抗肿瘤药物筛选中MTT法和SRB法的比较_谭卫东

　　天然产物研究与开发　　　　　　Vol.11　No.3N ATURAL PRODU CT RESEARCH AND DEVE LO PM EN T 　　　　　　　　　　　　

收稿日期:1999-01-07抗肿瘤药物筛选中M T T 法和SRB 法的比较

谭卫东　金　红　罗弟祥　钟绍东　苏　芝　彭旭东　高小平

(中国科学院成都地奥制药公司　成都　610041)

摘　要　在抗肿瘤药物的体外筛选中,M T T 法和SRB 法是常用的两种方法。我们用

M T T 法和SRB 法分别测定3种已知植物抗癌药对22株人肿瘤细胞的抗癌活性,对这

两种方法进行了详细的比较。通过分析两种方法测出的细胞存活率(T /C)的差异分布

和相关系数以及IC 50的二变量分布,比较了两种方法测定结果的异同;通过两种方法重

复测定3种药物对7株人癌细胞的抗癌活性,比较了两种方法的重复性;通过分析两种

方法测定结果T /C 值随时间变化的程度,比较了两种方法测定结果的稳定性。实验结

果表明:M T T 法和SRB 法的相关性较好,都可用于抗肿瘤药物的体外筛选,SRB 法更

适合于大规模筛选,3种抗癌药物的测定结果与临床资料基本一致。

关键词　M T T 法,SRB 法,抗肿瘤药物体外筛选抗肿瘤药物筛选是抗肿瘤药物研究工作中非常重要的一个环节,建立合理的筛选体系,提高筛选质量,发现新的抗癌药物,是90年代肿瘤药理研究的一项重大课题。美国国立肿瘤研究

所目前使用的筛选方法是针对某种肿瘤病而不是以肿瘤总体为对象[1],这种方法用60种人体

瘤细胞系作为筛选用模型,组成一个“板块”。此板块按肿瘤病种种类再分成白血病、黑色素瘤、肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌及中枢神经系统癌等7个亚板块。如果某种受试药物的细胞毒作用具有亚板块特异性,则可能发现对某种(些)肿瘤具有选择性的抗肿瘤药。在此基础上,辅以针对机理的生化筛选测定,并用体内模型复筛,就可以筛选出有效的抗癌药物,用于临床试验。

我们建立了“板块”筛选方法,用M TT 法[2]和SRB 法[3]在体外初步测定药物对癌细胞杀

伤作用的选择性。在本文中,我们通过测定目前国内厂家生产并已用于临床的3种植物化学抗癌药对肿瘤细胞的抑制作用,对这两种方法进行了详细的比较。

1　材料与方法

1.1　材料

细胞:从我室保存的来自9种肿瘤(包括白血病、黑色素瘤、肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、中枢神经系统癌、前列腺癌和乳腺癌)细胞中,每种随机选择2～3株,共22株人癌细胞株。

药物:高三尖杉酯碱注射液为杭州民生药厂出品,批号为970617-2;注射用硫酸长春新碱为上海华联制药公司出品,批号为950501;足叶乙甙注射液为连云港制药厂出品,批号为980512。M T T 和SRB 染料均购自SIGM A 公司,其余试剂为市售分析纯。

17DOI:10.16333/j.1001-6880.1999.03.004

1.2　方法

1.2.1　接种细胞:消化处于指数生长期的细胞,用含10%小牛血清的RPM I 1640配成混悬液。将细胞分到96孔板中,每孔含5000～40000个细胞,在37℃,5%CO 2中培养24h 。

1.2.2　加药:受试药物以10倍稀释,作5个稀释度,如10-4,10-5,10-6,10-7,10-8

mo l /L,加入96孔板,在37℃,5%CO 2中培养48h 。1.2.3　结果测定:用M T T 法和SRB 法同时测定同一种药物,比较两种方法测得结果之间的差异;分别用M T T 法和SRB 法复试同一种药物,判定两种方法各自的重复性高低。

M T T 法和SRB 法操作程序如下[4]:

M T T 法:接种细胞预培养　1d 　药物处理

　2d 　

加M T T

　4h 　

加DM SO 溶解

570nm 读数

SRB 法:接种细胞预培养

　1d 　药物处理　2d 　

TC A 固定

　1h 　

水洗5遍

　干燥　

加SRB 染色

　15min 　

醋酸洗涤5遍

　干燥　

T ris 溶解

490nm 读数

1.2.4　数据分析

1.细胞存活率分析　分析两种方法同时测定某种药物所得到的细胞存活率(以T /C %表

示,T 为加药细胞的OD 值,C 为对照细胞的OD 值),分析其差异分布。用一般相关系数法

[5]

和Pea rso n 相关系数法[6]

分析M TT 法和SRB 法间的相关系数。

M T T 法和SRB 法的重复性试验是在第一次试验的基础上,从22株细胞中随机选取7株,分别测定3种药物的抑制作用,与第一次测定结果相比较,分析其差异分布,并用一般相关系数法和Pea rson 相关系数法分析M TT 法和M T T 法,SRB 法和SRB 法两次测定结果间的相关系数。

2.-1g IC 50的二变量分析　比较M TT 法和SRB 法测定得出的IC 50,计算二变量分布[7]。

3.M TT 法和SRB 法测定结果的稳定性比较　随机选取两种方法同时测定3种药物的96孔板,染色后按0h ,2h ,16h ,24h 测定其OD 值,将2h ,16h ,24h 所得OD 值与0h 比较,分析T /C 值随时间的变化。

4.药物对肿瘤细胞抑制作用的分析　根据药物对22株肿瘤细胞的IC 50值,分别算出9类肿瘤细胞的平均IC 50,以此判定药物对肿瘤细胞抑制作用的选择性以及抑制作用的程度。

2　结果

2.1　T /C 率的比较

M T T 法和SRB 法测定结果的比较分析和重复性的比较结果见表1。

表1　M T T 法和SRB 法同时测定药物对肿瘤药物抑制T /C 率的差异分布

Table 1　Dis tribution of difference for T /C ratios of M T T ass ays vs.S RB assays for inhibition of tumor cell grow th

T /C 率差异的分布百分率

Differ ence in T /C ra tio s(%)

M T T v s.SRB

重复性试验Retest SRB v s.SRB

M T T v s.SRB

≤522.438.944.4≤1042.464.467.8≤20

60.686.786.7>20

39.413.313.3样品数(对)Sa mple size(pair s)

375

90

90

18　　天然产物研究与开发

V o l .11　No .3

两种方法测定共得到T /C 数据375对,T /C 数据对中有60.6%的差别为中度(差别小于20%),说明两种方法的测定结果差异较小。两种方法重复性的比较各得到90对T /C 数据,

M T T 法的重复性比较中有86.7

%的差别为中度,SRB 法的结果与之相同,显示出M TT 法和SRB 法都有很好的可重复性。2.2　相关系数的比较

计算M TT 法和SRB 法检测结果的相关系数,结果见表2。

表2　M T T 法和SRB 法同时测定药物对肿瘤药物抑制T /C 率的相关系数

T able 2　Co r relatio n in T /C ratio s of M T T assay s v s .SRB assa ys for inhibition of tumo r cell g r ow th

T /C 率的相关系数Co r relatio n in T /C ratios

M T T v s .SRB S RB 的重复性试验SRB v s .SRB

M T T 的重复性试验M T T v s .M T T

一般相关系数Co rr ela tio n co efficient

0.810.960.94Pea rson 相关系数Pear so n co r relatio n co efficient 0.810.960.93样品数(对)Sample size(pairs)

375

90

90

两种方法的测定结果用一般相关系数法和Pea rso n 相关系数法计算出的相关系数均为0.81,说明这两种方法有较好的相关性。用两种方法分别计算M TT 法重复性相关系数的结果为0.94和0.93,SRB 法均为0.96,两种方法各自的重复相关性均很好。2.3　IC 50值的比较

-lg IC 50的二变量分析结果见表3。

表3　-lg IC 50的二变量分析

Table 3

　Biva ria te distributio n of -lg IC 50v alues M T T 法-lg IC 50M T T assay (-lg IC 50in M units )

SRB 法-1g I C 50SRB a ssay (-lg IC 50in M units )

>87～86～75～64～5>80.03000007～800.1210006～700.0450.045005～600.0760.0910.0910.0304～5

0.061

0.091

0.318

计算用M TT 法和SRB 法同时测定药物对肿瘤细胞抑制作用的IC 50,共得到66对数据,算出-lg IC 50。按以下标准将M T T 法和SRB 法得到的-lg IC 50各分成五组:>8,7～8,6～8,5～6,4～5。由结果可见,对角线1lg 之内占60.5%,2lg 之内占86.2%,说明这两种方法的IC 50绝大部分差异在2lg 以内,两种方法所得出的结果相似。2.4　M T T 法和SRB 法测定结果的稳定性比较

稳定性比较结果见表4。

0h 测定值120个。2h 后M TT 法测定结果同0h 相比,有80%的数据小于或等于5%,24h 后降至50%,而SRB 法2h 、16h 、24h 后的测定结果同0h 相比100%的数据小于或等于5%。说明SRB 法的测定结果几乎不随时间而变,M T T 法的测定结果受时间影响较大。

19

V o l .11　N o .3谭卫东等:抗肿瘤药物筛选中M T T 法和SRB 法的比较　　

表4　M T T 法和SRB 法测定T /C 率随时间而变化的百分率比较

Ta ble 4　Co pa riso n in the v ariatio n of T /C ra tio n as the change o f time o f M T T assa ys v s.SRB assay s

fo r inhibitio n o f tumo r cell g ro w th

T /C 差异的分布百分率Difference in T /C ratios(%)

M T T 法M T T a ssay SRB 法SRB a ssay

2h 16h 24h 2h 16h 24h ≤0.300066.763.360.0≤100090.090.089.8≤580.066.750100100100≤10

96.7

80.0

70

100

100

100

2.5　药物对肿瘤细胞抑制作用

药物对肿瘤细胞抑制作用结果见表5。

表5　用M T T 法和SRB 法同时测定药物对9类肿瘤细胞抑制作用的平均-lg IC 50

Ta ble 5　M ea n -lg I C 50of M T T a ssay s v s.SRB assa ys fo r the cell g ro w th inhibitio n o f 3dr ug s against

9huma n tumo r cell lines 细胞Cell line

高三尖杉酯碱Ho mohar ring To nine 长春新碱Vincristin

足叶乙甙Eto po side M T T assa y SRB assay M T T assay SRB assa y M T T a ssay SRB assa y 肺癌Lung cance r 7.

167.67 5.006.21 4.65 5.09结肠癌Co lo n ca ncer 7.397.49 5.135.97 4.12 4.52乳腺癌Br ea st ca ncer 5.587.37 5.237.45 4.03 4.65肾癌Re nal cancer 5.52

6.49

5.00

5.73

4.20

4.65

中枢神经系统癌

Central nerv ous system cance r

5.167.24 5.35

6.56 4.63 4.95黑色素瘤M elanoma 5.13 6.98 4.884.74 4.34 4.68前列腺癌Pro state cance r 5.17

7.24 4.805.65 4.00 4.68卵巢癌Ov arian ca ncer 5.58 6.55 5.075.15 4.18 4.37白血病Leukemia

7.61

8.40

7.67

7.99

5.76

5.42

由IC 50可见,3种药物对9类肿瘤22株癌细胞的活性都有抑制作用,作用的强弱有差异。高三尖杉酯碱对白血病、肺癌、结肠癌等癌细胞的抑制作用较强,长春新碱对白血病、乳腺癌、中枢神经系统癌有较强的抑制作用,足叶乙甙对白血病、肺癌、中枢神经系统癌有疗效。

3　讨论

M T T 法和SRB 法是抗肿瘤药物的体外筛选中常用的两种方法,其原理各不相同。M TT 法分析以代谢还原M TT 为基础,活细胞的线粒体中存在脱氢酶,可将黄色的M TT 还原为不溶性的蓝紫色Fo rmazan,死细胞此酶消失,M T T 不被还原。通过测定颜色变化的深浅来测定肿瘤细胞受影响的情况[2]。M T T 法操作简便、敏感,可重复性及信号-噪音比好。但Fo rmazan 的生成受作用时间的影响,样品较多时测定的O D 值随时间而变,会增加实验误差。SRB 是一种蛋白质结合染料,可与生物大分子中的碱性氨基酸结合,其颜色变化与活细胞蛋白成正比[3]

。SRB 法用TCA 固定后可随时用SRB 染色作蛋白测定,而且SRB 用Tris 溶解后也可稳

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定一个较长的时期。特别适用于大规模筛选药物。但SRB 法染色步骤较多,操作较繁。

悬浮细胞经M T T 染色后,如果用DM SO 溶解,则需将每孔中的细胞吸出,离心去除上清,沉淀用DM SO 溶解后测定OD 值,操作繁琐且易造成人为误差。SRB 法将细胞固定后再染色,故适用于悬浮细胞和贴壁细胞的测定。

由于作用原理不同,两种方法的测定结果会有一些差异。我们通过计算两种方法所得T /C 值的差异分布和T /C 值的相关系数以及两种方法IC 50的二变量分布,分析所得结果,认为这两种方法测定的结果相似,都可用于体外测定抗癌药物对肿瘤细胞活性的抑制作用。但是,我们用M T T 法所测得的IC 50值普遍高于SRB 法,这与有些报道不符[8]。影响M T T 法测定结果的因素有多种,如:被试药物、细胞代谢和培养液的成分等都可能干扰M T T 的还原。我们使用的4种植物抗癌药属于生物碱,对M T T 的还原有何影响,用于体外筛选的几十株肿瘤细胞对M TT 降解的差异性如何,还须我们今后加以深入研究。另外,由于比较的样本不够多,分析结果可能会有一些偏差。随着今后筛选样品的增多,可用于统计的样本量增多,我们会得到更精确的比较结果。

通过分别比较两种方法测定T /C 值随时间而变化的百分率,证实了SRB 法的测定结果几乎不随时间而变,用M T T 法测定时,最好在1h 以内测定OD 值,以免影响试验结果。

SRB 法除了测定对照组细胞(C )及加药组(T )的OD 值外,可用另外的对照平板测定加药时的细胞OD 值(T 0),在加药前即刻将平板中接种的细胞用TC A 固定[9]。若T >T 0,说明加药后细胞仍然生长。生长率%=[(T -T 0)/(C -T 0)]×100。若T

T 0)]=50,在此浓度下,细胞数的增长降低为对照组的50

%。完全生长抑制(TGI ),在此浓度下,细胞不再增长,即T=T 0时的药物浓度。杀死50%细胞所需的药物浓度(LC 50),即[(T-T 0)/(C-T 0)]=-50时的药物浓度。我们通过一次测定就可得到有关药物作用的3个数值:GI 50、TGI 、LC 50。GI 50同IC 50相比,由于对照组细胞及加药组细胞的OD 值同时减去了T 0值,更真实地反映加药后细胞受抑制的情况。

综上所述,我们在筛选大量样品时都采用SRB 法,克服了M T T 法成色反应的时间依赖性,既可减少试验误差,提高工作效率,又能得到确切的试验结果。由于使用自动洗板机,也大大简化了SRB 法的染色步骤。

从植物中寻找抗癌药物,在国内外已成为抗癌药物研究的重要组成部分。近几年来,应用于临床的有高三尖杉酯碱、长春新碱、足叶乙甙、紫杉醇等,我们的测定结果与临床资料基本相符。因此,我们的“板块”筛选系统可用于抗肿瘤药物的初步筛选,对进一步做动物体内实验有指导作用。

参　考　文　献

1　La rr y M et al .J .Na tl .Cance r .Inst .1992,84:466～469

2　Ca rmichael J et al .Ca ncer Res.1987,47:936

3　Skehan P et al .J .Na tl .Cance r Inst .1990,82:1107

4　郑　树主编.中国癌症研究进展.1998,110

5　倪宗瓒主编.医学统计学.人民卫生出版社.1990,104～105

6　Haw kins C A et al .Statistica l Analysis.Har pe r and Row ,1980,391～3957　Rubinstein L V et al .J .Na tl .Ca ncer Inst .1990,82:1113～111821V o l .11　N o .3谭卫东等:抗肿瘤药物筛选中M T T 法和SRB 法的比较　　

8　Michael C et al .Ca ncer Resea rch ,1988,48:589～601

9　M onks A et al .J .Na tl.Cance r.Inst.1991,83:757～766

COMPARISO N OF MTT WITH S RB ASSAYS IN VITRO

AN TICANCER DRUG SCREEN ING

Tan Weido ng ,Jin Ho ng ,Luo Dixiang ,Zho ug Shaodo ng ,Su Zhi,Peng Xudong ,Gao Xiaoping

(Chengdu Di Ao pharmaceutical Company of Academia Sinica ,Chengdu 　610041)

Abstract 　The M TT and SRB assays are co mmo n methods used ex tensiv ely in in vitro anticancer drug screening.We com pared the tw o m ethods in details by ev alua ting 3plant deriv ed anticancer drug s bioactivity ag ainst 22hum an tumo r cell lines .W e tabula ted the differences betw een the tw o assays in the ratios of test g roup v alues to co ntrol v alues(T /C)fo r cell surviva l;calculated co rrelatio n coefficient for va rio us T /C ratio s,and estima ted the biv ariate distributio n o f the va lues fo r IC 50of the two assays .We also o bserv ed the va riation o f T /C as the chang e of time.Th e results indicate that w ithin the limits o f data both assays perfo rm simila rly ,either assay can be used in screening application .The SRB assay is mo re suitable fo r larg e -scale screening .The results o f 3drugs assay are coincident with the clinica l data.With this com pariso n,our system o f in vitro a nticancer drug screening w as g rea tly im prov ed.

Key words 　M T T a ssay ,SRB assay ,in v itro anticancer drug

screening

国家天然药物工程技术研究中心

在中科院成都地奥制药公司挂牌运行

中科院成都地奥制药公司与成都生物研究所共同申办组建的“国家天然药物工程技术研究中心”通过了国家科委组织的专家论证会,于今年初在中科院成都地奥制药公司正式挂牌运行。该“中心”的建成对于我国天然药物研究开发向高起点、高水平、高层次发展将起到积极的推动作用,对于我国医药工业的科技体制改革、形成科技与经济一体化新模式,促进科技成果转化为生产力、实现科技成果商品化、生产化和国际化都具有重要意义。

“国家天然药物工程技术研究中心”的主要任务是:研究开发天然药物提取分离纯化等先进的工程技术;研究开发提取分离技术的先进成套设备以及新型的提取分离材料;研究开发高科技含量的天然药物新品种(一、二类新药);面向全国培养既有研究能力,又有工程技术开发能力,既能解决天然药物工程技术问题,又具创新开拓思维的跨世纪人才;通过新技术、新设备、新品种与国内国际建立广泛的合作关系,加速科研成果向生产力转化,发挥“中心”的桥梁和通道作用和行业的示范推广作用,带动我国医药行业的快速发展,参与国际竞争,使我国的医药工业工程技术和新药早日进入世界先进行列。22　　天然产物研究与开发V o l .11　No .3

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