生物化学与分子生物学实验技术（扫描）

一 血糖定量测定(GOD-PAP法)

原理

动物血液中的糖主要是葡萄糖，正常情况下，其含量较恒定。健康家兔的血糖水平为80~120 mg／dL。(dL代表100 mL。)

GOD-PAP法，即氧化酶-过氧化物酶法是近几年临床血糖定量测定普遍采用的方法。该法测定血糖依据的酶反应为：

醌亚胺在A480nm~A550nm波长有最大吸收，所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的量成正比。在同样条件下，测定葡萄糖标准液和样品的光吸收值，即可求出样品中葡萄糖的含量。 试剂和材料

（1）血糖试剂盒：北京中生生物工程高技术公司产品，含有：葡萄糖氧化酶(GOD)>13 U／mL；过氧化物酶(POD)>0.9 U／mL；磷酸缓冲液：磷酸盐11 mmol／L，酚100 mmol／L pH7.0；4一氨基安替比林0.77 mmol／L；葡萄糖标准液：100 mL／dL。使用时，将90 mL磷酸缓冲液与10 mL酶制剂混匀制成的溶液为工作液。每一试剂盒装有2瓶磷酸缓冲液和2瓶酶制剂。 （2）样品：(兔血清) 操作

取3支试管，按下表加入试剂。

分别将各试管内容物摇匀，37℃保温10~15 min(避免阳光直射)。用光程为1.0 crn的比色杯，在A480~A550波长进行比色。将测得的A标准、A样品数据代入下

述公式，计算出样品中葡萄糖的浓度。

式中 C：样品中葡萄糖的浓度；A标准为葡萄糖标准液在A480~A550波长的光吸收值；A

样品

：待测样品在A480~A550波长的光吸收值；C

标准

为葡萄糖标准液中葡

萄糖的浓度。 注意事项

（1）试剂中含迭氮铵做为稳定剂，勿与皮肤、黏膜接触。

（2）制备样品时，血清应在收集血样后1 h内与细胞分离。加糖原酵解抑制剂(NaF，KF)后，15~25℃可贮存24 h，4℃在密闭的容器中可贮存7 d。

二 蒽酮比色定糖法

原理

蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。

蒽酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当样品中存在含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。对于以上特定的糖类，反应较稳定。

本法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。 试剂

（1）蒽酮试剂：取0.2 g蒽酮溶于100 mL 80％(V／V)硫酸中，当日配制使用；（2）标准葡萄糖溶液(0.1 mg／mL)：100 mg葡萄糖用蒸馏水定容至1 L(可滴加几滴甲苯作防腐剂)；（3）标准糖原溶液(0.1 mg／mL)：100 mg糖原用蒸馏水定容至1 L(可滴加几滴甲苯作防腐剂)。 操作

（1）制作标准曲线：取干试管6支，依次加入标准糖溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，并依次用蒸馏水补足体积到1 mL，置冰浴中5 min，各管均加入蒽酮试剂4 mL，沸水浴准确煮沸10 min，自来水冷却，室温放置10 min，比色测

定A620。

（2）样品含糖量测定：吸取1 mL无蛋白糖溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4 mL蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10 min，取出后自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。 计算

式中A：为样品稀释后的体积；C：为标准曲线查出的糖含量(mg／mL)；W：为样品的重量(mg)。

三 血清胆固醇的定量测定(磷硫铁法)

原理

血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇则溶在无水乙醇中。在乙醇提取液中加磷硫铁试剂，胆固醇和试剂生成紫红色化合物，呈色度与胆固醇含量成正比，可用比色法测定。 试剂

（1）10％三氯化铁溶液：10 g FeCl3·6H2O(A.R)溶于磷酸(A.R)，定容至100 mL。贮于棕色瓶中，冷藏，可用一年；（2）磷硫铁试剂(P-S-Fe试剂)：取10％FeCl3液1.5 mL于100 mL棕色容量瓶内，加浓硫酸(A.R)至刻度；（3）胆固醇标准贮液：准确称取胆固醇(C.P)80 mg，溶于无水乙醇，定容至100 mL；(4)胆固醇标准溶液：将贮液用无水乙醇准确稀释10倍即得。此标准液含0.08 mg／mL胆固醇。 操作

（1）吸取血清0.1 mL置干燥离心管内，先加无水乙醇0.4 mL，摇匀后再加无水乙醇2.0 mL，摇匀，10 min后离心(3000 r／min，5 min)，上清液备用。 （2）取干燥试管3支，编号，分别加入无水乙醇1.0 mL(空白管)、胆固醇标准溶液1.0 mL(标准管)、上述乙醇提取液1.0 mL(样品管)，各管皆加入磷硫铁试剂

1.0 mL，摇匀，10 min后，分别转移至0.5 cm光径的比色杯内，测A505。 计算

四 紫外吸收法测定蛋白质含量

原理

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，在280nm处有吸收峰。且吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。该测定法简单、灵敏、快速、不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用，特别是在柱层析分离中，利用280 nnl进行紫外检测，是最常用的方法。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，这是由于：①酪氨酸和色氨酸含量与标准蛋白质差异较大的蛋白质，有一定的误差；②若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。核酸对260nm紫外光的吸收比280nm更强。而蛋白质的A280大于A260，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。但是，因为不同比例的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差。

在测定工作中，可利用在280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。

对于稀蛋白质溶液还可用215nm和225nm的吸收差来测定浓度。从吸收差△与蛋白质含量的标准曲线即可求浓度。

式中A215：蛋白质溶液在215nm下测得的光吸收值；A225：蛋白质溶液在225nm下测得的光吸收值。

此法在蛋白质含量为每毫升20~100μg的范围内是服从比尔定律的。氯化钠，硫酸铵以及0.1 mol／L磷酸，硼酸和Tris等缓冲液都无显著干扰作用。但是，0.1 mol／L乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲剂在215 nm下的吸收较大，必须降至0.005 mol／L才无显著影响。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因

pH的改变而有所变化，故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH，最好与标准曲线制定时的pH一致。 试剂

标准蛋白质溶液：准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1mg／mL的溶液。 操作

1．标准曲线的制定

取8支试管，分别加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0 mL标准蛋白质溶液(1 mg／mL)，用水补足到4 mL，混匀。选用光程为1 cm的石英比色池，在280 nm处测定各管溶液的光吸收值。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘出标准曲线作为定量的依据。 2．样品测定

取适当浓度的待测蛋白质溶液，按上述方法测定280nm处的吸光度值，即可从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

假若已知某一蛋白质在280 nm的消光系数[A1m]，取该蛋白质溶液于280 nm处测定光吸收值后，便可直接求出蛋白质的浓度。

五 紫外吸收法测定核酸含量

原理

DNA和RNA的吸收高峰在260 nm处。嘌呤和嘧啶、核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数(或称吸收系数)用k(P)260nm来表示，k(P)260 nm为每升溶液中含有1 mol核酸磷的光吸收值。

RNA的k(P)260nm(pH 7)为7700~7800。RNA的含磷量约为9.5％，因此每毫升溶液含1 μg RNA的光吸收值相当于0.022~0.024。

小牛胸腺DNA钠盐的k(P)260nm(pH 7)为6600，含磷量为9.2％，因此每毫升溶液含1 μgDNA钠盐的光吸收值为0.020。

蛋白质由于含有芳香氨基酸，吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260 nm与

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