。

M与基因工程的关系

? 基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成； ? 基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；

? 微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源

基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；

①能够高效吸收外源DNA；

②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统； ③不具有限制修饰系统；

④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA-）； ⑤便于进行基因操作、筛选和大量繁殖；

⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。

? 为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是

酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；

? 微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特

的基因资源；

? 有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植

物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。

第十章 微生物生态 重点与难点剖析

一．生态学基本概念

生物圈：地球上所有生物及其所居住的环境的总和. 生物 初级生产者 非生物 无机物 消费者 有机物

分解者 气候(大气、太阳能、生活空间、水)

生态系统：生物群落与其周围环境相互作用的功能系统，是生物圈的组成单元。生物圈中任何一个相对完整的自然整体都是一个生态系统。一个池塘，一片森林等。 种群或群体（population）：指属于同一个种的一大群生物（同一个种的生物，不同个体的集合）。 群落（community）：指一定区域中的所有种群。

能量流：能量通过生态系统从一种生物传递给另一种生物的现象。

每一营养级能量 自身代谢活动以热的方式损耗 生物死亡后为分解者分解 未被分解，以有机物形式贮存

剩余（10-20%）为高一营养级的生物所消费

热量 自身呼吸热量 自身呼吸热量 自身呼吸

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光能 光合生物 食草动物 食肉动物

自身呼吸热量 分解者

营养库（化学物质贮存库）

微生物可以在多个方面但主要作为分解者而在生态系统中起重要作用 生态学：研究生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门科学。 微生物生态学：研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系。

? 微生物在生态系统中的作用；

? 各种环境中的微生物，微生物和其它生物的关系； ? 微生物与环境保护

二．微生物在生态系统中的作用 1．M在生态系统中的地位 生态系统：

物质循环

生物群落 所生活的非生物环境 能量流动

生产者：从无机物合成有机物;

消费者：利用有机物进行生活，一般不能将有机物直接分解成无机物; 分解者：分解有机物成无机物

（1）微生物是有机物的主要分解者: 微生物最大的价值也在于其分解功能。它们分解生物圈内存在的动物和植物残体等复杂有机物质，并最后将其转化成最简单的无机物，再供初级生产者使用。

（2）微生物是物质循环中的重要成员: 微生物参与所有的物质循环，大部分元素及其化合物都受到微生物的作用。在一些物质的循环中，微生物是主要的成员，起主要作用；而一些过程只有微生物才能进行，起独特作用；而有的是循环中的关键过程，起关键作用。

（3）微生物是生态系统中的初级生产者: 光能营养和化能营养微生物是生态系统的初级生产者，它们具有初级生产者所具有的二个明显特征，即可直接利用太阳能、无机物的化学能作为能量来源，另一方面其积累下来的能量又可以在食物链、食物网中流动。

（4）微生物是物质和能量的贮存者: 微生物和动物、植物一样也是由物质组成和由能量维持的生命有机体。在土壤、水体中有大量的微生物生物量，贮存着大量的物质和能量。

（5）微生物在地球生物演化中的作用: 微生物是最早出现的生物体，并进化成后来的动、植物。藻类的产氧作用，改变大气圈中的化学组成，为后来动、植物出现打下基础。

2．M与生物地球化学循环

生物地球化学循环（Biogeochemical cycling）: 指生物圈中的各种化学元素，经生物化学作用在生物圈中的转化和运动。这种循环是地球化学循环的重要组成部分。 循环快: 生命物质的主要组成元素（C、H、O、N、P、S）， 循环较慢: 少量元素（Mg、K、Na、卤素元素）；迹量元素（Al、B、Co、Cr、Cu、Mo、Ni、Se、V、Zn） 课堂讲解 碳循环、氮循环 （1）碳循环

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碳素是一切生命有机体的最大组分，接近有机物质干重的50%。碳循环是最重要的物质循环。 P75

在好氧条件下，大生物和微生物都能分解简单的有机物和生物多聚物；微生物是唯一在厌氧条件下进行有机物分解的 （2）氮循环

6种氮化合物的氧化还原反应所组成:

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N2, NH3(NH?), NO2ˉ, NO3ˉ, N2O, R-NH2 ? 固氮

? 氨化（脱氨）、硝化作用（化能自养微生物：硝化细菌、亚硝化细菌） ? 硝酸盐还原

? 同化硝酸盐还原（硝酸盐还原成亚硝酸盐和氨，氨被同化成氨基酸） ? 异化硝酸盐还原

? 发酵性硝酸盐还原（硝酸盐作为发酵过程的附带受体，还原成亚硝酸盐和氨） ? 呼吸性硝酸盐还原 （硝酸盐呼吸，最终电子受体，还原成亚硝酸盐和氨）

? 反硝化作用（硝酸盐呼吸，还原成N2O、N2）

三．生态环境中的微生物 1．M种群之间的相互作用

相互作用的基本类型包括8种：P293 ①中立生活：没有关系

②偏利作用：一个受益（必需），一个无影响。

偏利：岩石表面的微生物生长，使不溶性的无机盐溶出；降解多聚物产生有机酸，代谢有机酸生成甲烷； ③协同作用：互相获利，但可以单独生活，种群可以替换。 ④互惠共生：互相获利，但不可分离单独生活，不可替换。 蓝细菌和真菌的共生体-----地衣

蓝细菌：光合作用， 固氮作用；真菌：提供生长因子。 ⑤寄生：内寄生：病毒，蛭弧菌；

外寄生：不进入或不接触，产生一些胞外酶，裂解宿主细胞，释放出营养物质。如食藻细菌。

⑥捕食： 原生动物 ⑦偏害（拮抗）：

⑧竞争：生存空间和食物 2．M在自然界中的分布

微生物的特点：个体微小、代谢营养类型多样，适应能力强 ? 微生物在自然界中分布广泛。 在某些生境中，高度专一性的微生物存在并仅限于这种生境中，并成为特定生境的标志。

（1）空气中的微生物

? 不适合微生物的生长繁殖，无固定的微生物区系； ? 来源于土壤、水体及人类的生产、生活活动；

? 种类主要为真菌和细菌，一般与其所在环境的微生物种类有关； ? 数量取决于尘埃数量（ 附着在灰尘上,“微生物之舟”）； ? 停留时间和尘埃大小、空气流速、湿度、光照等因素有关； ? 停留时间和尘埃大小、空气流速、湿度、光照等因素有关； ? 与人类的关系：传播疾病、造成食品等的污染 测定方法：培养皿沉降法；液体阻留法

（2）水体中的微生物

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淡水、海水中微生物的数量和分布不同。天然湖泊、污染水域微生物的种类和数量不同。 主要影响因子：营养物水平、温度、光照、溶解氧、盐分等。

富光层：光合藻类，好氧M；中度光照层：好氧M，兼性厌氧M；贫光层：厌氧M 严重污染的水会通过食物链的生物放大作用危害人类健康 靠近城市或城市下游水中的微生物多。 水体的富营养化作用， “水花”、“赤潮”

水体大量的有机物或无机物，特别是磷酸盐和无机氮化合物 ? 水的富营养化 ? 藻类等过量生长，产生大量的有机物 ? 异养微生物氧化这些有机物，耗尽水中的氧，使厌氧菌开始大量生长和代谢 ? 分解含硫化合物，产生H2S，从而导致水有难闻的气味 ? 鱼和好氧微生物大量死亡，水体出现大量沉淀物和异常颜色。

（3）土壤中的微生物

土壤是固体无机物(岩石和矿物质)、有机物、水、空气和生物组成的复合物，是微生物的合适生境（大本营）。土壤微生物种类多、数量多、代谢潜力巨大，是主要的微生物源。

? 土壤微生物的数量和分布主要受到营养物、含水量、氧、温度、pH等因子的影响，并随土壤类

型的不同而有很大变化。

? 土壤微生物的数量和分布受季节影响；

? 微生物的数量也与于土层的深度有关，一般土壤表层微生物最多，随着土层的加深，微生物的

数量逐步减少。

（4）极端环境下的微生物

嗜热微生物;嗜冷微生物;嗜酸微生物;嗜碱微生物;嗜盐微生物;嗜压微生物 研究意义：

? 开发利用新的微生物资源，包括特异性的基因资源；

? 为微生物生理、遗传和分类乃至生命科学及相关学科许多领域的研究提供新的课题和材料； ? 为生物进化、生命起源的研究提供新的材料。

（5）不可培养微生物（uncultured microorganisms）

从环境中直接分离并克隆rRNA并分析其序列和在分子进化树上的位置等方法而发现的的目前尚不能在人工条件下获得培养的微生物。参见P372： 研究意义：

生物多样性和系统发生的多样性（Biodiversity and Phylogenetic diversity）;微生物生态学的研究提出新的要求; 寻找新的致病微生物; 从不可培养微生物中寻找新的基因、新的蛋白.

据报道，美国recombianant biocatalysis Inc公司目前已从不可培养微生物中获得了约300个与工业生产相关的新蛋白.

（6）动物体中的M 人体微生物:

皮肤: 一个成年人的皮肤大约有2m2，约有1012细菌。优势的细菌种群是革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌较少见,真菌有瓶形酵母属. 皮肤表面正常栖居的微生物对外来微生物具有排斥作用，可以防止外来微生物和病原微生物的侵染，对皮肤有保护作用。

口腔: 包括细菌、放线菌、酵母菌、原生动物，以细菌数量最多 胃肠道:

胃， 仅有数量较低的附在胃壁上的抗酸微生物，包括酵母、链球菌、乳杆菌等

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小肠，近胃端的低量(10CFu/ml)到近大肠端的高量(10CFu/ml)。

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大肠，微生物数量巨大(10CFu/ml)，区系组成包括：拟杆菌、真杆菌、厌氧链球菌、双歧杆菌、肠球菌、肠杆菌、乳酸菌、梭菌、酵母等。

微生物合成的维生素、蛋白质，产生的能源可以为人吸收利用。

（7）植物相关M

? 茎、叶、果实的表面是某些M（好氧）生存的良好环境，细菌、蓝细菌、酵母等；某些M能够引

起植物病害； ? 植物根部微生物

? 根际微生物：由根面向外伸展，具有一个M梯度的区域。

? 老根、腐根际，大量、多样M; 健康幼根，选择性M ;说明根的分泌物较植物碎片更具选择

性

? 菌根：植物的根 + 真菌（子囊菌，担子菌）? 共生体. ? 外生菌根，内生菌根 P300

? 根瘤：根瘤菌与豆科植物的共生体，弗兰克氏菌与非豆科植物（乔木和灌木等木本植物形成

的共生体）

四． 微生物与环境保护

1．微生物对污染物的降解与转化 （1）环境污染物的来源

自然存在：重金属，烃类，放射性物质等

经转化及富集：由于生活或工业加工过程对自然界存在的物质富集、转化。污水，肥料，燃料燃烧废

物，石油等。

人工合成： 农药; 表面活性剂; 合成聚合物; 石油化工产品 . 非自然界存在物质，特殊的化学结

构，化学键，难降解物质。当前研究的主要课题.

（2）降解质粒：质粒编码了控制某些污染物的降解 P305

2．污染物的M处理 （1）BOD 与 COD

（biological oxygen demand）（chemical oxygen demand）

BOD：水中有机污染物在需氧微生物作用下进行氧化所消耗的氧气量。实际测定时，在一定的温度下，5天的需氧量。 BOD5

COD：水中有机污染物在强氧化剂作用下进行化学氧化所消耗的氧气量。 KMnO4：氧化率60%左右. CODMn K2Cr2O7：氧化率80-100%. CODCr （2） 污水处理

一级处理：粗大固形物

二级处理：生物，化学，物理法去除有机物

三级处理：生物，化学，物理法去除N、P及其他无机物 好氧处理 活性污泥法

二级处理 生物膜法: 生物滤池, 生物转盘, 生物接触氧化法 厌氧处理 沼气发酵, 光合细菌 ? 活性污泥法

活性污泥是由复杂的微生物群落与污（废）水中的有机、无机固体物混凝交织在一起构成的絮状物，又称为菌胶团。

活性污泥中的微生物组成一个微型的、复杂的、有密切相互关系的混合生物群体的生态系统。有细菌、

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11

真菌、原生动物、后生动物等多种微生物群体结合组成 微生物的代谢反应; 活性污泥的物理化学作用

? 生物膜法

生物接触氧化法与生物滤池的主要区别：

? 下面进水； ? 机械供氧；

? 漂浮微生物絮体（活性污泥）

? 厌氧处理：高浓度有机污水，微生物分解产生甲烷。

高分子有机物 ? 低分子有机物 ? 甲酸、乙酸、甲醇等一碳化合物 (产酸阶段,兼性厌氧M，专性厌氧M)

? 甲烷(产甲烷阶段, 产甲烷细菌)

生物处理的优点 ： ① 谢途径多样；②完全净化；③设备简单，作用条件温和，费用少；④处理各种重金属污

染，通过吸附、累积、沉淀，易于回收；⑤效益高（肥料，沼气，蛋白质饲料等）。

第十一章 微生物分类及鉴定

重点与难点剖析

一. 分类学基础

分类学(taxonomy)：生物分类的科学

微生物分类学(microbial taxonomy):研究微生物分类理论和技术方法的学科

1. M分类学三个组成部分(既独立又相互关联的三个部分): 分类(classification)

鉴定(identification或determination) 命名(nomenclature)

分类(classification)：根据相似性或相关性(进化亲缘关系)将生物归属为类群或分类单元.

鉴定(identification或determination)：决定某一特定分离物归属于某一已确定分类单元的过程。 命名(nomenclature)：给予分类类群单元与公布规则相符的名称.

2. 分类单元及其等级

分类单元(taxon,复数taxa)：是指具体的分类群，如： 原核生物界(Procaryotae)、杆菌科(Enterobacteriaceae)、 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等都分别代表一个分类单元。

国际公认的7个生物分类单元:界(亚界 ), 门 (亚门 ), 纲(亚纲 ), 目(亚目 ), 科(亚科 ), 属(亚属 ), 种(亚种 ).

除此之外, 在M的分类中, 还常使用一些非正式的类群术语, 亚种以下常用培养物、菌株、居群和型；种以上常使用群、组、系等类群名称 ；近年伍斯 还在界之上使用域(domain)，他把全部生物分为古生菌域、细菌域和真核生物域，域下面再 分界，把\域\作为分类单元的最高等级。 (1). 种(species): 物种，生物分类中基本的分类单元和分类等 级。

高等生物中，物种通常被看作是彼此杂交能繁殖的自然群体，这个群体与其他群体在生殖上是隔离的。在这里，“生殖隔离”被看作是区分物种的标准。

微生物的种：菌株的一个集合，这批菌株有许多共同稳定特征，并与其他类菌株有显著区别。

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有相似G+C组成，DNA杂交同源性在70%以上的菌株的集合。

(2). 亚种(subspecies): 是正式分类单元中地位最低的分类等级。

当某一个种内的不同菌株存在少数明显而稳定的变异特征或遗传性状而又不足以区分成新种时，可以将这些菌株细分成两个或更多的小的分类单元--亚种。

变种是亚种的同义词。在《国际细菌命名法规》(1976年修订本)发表以前，变种是种的亚等级，因\变种\一词易引起词义上的混淆，1976年后，细菌种的亚等级一律采用亚种，不再使用变种。

(3). 属(genus): 介于种(或亚种)与科之间分类等级，也是生物分类中的基本分类单元。通常是把具有某些共同特征或密切相关的种归为一个高一级的分类单元，称之属。

(4). 科(family): 系统分类中，把具有某些共同特征或相关的属归为更高一级的分类单元称为科。 (5). 培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。

纯培养(pure culture): 单一微生物细胞繁殖产生的培养物.

(6). 菌株(strain)：在一个特定分类学中至少与其他一些群体是可以区别的生物群体。是来自单个或纯培养物的微生物，一个种内菌株间在许多方面有小差别。

(7). 居群(population)：\一词也有人译为群体、种群或群丛等，是指一定空间中 同种个体的组合。

(8). 型(form或type)：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间的性状存在差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。

由于\一词既代表\型\又可代表\模式\，为避免混淆，现在对表示型的词作了修改，用\代替\。现将较常用的 型的含义及其表达方式列于表中。

中文译名 推荐使用的名称 以前使用的同义词 应用于只有下列性状的菌株 生物型 biovar biotype 特殊的生理生化性状 血清型 serovar serotype 不同的抗原特征 致病型 pathovar pathotype 对宿主致病性的差异 噬菌型 phagovar phagotype lysotype 对噬菌体溶解反应的差异 形态型 morphovar phagotype lysotype 特殊的形态学特征

常用型的术语及其含义 p322

(9). 群(group), 组(section), 系(series):这些类群名称用在不同场合，常常有非常不同的含义，可以是种水平上的类群，也可以代表属以上等级的分类 单元的集合。如《伯杰氏系统细菌学手册》第一版中，主要根据表型特征将全部原核生物分为33组。将假单胞菌属(Pseudomonas)内的90个种分为5组。

3.微生物的命名 (1). 命名法则

? 所有正式分类单元的学名, 必须用拉丁词或其他词源经拉丁化的词命名. ? 属名: 一般拉丁字名词，字首字母大写, 主要特征. ? 种名: 林奈氏双名法，由二个拉丁字组成，

属名(字首字母大写) + 种名加词(全部小写) Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus thuringiensis

若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到种，可用sp.来表示单数，spp.来表示复数. 例如

Bacillus sp.

Bacillus spp.

? 亚种名: 三元式组合;

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