止颤汤对帕金森病大鼠神经干细胞诱导分化作用的研究_李文涛

辽宁中医药大学学报

第11卷 第9期 2009 年 9 月

辽宁中医药大学学报

JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM

Vol. 11 No. 9 Sep . ，

2009

止颤汤对帕金森病大鼠神经干细胞诱导分化作用的研究

李文涛，李如奎

（上海市中医医院神经内科，上海 200071）

目的：探讨止颤汤对帕金森病大鼠神经干细胞的增殖及向多巴胺能神经元分化的作用；方法：实验动摘 要：

物分为3组，正常组及模型组用生理盐水灌胃，止颤汤组用止颤汤灌胃，分别在处理后7、14、28天免疫组化法检测，神经干细胞标志物nestin及其在脑内位置变化，多巴胺递质转运子DAT蛋白表达。比较各组差异；结果：在动物处理后28天，止颤汤组帕金森病模型大鼠脑内nestin及DAT数量较对照组增多，且多分布在中脑损伤区域；结论：止颤汤对帕金森病大鼠脑内神经干细胞的增殖及向多巴胺能神经元分化有一定促进作用。

止颤汤；帕金森病；神经干细胞；实验研究关键词：

(2009) 09- R742.5 文献标识码：A 文章编号：1673-842X 0005- 03中图分类号：Study of the Inducing Effect of Zhichan Soup on the Neuron Stem

Cell Differentiation of Parkinson's Disease Model Rats

LI Wen-tao,LI Ru-kui

（Neurology Department of Shanghai Traditional Chinese Medicial Hospital,Shanghai 200071,China）

Objective: To study the inducing effect of Zhichan Soup on the neuron stem cell Abstract：

differentiation of Parkinson's disease model rats; Methods: the rats were divided into three groups, the normal and model groups were administered with 0.9% normal saline by gavage ,and the Zhichan Soup group with Zhichan Soup,the nestin and DAT protein were checked with immunohistochemical method respectively after the rats were treated 7,14 and 28 days .Results: compared to the control group, the nestin and DAT protein were significantly increased in the Zhichan Soup group at the 28 days time point, and the nestin protein were mainly appeared in midbrain.Conclusion: Zhichan Soup has the effect to promote the proliferation and differentiation of the of neuron stem cell Parkinson's disease model rats.

Zhichan Soup;Parkinson's disease;neuron stem cell;experimental studyKey words：研究表明成年大鼠脑内仍存在有分化潜能的

神经干细胞（neuron stem cell,NSC），在疾病等应激的环境下，这些干细胞可被激活—增殖及向神经元分化，但这种作用很弱，难以再生出足够的神经元来修复受损的神经组织。如果通过外来因子的干预，促进体内神经干细胞大量增殖并向多巴胺能神经元分化，有望为帕金森病根本治疗提供有效方法。止颤汤在以往的研究中显示出较好的临床疗效，本研究观察了该药对帕金森病大鼠自身神经干细胞的增殖及向多巴胺能神经元的分化的作用。

1 材料与方法1.1 实验材料

transportor,DAT）抗体，（兔抗大鼠）AB1591P：Dopamine Transporter [DAT]，供应商：Chemicon。

1.2 研究方法

BrdU (5-溴脱氧嘧啶核甘酸)抗体：（小鼠抗大

鼠）MS-1058-P0：Bromodeoxyuridine (BrdU) Ab-3，供应商：NeoMarkers；nestin(巢蛋白)抗体，（兔抗大鼠）ab5968：Rabbit polyclonal to Nestin - Neural Stem Cell Marker，供应商：abcam；SD大鼠：中科院上海啮齿类实验动物中心提供；酶酪氨酸羟化酶（tyroxine hydroxylase,TH）抗体，（小鼠抗大鼠）ab23763：Mouse monoclonal [6D7] to Tyrosine Hydroxylase，供应商：abcam；多巴胺递质转运子（dopamine

1.2.1 PD大鼠模型制备 参照有关文献制作大鼠

大鼠用1%戊巴比妥钠（0.5mL/100g）腹PD模型[1]：

腔注射麻醉后，固定于立体定向仪上，用6-OHDA定向损毁大鼠单侧黑质多巴胺能神经元,损毁后2周，颈部皮下注射0.1%阿扑吗啡，每只0.2mL,检测大鼠向健侧旋转的圈数，大于7r/min，为模型成功，用于实验。

1.2.2 动物分组及处理 （1）正常对照组：大鼠经过抓取，固定，但不做手术，0.9%生理盐水4mL，每天分2次灌胃。（2）止颤汤组：制作大鼠PD模型，然后止颤汤1.2mL/100g灌胃（1.2mL/100g为以前动物实验中起效的最佳剂量）用9%生理盐水稀释为4mL，每天分2次灌胃。（3）模型对照组：模型制作后,大鼠0.9%生理盐水4mL，每天分2次灌胃。1.2.3 检测指标 分别于处理后7、14、28天处死动物。免疫组化检测时动物处死前1天，注射BrdU,每4h一次，注射3次。处死后经心脏注射肝素化生理盐水10min，然后用4%多聚甲醛灌注15min，取出脑

2009-04-11收稿日期：

上海市科委自然基金资助项目（05ZR14109）基金项目：

李文涛（1970-），男，河南偃师人，副主任医师，博士，研究方向：中医药治疗神经变性疾病。作者简介：

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组织，4%多聚甲醛固定，制作切片，进行免疫组化检测。

(1)各组NSC增殖、迁徙观察：免疫组化法检测不同时间点NSC标志物nestin(巢蛋白)及其在脑内位置变化。

(2)各组NSC分化为多巴胺能神经元的观察：免疫组化法检测多巴胺递质转运子（dopamine transportor,DAT）蛋白表达。

1.2.4 图象处理及结果分析 对下述照片进行图像分析，所有数据采用SPSS10.0统计软件进行分析,记数资料用方差分析（one-way ANOVA）。

2 结 果

2.1 不同时间点各组nestin表达比较

用。见图10~图

12。

图10 中药组nestin 28天表达100x 图11 中药组nestin 14天表达100x

见图1~图9，见表

1。

图12 中药组nestin 7天表达100x

2.3 不同时间点各组DAT表达比较

见图13~图21，见表2。

图1 28天中药组 100x 图2

28天模型组 100x

图13 正常组DAT 7天表达100x 图14

正常组DAT 14天表达100x

图3 28天正常组 100x 图4

14天中药组 100x

图5 14天模型组 100x 图6

14天正常组 100x

图15 正常组DAT 28天表达100x 图16 模型组DAT 7天表达100x

表1 不同时间点各组nestin表达比较

图7 7天中药组 100x 图8

7天模型组 100x

正常组 6 3.06±1.05 4.06±1.36 4.22±1.26 模型组 6 4.45±1.22 5.56±0.96 6.36±1.62中药组 6 4.55±0.82* 5.68±1.12* 9.06±1.32**

注：和模型组比较，*P>0.05，**P<0.01。

表2 不同时间点各组DAT表达比较

图9

7天正常组 100x

正常组 6 2.16±0.95 3.23±1.36 3.22±1.05 模型组 6 2.65±1.31 3.62±0.88 4.36±1.28中药组 6 2.85±0.99* 3.60±1.22* 7.18±0.74**

注：和模型组比较，*P>0.05，**P<0.01。

2.2 不同时间点各组nestin 在脑内表达位置比较

从上述免疫组化图象上看，在第7、14天，nestin

阳性细胞数量较少，脑内各区域分布变化不明显，在第28天，中药组中脑区域nestin阳性细胞数有所增加，提示中药对干细胞向损伤区迁徙有一定促进作

3 讨 论

1992年Reynolds 和Weiss 从成年鼠海马分离

出NSC,又在前脑、室旁区发现了NSC，在成年哺乳动物的脑室下区,尤其是邻近侧脑室最前的部分、海

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马齿状回的颗粒下区,甚至其他部位,存在着具有神经再生能力的NSC[2],这些发现为研究成体神经组织的再生和修复提供了细胞基础，成体神经干细胞具有与胚胎干细胞相似的自我复制和多潜能分化的特性。那么是否可以利用成年哺乳动物脑内自身的神经干细胞的增殖、迁徙并分化为多巴胺能神经元，与周围建立突触联系，实现神经功能的重建呢？这样可以避免外源性NSC移植中存在的很多问题，将是理想的细胞代替方法。在正常情况下,成体内源性NSC处于休眠状态,在脑损伤时,这些细胞被激活,发生增殖、迁徙并分化[3]。但这种自然的增殖分化能力是很弱的，不能改善PD患者多巴胺能神经元的退化。因此寻找促进自身的内源性NSC增殖和定向分化的药物，将对治疗PD

的病因非常有益。

图17 模型组DAT 14天表达100x 图18

模型组DAT 28天表达100x

中药是否具有促进NSC增殖，诱导其向功能神

经元分化的作用，目前也进行了初步的探索。有报道发现，黄芪、丹参[12-14]有多篇研究都提示有诱导间质干细胞定向分化为神经元样细胞的作用，以及对体外培养的海马神经干细胞缺氧、自由基损伤有保护作用。中药特别是复方，具有多靶点，整体治疗特点，这种特点可能更有助于改善脑内微环境诸多因子或基因，进而起到促进NSC定向分化的作用。

PD根据其临床表现，属于中医颤证范畴，止颤汤是李如奎教授多年治疗PD的经验总结，有黄芪、丹参、钩藤等组成，有益气养阴、熄风清热、化瘀除痰作用，在以往研究中初步证实可以改善患者及帕金森病大鼠模型的症状，该复方是否有促进脑内NSC增殖及向多巴胺能神经员分化的作用，尚待研究。本研究发现该方处理后28天时，PD大鼠脑内NSC数量较对照组增加，分化为多巴胺能神经元数量较对照组有所增多，提示可能对脑内NSC增殖及向多巴胺能神经元的定向分化有一定促进作用。但这种分化的数量是否足够大，带来脑内多巴胺水平升高，从而改善症状，目前还不能确定。本研究只是对该复方对NSC分化作用进行了粗浅研究，其可能机理还有待深入探讨。

NCS定向分化的机理目前还不甚清楚，特别是对体内自身NSC的分化，其影响因素是多方面的，可能与中药改善脑内微环境的各种因子有关。脑内哪些因素与NSC增殖分化有关，值得探讨，在此基础上寻找改善这些因素的药物，有望实现神经变性疾病脑内功能的重建，从而为这类疾病的根本治疗带来希望。◆

参考文献

[ 1 ] 周嘉伟.帕金森病大白鼠动物模型的建立[ J ] .南通医学院学

报，1989 ( 2 )：84-86.

[ 2 ] Rossi F, etal. Opinion :neural stem cell therapy for neurological

disease .dream and reality [ J ] . Nat Rev Neruosci，2002，3：401.[ 3 ] Englund U，Fricker-Cales RA,Lundberg C,et al.Transplantation

of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain：extensive migration and differentiation with-long distance axonal projection [ J ] .Exp Neural 2002，173 ( 1 )：1-21.[ 4 ] 项鹏，夏文杰，王连荣，等.丹参注射液诱导间质干细胞分化为

神经元样细胞[ J ].中山医科大学学报，2001，22 ( 5 )：321-324.[ 5 ] 董晓先，刘金保，董燕湘，等.黄芪诱导骨髓间质干细胞分化为

神经元样细胞[ J ] .中国现代医学杂志，2004，14 ( 19 )：19-22.[ 6 ] 余勤，罗依，董勤，等.黄芪对间质干细胞分化为神经元样细

胞的定向诱导作用[ J ] .中华急诊医学杂志，2004，13 ( 12 )：826-829.

图19 中药组DAT 7天表达100x 图20 中药组DAT 14天表达100x

图21 中药组DAT 14天表达100x

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