外泌体提取方法总结
更新时间:2024-05-24 18:01:01 阅读量: 综合文库 文档下载
1、 细胞培养上清:即在4℃下,首先300×g离心10 min,吸取
上清液,然后2 000×g离心10 min;吸取上清液后,10 000×g 高速离心30 min,吸取上清液;140000×g超速离心90 min;除去上清液,所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后,140 000×g 再次离心90 min,100 μL PBS缓冲液重悬沉淀,冻存于-80℃备用。 2、
将小鼠或人血收集在1.5mL管中,并使其在37℃下凝结1小
时而不进行抗凝。 此后,将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3,000×g离心10分钟。 将上清液以无菌PBS以1:1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟,然后以200,000×g进行2小时超速离心。 将颗粒在a中洗涤大量PBS,通过0.2-μm注射器过滤器过滤,并以200,000×g离心1小时,然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。 3、
为了从体液(例如尿液,支气管肺泡灌洗液,血清,血浆,肿瘤腹水)中纯化外泌体,只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子,EDTA抗凝,血清的话不抗凝直接离心。在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天,直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同,但由于某些流体的粘度,必须稀释它们,并增加离心的速度和长度。该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体(Caby等,2005)。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体(例如,血浆:通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴,血清,尿液,细支气管灌洗或肿瘤腹水)磷酸盐缓冲盐水(PBS;附录) 2A)冷冻离心机 50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置(如Steritop,Millipore)超速离心机和固定角度或摆动式转子(见表3.22.1)适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶(见表3.22) 0.1) 注意:所有离心均应在4℃下进行。
1.用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在2,000×g,4℃下离心30分钟。
2.将上清液转移到超速离心管或瓶中,没有颗粒污染(参见基本方案1,步骤3注释)。在12,000×g,4℃下离心45分钟。
3.小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中(根据处理的液体体积,可参见表3.22.1中的管)。在110,000×g,4℃下离心2小时。 4.将沉淀重悬于1ml PBS中,并将其在其中一个管中汇集。用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。
5.通过0.22-μm过滤器过滤悬浮液,并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。
6.在110,000×g,4℃下离心70分钟。倒出上清液。
7.将沉淀重悬于1ml PBS中,然后用PBS填充管。在110,000×g,4℃下离心70分钟。倒出上清液。
8.将沉淀重悬于50至200μlPBS中。在-80℃下储存长达1年。
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