细胞生物学实验指导 - 图文

实验一、显微镜的结构与使用方法

一、 实验目的

1. 认识显微镜的构造 2. 学会独立操作显微镜

二、 仪器和材料

显微镜、擦镜纸、装片

三、 实验内容

1. 学生按编号把自己的显微镜取出，放在试验台上，在教师的指导下熟悉显微镜各部分的构

造及用途，然后进行操作练习。先用低倍镜进行对光联系，使视野明亮而均匀。如果使用双筒目镜，还应学习目镜间距的调节。在转换高倍物镜观察，此时应注意它的视野亮度与低倍物镜有无区别？并思考通过哪几种方法调节使得高倍物镜的视野达到要求的亮度。 2. 取已制备好的装片进行观察：按低倍镜使用步骤和方法进行操作练习。注意要使观察到的

像向前移动时，玻片标本应向那个方向移动？欲使观察到的像向右移动时，拨片标本应向那个方向移动？

3. 观察制备好切片：细胞核、中心体、胞间连丝、有丝分裂、减数分裂、高尔基体等。 4. 观察完毕后，按正规要求取下玻片，把显微镜收好。

四、 作业

绘制2-3中细胞结构

实验二、Feulgen反应显示DNA

（一）实验目的

1．掌握临时制片法。

2．熟悉Feulgen反应的原理及操作步骤。 3．观察细胞中DNA的分布。

（二）实验原理

Feulgen在1924年发明一种对DNA特异的组织化学染色反应，故称Feulgen反应。

DNA经酸（1mol/L HCl）水解后，DNA分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。该产物能特异地吸收峰值为550~570nm的光波。并且在一定的浓度范围内，对550~570nm光波的吸收值与DNA含量成正比关系，既符合化学计量学关系。此法既可定位用于细胞或组织化学染色反应，观察DNA的分布，又可用显微分光光度计和图像分析仪对细胞或组织中DNA的含量进行定量分析。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组或采取不经盐酸处理，或预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应。

Feulgen反应对DNA染色稳定、颜色鲜明、能定量，因此在细胞化学和组织化学中成为一个既古老、传统又经久不衰的DNA标记方法。

（三）实验器具与药品

1．实验器具

恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、染色缸、显微镜

2．药品

（1）1mol/L HCl：浓盐酸8.5ml，蒸馏水91.5ml。

（2）Schiff试剂：将0.5g碱性品红加入100ml沸水中，时时摇荡玻璃瓶，煮5min，使之充分溶解，然后冷却到50℃时过滤。滤液中加入10ml的1mol/L HCl，冷却到25℃时加入0.5g偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）或偏重亚硫酸钾（K2S2O5）。在室温下静置24小时，其颜色呈褐色或淡黄色，加活性炭0.5g，摇1min，过滤，滤液为无色。置棕色瓶密封，4℃保存。一般可以保存数月。

（3）0.5%亮绿水溶液（可稀释1~5倍使用）。 （4）Carnoy固定液：95%酒精:冰醋酸=3:1

（4）亚硫酸氢钠溶液：10%NaSO3母液5ml，1mol/L HCl 5ml加蒸馏水至100ml，用时现配。 （5）5%三氯醋酸 （6）二甲苯

3．实验材料

四膜虫、酵母、洋葱根尖

（四）实验方法

1．临时制片的制备方法

临时性的标本片是指在进行实验观察时，临时制备的不能长期保存的标本片。制备方法如下： 取一张载玻片，用左手拇指和食指夹持载玻片的两端，右手的拇指和食指夹着一块清洁而柔软的布，把载玻片放在两手指加着的布间，然后均匀地前后移动擦净载玻片的两面；盖玻片小而薄，擦时必须小心，把一张盖片平放在左手两指间夹着的布间，并轻轻捏住，右手指夹持盖玻片的边缘向一个方向转动进行擦拭，用力需轻而均匀（如果盖玻片上有油或其它难以擦净的东西，可滴加医用酒精后再用布擦）。把擦净的载玻片平放在桌上，用吸管小心吸取要观察的标本悬液，滴一小滴于载玻片的中央，然后用镊子轻轻夹住盖玻片的一端，将其对侧端先接触载玻片上悬液，慢慢地倾斜盖下防止产生气泡，再用吸水纸吸取多余的水分。如标本需要染色，可将染液滴在盖玻片的一侧（不要滴在盖玻片上），用吸水纸在盖玻片的另一侧边缘吸水，染液就会流入盖玻片的下方使标本着色。如果使用染缸进行染色，则待细胞悬液干了之后，固定、染色在染缸中进行。

2．实验步骤

（1）取少量四膜虫培养液涂于载玻片上，用牙签涂布开，空气中干燥。 （2）取少量酵母培养液同上操作。

（3）Carnoy固定液中固定10~30min。对照组1在预热（90℃）三氯醋酸溶液中处理15min。 （4）1N盐酸（60℃）浸15min。对照组2不经盐酸处理。 （5）入Schiff试剂作用40分钟到1小时（加罩，避光）。

（6）取出载玻片立即用新配制的亚硫酸氢钠溶液洗两次，每次2min。 （7）水洗2min，重复一次。

（8）0.1%亮绿染色10秒。取出后自来水略洗。 （9）空气中干燥，显微镜下观察。

（10）如所观察到的切片较好，可作封片。先用50%无水乙醇＋50%二甲苯处理3min。 （11）二甲苯处理2min。

（12）树胶封片。待干后可在显微镜油镜下观察。 （13）贴上标签，注明材料、反应名称、作者姓名及日期。

3．染色结果

处理 实验组 对照组1 对照组2 结果观察 实验组经Feulgen反应显示核结构细致、清晰，细胞核染成粉红色至紫红色，核仁不着色。经

亮绿处理的细胞的细胞质部分显绿色。对照组1由于DNA被破坏，细胞核无紫红色。对照组2由于DNA没有释放出醛基，细胞核显示出被亮绿染上的绿色。如果亮绿处理时间过长，则会造成细胞核区颜色过深。

（五）注意事项

1．载玻片和盖玻片上面可能有油，最好事先浸泡在70%酒精（储存于冰箱）中，待使用时取出以柔软绸布擦净。

2．提供的实验材料四膜虫和酵母可能浓度较低影响观察，可事先用离心机离心后弃部分上清后搅匀，达到浓缩目的

3．涂片时最好在载玻片上端一角做好标记，以免实验时弄反正反面。涂片区不要超过载玻片长度的2/3，涂成直径约为1cm左右的圆。

4．涂片完需待其完全干燥后（可置于温箱中使其快干），方可置carnoy固定液中固定，否则涂上的细胞会大量脱落。

5．在Schiff试剂中染色（切记在避光处反应）时，如室温过低会影响染色效果，可置于30度左右温箱中。

6．亚硫酸氢钠溶液要现用现配，以防SO2的逸出而失效。

7．亮绿染色时间不能过长，否则整个细胞包括细胞核区均会染色过深而看不出紫红色。

（六）作业

1．简图表示Feulgen反应的染色结果。

2．对经过不同的处理后的染色结果观察后，比较其不同，进行分析。

3．为什么到Feulgen染色的最后步骤时，要迅速反复地用现配的亚硫酸氢钠溶液洗？

实验三、植物细胞骨架的观察

一、实验目的：

初步掌握在光镜下植物细胞骨架标本的制作方法。

二、实验原理：

用适当浓度的Tritonx-100处理植物细胞时，可将细胞内的蛋白质破坏，但却可以保留细胞骨架系统的蛋白质。后者用考马斯亮蓝染色，在光镜下可观察到细胞骨架的网状结构。

三、实验用品：

（一）药品

1、 M缓冲液：50mM咪唑，0·5mM氯化镁，1mM EGTA[乙二醇双（a-氨基乙苯）醚四乙酸]，0·1mMEDTA（乙二胺四乙酸），1mM DTT（二硫苏糖醇）

2、 6mM PH6·5磷酸缓冲液（内含5mM KCl） 3、 1%Tritonx-100（用1液配制） 4、 3%戊二醛

5、 0·2%考马斯亮兰R250，用少许无水酒精溶解，然后用12·5%三氯醋酸定溶，装入滴瓶备用。

（二）用具：50ml烧杯、剪刀、镊子、手术刀、玻璃滴管、称量瓶（或青霉素小瓶）、

显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸（或卫生纸）、温箱等。

四、实验材料：

新鲜、幼嫩的洋葱鳞茎内表皮

五、方法步骤：

1、用镊子撕取洋葱鳞茎的内表皮（取材时注意不要用靠近边缘的内表皮），剪成0·5-1cm大小，放入10ml，6mM，PH6·5的磷酸缓冲液中。

2、将材料取出，用1%Tritonx-100处理0·5-1小时，（28oC温箱），然后用M缓冲液洗3-5次，每次5分钟。

3、用3%戊二醛固定一小时（28oC温箱）。

4、用6mM，PH6·5的磷酸缓冲液洗3-5次，每次10分钟。 5、用0·2%考马斯亮兰R250染色15min-0.5h（在载玻片上进行）。 6、材料染色后用蒸馏水冲洗。

7、制片，在高倍镜或油镜下观察，可见到与核联系的细胞骨架及靠近细胞壁的网

状结构。

六、注意事项：

1、 用Tritonx-100处理时，材料应浸泡入溶液 2、 染色时注意勿稀释药液

七、作业：

绘制洋葱鳞茎内表皮细胞的细胞骨架图。

实验四、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

一. 实验目的：

1. 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理； 2. 掌握垂直板电泳的操作方法；

3. 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色方法 二. 实验原理：

SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

三. 试剂和器材：

试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。

四. 实验操作；

（一）样品制备

将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，取上清点样。

（二）分离胶及浓缩胶的制备1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；

2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板； 3 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；

ddH2O 3.0 ml 1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml 30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul 10%AP 56 ul TEMED 6 ul

4 向玻璃板间灌制浓缩胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合； 5 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀； ddH2O 3.05 ml 0.5 mol/LTris-HCl pH=8.8 1.25 ml 30% Acr-Bis 0.4 ml 10% SDS 50ul 10%AP 56 ul TEMED 6 ul

6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳； 7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;

8 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr.

9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。

五、 计算分析

计算相对迁移率：Rf=蛋白质样品距加样端距离（cm）/溴酚蓝距加样端距离×100%

六、注意事项

1. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。

2. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10％误差，不可完全信任。

3. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。

4. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。

5. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。

实验五、口腔上皮细胞的活体观察

活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。

1．实 验 目 的

1．1. 观察口腔活细胞内线粒体的形态、数量与分布； 1．2. 学习一些细胞器的超活染色技术。

2．实 验 原 理

线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，

主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。

3．实 验 用 品

3．1 器材

显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。 3．2 试剂

3．2．1. Ringer溶液： 氯化钾 0.25g 氯化钙 0.03g 蒸馏水 100ml

3．2．2. 1%、1/5000詹纳斯绿B溶液

称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热(30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。 3．3 材料

人口腔上皮细胞，小麦种子或黄豆幼根根尖。

4．实 验 方 法

4．1 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上 ↓

滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液 ↓

用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞 ↓

刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 ↓

染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) ↓

盖上盖玻片,显微镜下观察

5．实验报告

（1）. 绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布

实验六、细胞免疫荧光测定

叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的, 由于具有这一重要功能，所以叶绿体一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。

1．实 验 目 的

1．1. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。

2．实 验 原 理

分离细胞器的常用方法是将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。

3．实 验 用 品

3．1 器材

3．1．1.主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。

3．1．2.小型器材: 500ml烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。 3．2 材料 新鲜菠菜。

3．3 试剂 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。

4．实 验 方 法

4．1叶绿体的分离与观察

新鲜的嫩菠菜叶 ↓

洗净擦干去除叶梗脉 ↓

取30克放入150ml氯化钠溶液 ↓

入组织捣碎机匀浆 ↓

低速匀浆（5000r/min）3~5min（破碎细胞） ↓ 匀浆液

↓6层纱布过滤，取4ml

1000r/min离心2min（去除组织残渣和未被破碎的细胞） ↓取上清

3000r/min离心5min

↓保留沉淀（即混有部分细胞核的叶绿体） 用氯化钠溶液悬浮 ↓

光学显微镜下观察 4．2菠菜叶手切片观察 新鲜菠菜叶 ↓

刀片切出一斜面置于载玻片上 ↓

滴加1~2d氯化钠溶液 ↓

盖上盖片显微镜下观察

5．实 验 结 果

5．1 叶绿体的分离和观察

5．1．1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

5．1．2. 以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。

5．1．3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。

5．2 菠菜叶手切片观察

5．2．1. 在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细胞: 为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞: 为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞: 为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。

5．2．2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱, 气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。

5．2．3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。

6实验报告

（1）. 根据荧光观察结果，绘制菠菜叶的结构模式图。 （2）. 概述滤镜系统的选用原则。

实验七、显微标本制作技术

一、

概述显微标本制作技术是组织学、胚胎学、生理学及细胞学等学科研究观察细胞、

组织的生理、病理形态变化的一种主要方法。大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辨明。但在经过固定、脱水、透明、包埋等手续后就可把材料切成较薄的片，再用不同的染色方法就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚地看到其中不同的区域组分状态，切片也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。

显微标本制作有许多不同的方法，一般可分为非切片法与切片法两大类：非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片等；切片法又包括石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法等。

显微标本制作技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异、化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验，才能得到较好的结果。 二、

实验用品

器械： 电热温箱、显微镜、切片机、电热温台、天平、玻璃器皿、其它 常用试剂：

约翰森固定液：由福尔马林5毫升、丙酸5毫升、50% 酒精90毫升配制。该液用

于固定植物根尖、茎尖，有较好的效果，通常固定24小时，也可做保存液。

常用脱水剂： 酒精、正丁醇、叔丁醇、丙酮等。 常用透明剂：二甲苯、甲苯、氯

仿、丁香油等。

常用粘贴剂：明胶粘贴剂：明胶1克、蒸馏水100毫升、石炭酸2克、甘油15毫升。

蛋白粘贴剂：新鲜蛋白25毫升、甘油25毫升、石炭酸0.5克。

包埋剂：石蜡、火棉胶、明胶等 封固剂：阿拉伯树胶、加拿大树胶

常用染剂：番红-固绿对染：固绿染液由0.5%的95%酒精溶液配制，番红染液由1%

的50%酒精溶液。制备植物石蜡切片常用固绿--番红对染，结果是木质化的细胞壁及细胞核染成红色，薄而且纤维素的细胞壁和胞质染成绿色。

三、实验步骤

切片法

1、 切片法是必须依靠手或切片机将组织切成薄片来进行观察的方法。为了能清晰

地观察到动、植物的组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，可分为徒手切片法、石蜡切片法、火棉胶切法、冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色、脱水、透明等步骤，将其制成永久标本。 2、 下边以石蜡切片为例，介绍显微标本制作方法。

2.1 取材

根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。

2.2固定

动、植物的任何组织部位，要制成切片，首先用化学试剂将其固定，固定的作用在于通过固定剂，在尽量短的时间内使原生质体停止生命活动，并如同生前一样精细的保存其细胞结构，同时易于后步骤的染色所以良好的固定剂应该具备以下条件：迅速渗入组织杀死原生质体，在短时间内，组织内外完全固定；尽可能避免使组织膨胀或收缩，并且软硬合适于切片；增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别，同时增加媒染作用和染色能力。固定液同时是防腐液，使材料不致变质。

2.3 脱水

脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯度脱水，脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。 脱水的过程：

一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100% →100%

脱水应逐步而不应跨越太大的进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。

2.4 透明

透明是用一种即能与酒精又能与包埋介质混合的液体来置换样品中的酒精，从而为最终的包埋创造一个有利的条件。 现采用的透明剂一般是二甲苯、甲苯、氯仿等。 其过程为：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯

二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。

2.5 渗蜡

将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，便于今后的包理与切片。 石蜡有液态与固态二种，渗蜡要在恒定温箱（60°c）中进行，以保证石蜡处于液态中。

2.6 包理

组织块经石蜡渗透后，其内部间隙已完全被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石蜡包理成蜡块以利于后边的切片，包理可用相同的器具，也可折叠一牛皮纸盒。 将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒，浅埋在石蜡内，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。

至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边的步骤表明看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。

2.7 切片

修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，并将这组织周围的石蜡切除，将组织修成一小块蜡块并粘在大小适宜的硬木块上，以便于固定在切片机上。

贴片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带

切下的蜡带放在一干净黑纸上，用小刀根据需要切成数段，分别贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平、烘干。 2.8 染色

切片可用不同方法，使其干燥，然后进行染色。因为每一张载片上粘贴的是蜡带，因此必须先用二甲苯去除石蜡再用酒精去除二甲苯，再进入水中，才能染色，染色的方法很多，要根据每张标本要求显示的目的选择不同的染剂，最常用的是苏木精，伊红染色苏木精使细胞核是深紫色，伊红使细胞质显粉红色，以此显示清晰的细胞形态和核的大小，位置，染色后再根据制片的基本原理，使带水的载片经历脱水→透明步骤最后哟感树胶封片

基本步骤如下：二甲苯×2（脱蜡）→酒精+二甲苯（1:1）→100%酒精×2→90% 酒精→80%→70%→50%→30%→水→苏木精染色(镜检)→水→50%→70%→90%→0.5%伊红(95%酒精配制)→95%→100%×2→二甲苯:酒精(1:1)→二甲苯×2→树胶封片 简便方法：

先将各种材料切成片，要薄，不要用力的用镊子夹，放在载玻片上，在载玻片上滴一滴水，将薄片放入，如颜色十分淡，加碘酒染色，盖上盖玻片，用纸巾将水吸干，即可。

四、实验结果

观察染色结果，绘制细胞图

实验八、离心技术与叶绿体的分离

一、实验目的

1 以分离叶绿体为例，掌握离心机的操作技术； 2 通过光镜鉴定叶绿体的纯度及了解叶绿体形状；

二、离心技术概述

离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向外的力而发展起来的一种分离技术。 （一）基本原理 离心力和相对离心力

1． 离心力（centrifugal force，Fc）是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到一个向外的力。离心力（Fc）的大小取决于角速度与旋转半径： Fc=mω2r （1）

其中ω是旋转角速度，单位为弧度/秒；r是颗粒离开旋转中心的距离，单位为厘米；m是质量，单位为克。

ω=2л n/60 (2)

2．相对离心力（relative centrifugal force，RCF）又称相对离心加速度，是指离心力相当于重力加速度的倍数。在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示。

单位是重力加速度g（980厘米/秒2）。式中r为离心转子的半径距离，指离心管的重心至转轴中心间的距离，单位为厘米；g为地球重力加速度（厘米/秒2）；n为转子每分钟的转数（rpm）。 为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，人们在⑶式的基础上制作了离心力的列线图。见图10-1. 先在离心机半径标尺上取已知的离心半径和在转速标尺上取已知的转速，然后在这两点间取一条直线，与中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的相对离心力数值，也是文献中常用的×g。 （二） 离心机的基本分类

超速离心机根据用途不同可分成两种基本的类型：制备性超速离心机和分析性超速离心机。制备性离心技术主要用于物质的分离、纯化，可分为一般性制备离心和制备性超速离心。与制备性超速离心不同的是，分析性超速离心主要用于研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。分析性超速离心机主要由转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。它使用了特殊

的分析转子和检测手段，在离心过程中可直接观察颗粒的沉降行为，并可进行扫描和拍照。

三、材料、试剂和仪器

1.材料 菠菜 2. 试剂

匀浆缓冲液： 0.38mol/L甘露醇,4mmol/L —50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 1mmol/L DDT，0.05℅ 牛血清白蛋白 3．器材

立式冰冻高速离心机、超声波粉碎机、光学显微镜、天平、研钵、漏斗、50mL 离心管、纱布、载玻片、盖玻片等。

四、实验步骤

1. 叶绿体的制备和纯化（以下操作应在冰浴中进行）。

1）将材料洗净，滤纸吸干水后，去叶脉，称取5g鲜重的叶片，剪成碎片。

2） 放入研钵中，量取25mL 匀浆缓冲液，先向研钵中到入15-20mL左右，再加少许石英砂进行充分磨碎。

3） 经八层纱布过滤于50mL离心管中,再将剩下的匀浆液冲洗研钵后也过滤于管中。（或1000g离心20min）。

4）滤液经3000g离心6min。

5）沉淀再次悬浮于10mL匀浆缓冲液中，再次3000g离心 6min，此时沉淀即为纯化的叶绿体。 6）在光镜下观察叶绿体的完整性和纯度。 2． 菠菜叶片徒手切片观察

1）用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶片削一个斜面至于载片上，滴加1-2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置于显微镜下仔细观察。

2）观察三种叶片（细胞表皮细胞，保卫细胞，叶肉细胞）和叶绿体

五、结果与分析

差速离心获得并纯化的叶绿体镜检为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。菠菜叶片徒手切片可以观察到三种细胞分别是边缘呈锯齿形的鳞片状的表皮细胞，构成气孔的成对的肾形保卫细胞，排列成珊栏状的长形和椭圆形叶肉细胞。

六、思考题

1.在普通显微镜下，用目微尺和台微尺测量叶绿体的长轴和短轴 ，分别测量6个，求平均值。 2.请分析每一步差速离心后的沉淀是什么细胞器？

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