Realtime PCR溶解曲线分析
更新时间:2023-10-21 13:01:01 阅读量: 综合文库 文档下载
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首先我们得来说说染料法SYBR Green的原理,SYBR Green能够结合在双链DNA上面的荧光染料,只有结合了双链DNA,才会发荧光,而游离的不会发光。 图1 SYBR Green原理 但是,染料没有选择特异性,就是只要有双链DNA,就会染上,并发荧光。 如果使用的引物产生了非特异性扩增,那么荧光强度就不是目的条带真实的强度,因此会产生严重偏差。融解曲线 我们如何判断本次qPCR扩增的都是目的片段呢?这就需要用到融解曲线。 在qPCR循环反应结束之后,系统会进行测定融解曲线,通常的方式就是从70度加热到90度,然后每隔一定时间(1s或者少于1s)测定系统荧光强度,随着温度的升高,dsDNA都解开双链,SYBR Green都游离之后不发荧光,荧光逐渐下降。那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线: 图2 融解曲线 然后我们运用医学中学到的高等数学C的求导,把荧光强度对温度求导,得出下图 图3 融解曲线的求导 为什么中间的峰那么高? dR/dT 越大,表明荧光值变化最快。随着温度上升,达到图中Tm点时,大部分扩增出来的双链DNA解开,荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异那么,融解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR产物长度以及GC含量相关)。 但是除了单峰还会出现什么样的情况呢?请看下面两个示意图 图4 前置杂峰 图5 后置杂峰
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