牡丹皮的含量

丹皮酚的含量测定及其分析方法的验证

李超 中药学 2015201225004

摘要：丹皮酚是常用中药牡丹皮、徐长卿、芍药等中药中的主要挥发性成分之一，是衡量牡丹皮、徐长卿等中药材及其组方的多种制剂质量控制的重要指标。为评价丹皮酚药材及其复方制剂的质量，人们对丹皮酚的测定方法进行了许多研究。该文就丹皮酚的含量测定及分析方法进行了评述与探讨。

关键词：丹皮酚；含量测定；分析方法

丹皮酚(paeonol)为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的根皮及萝摩科植物徐长卿Cynanchum paniculatum(Bunge)Kitagawa.的根或全草中的挥发性成分之一。为小分子酚类化合物，白色或微黄色有光泽的针状结晶，化学名称为2-轻基-4-甲氧基苯乙酮（如图1，分子式为C9H10O3；分子量166.18）。气味微辣，极性较低，熔点49℃-51℃，易溶于乙醇和甲醇，溶于乙醚、丙酮、苯、氯仿及二硫化碳中，稍溶于水，不溶于冷水，在热水中可溶解，能随水蒸气挥发[1]。丹皮酚味苦、辛，丹皮酚具有抗心律失常、抗动脉粥样硬化、抗血栓形成、扩张管、降血压、降血糖等，还具有抗炎、抗菌抗病毒及调节免疫功能等作用[2]。

丹皮酚是衡量牡丹皮、徐长卿等中药材及以其组方的多种制剂质量控制的重要指标。2015版药典规定牡丹皮按干燥品计算，含丹皮酚不得少于1.2%，徐长卿按干燥品计算，含丹皮酚不得少于1.3%[3]。为评价含丹皮酚药材及其复方制剂的质量，人们对丹皮酚的测定方法进行了许多研究。本文就丹皮酚的含量测定的分析方法作一概述。

1薄层扫描法

薄层扫描法准确、灵敏，重现性好，专属性强，可作为其质量控制标准。章

睿[4]等以丹皮酚为对照品，建立了牡丹皮药材及其饮片的薄层扫描特征图谱，该方法简便、设备价廉、分析速度快等，易于使用，尤其适合对大批原料药材进行分析。宋飞[5]用硅胶G薄层板以双波长薄层扫描测定六味地黄丸中丹皮酚含量，展开剂为环乙烷:氯仿:无水乙醇(7：3：1),显色剂为5%酸性FeCl3,扫描条件为λs=400nm,λR=700nm,反射法锯齿扫描精密度试验结果平均值为16926.6,RSD=2.8%(n=6)；稳定性实验结果表明在1h内稳定。回收率为93.12%,RSD为3.44%(n=5)。苗方[6]等用此法测定了观赏牡丹中，丹皮酚的含量为1.5mg/g,加样回收率为97.6%,RSD为1.15%。空白干扰试验表明本测定无明显干扰;相关系数R=0.9987表明在其范围呈现良好的线性关系;对照品和供试品斑点在测定时间100min内斑点稳定,峰面积积分值基本不变;精密度试验结果平均值为1.165mg/g,RSD=1.76%(n=6),表明重复性良好;加样回收率试验结果测定的平均回收率为97.60%,RSD为1.15%(n=5)。

2激发荧光扫描法

扫描法多在(274±1)nm处进行扫描测定，供试品溶液的浓度相对较高(0.5mg/mL)，线性范围在1～5μg，对丹皮酚含量低微的样品，扫描法根本无法检出。遇到高效液相法丹皮酚波峰有干扰的情况下，定量测定就更难以进行。为开发丹皮酚不同形式的、高灵敏度测定方法，对丹皮酚进行增荧光后，荧光薄层扫描定量测定研究，获得理想的测定结果，大幅度提高了丹皮酚的检测灵敏度以及方法的重现性和精密度。李晓燕等[7]以激发荧光扫描法测定微量丹皮酚。用硅胶G薄层板，以环己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(8:2:1:0.2)为展开剂，三氯化铝试液为增荧光剂，进行了微量丹皮酚的荧光扫描定量测定研究。结果显示丹皮酚最佳激发波长为292 nm，点样量在0.0402～0.1809μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 7)，同板精密度试验中RSD为1.59%，样品的RSD为0.81%；异板精密度试验中样品的平均含量为25.68 mg/g，RSD为1.31%；仪器精密度试验中照品的RSD为0.59%，样品的RSD为0.09%，表明仪器性能良好。稳定性试验在考察的1.5 h内，对照品的RSD为2.39%，样品的RSD为2.68%。重复性试验中样品丹皮酚的平均含量为25.62 mg/g，RSD%为1.83%，表明方法重复性良好。平均回收率为101.80%,RSD为1.58%(n=9)。此法简便、准确，灵敏度高，适用于微量丹皮酚样品的测定。

3气相色谱法

气相色谱法是一种在有机化学中对易于挥发而不发生分解的化合物进行分离与分析的色谱技术，所以非常适合对牡丹皮中丹皮酚进行详细的分析[8]。刘向红[9]以气相色谱法测定丹皮酚原料及片剂的含量。采用GC内标法,色谱柱为3.2 mm×210mm玻璃柱,固定相为聚乙二醇(PEG)-20000,;精密度试验结果表明方法精密度良好,RSD为0.64%(n=6)。平均回收率为99.9%，RSD=1.5%(n=9)；重复性试验结果表明方法重复性好，原料和片剂的RSD分别为0.81%(n=6)和1.34%(n=6)；溶液稳定性试验表明原料、片剂供试溶液在48 h内均稳定，原料和片剂的RSD分别为0.96%和1.24%(n=7)。本方法简便、准确、快速,可作为丹皮酚原料及片剂含量的测定方法。石向群等[10]以气相色谱法测定桂枝茯苓胶囊中丹皮酚的含量。色谱柱为DB-624(0.53mmx30mx3N,m)，按外标法测定丹皮酚的含量，结果表明丹皮酚在20～200μg/mL浓度范围内与峰面积线性关系良好（R=0.9996），方法精密度试验ＲSD%为1.00。计算样品丹皮酚平均含量为7.80 mg/g，RSD为1.29%。平均加标回收率为108.70%,RSD%为1.38(n=3)。 4高效液相色谱法

刘雯等[11]建立了测定原料中月皮酚含量的高效液相色谱方法。采用Agilent ODS C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱，以纯水-甲醇(体积比为27:73)为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温35℃,检测波长274 nm。当流动相体积比为27∶73时，丹皮酚的保留时间约为4.927 min周围没有干扰且峰形良好。R=0.9999表明丹皮酚在0.02020 mg/mL范围内线性关系良好，即峰而积与进样量有良好的线性关系。根据信噪比S/N=3，测得丹皮酚的检出限为0.6 mg/L。精密度实验RSD为0.40%(n=6)，所测样品的精密度相对标准偏差较小，仪器精密度良好。结果表明，重复测定结果的相对标准偏差为0.4%，回收率在95%～105%范围内。该方法的灵敏度高，准确性和重现性良好，有效消除了样品中其他组分对目标峰的干扰，线性范围宽，分离度好，可用来准确分析原料中月皮酚的含量。冷英梅等[12]建立采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定不同产地牡丹皮中丹皮酚的含量方法采用Hypersil ODS2 C18色谱柱，以甲醇-水(45:55)为流动相，检测波长为274nm结果丹皮酚在0.0046～9.200μg/L范围内呈现良好的线性关系。精密度实验表明精密度良好，RSD为1.46%(n=6)；稳定性实验表明供试品溶液

中丹皮酚在12h内基本稳定，RSD为0.96%(n=6)；重复性实验表明此方法测定丹皮酚的含量，重现性良好，RSD为1.25%(n=6)。平均回收率为99.3%,RSD为2.16%(n=6)。本法简便、快捷、重复性好，可用于不同产地牡丹皮药材中丹皮酚的含量测定回收率符合相关规定。兰保强等[13]采用HPLC法测定丹皮酚缓释片中丹皮酚的含量。方法色谱柱为Shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6mm,5μm），流动相为甲醇-水(70:30)，流速1.0 mL/min，检测波长274 nm。结果丹皮酚0.084～0.840μg与峰面积的线性关系良好R=0.9999；精密度表明方法的精密度良好，RSD=0.24%(n=6)；重复性试验计算得丹皮酚含量的平均值为404.81mg/g，RSD=1.38%(n=6)。计算得丹皮酚峰面积的RSD=0.31%(n=8)，供试品溶液在24 h内稳定；平均回收率为99.20%,SD=1.60%（n=6）。结论所用方法操作简单、结果可靠、重复性好，可较好地控制丹皮酚缓释片的质量。宋钦兰等[14]采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18柱，流动相为甲醇-水(43:57,V/V)，流速为1.0 ml/min，检测波长为274 nm，柱温为25℃，进样量为10μL。丹皮酚进样量在0.09304-0.4652μg，R=0.9999)范围内与峰面积线性关系良好;精密度RSD=0.38%(n=6)表明仪器精密度良好;重复性实验中丹皮酚含量平均值为0.150 mg/g,RSD=1.56%(n=6)，表明本方法重复性良好；稳定性试验中丹皮酚峰面积RSD=1.08%(n=6)，表明供试品溶液在12h内稳定;平均加样回收率为98.33%,RSD=0.81%(n=6)。该方法简便、准确、可靠，可用于糖肾康颗粒中丹皮酚的含量测定。

5高效液相色谱–紫外分光光度联用法

闫一夫[15]等将色谱–光谱仪联用(HPLC–UV)法与斜投影法结合，建立了丹皮酚含量快速分析方法。通过色谱-光谱联用采集丹皮酚结晶母液的紫外多波长光谱三维数据，构建不含丹皮酚的背景数据库以及丹皮酚光谱数据库，基于斜投影法步骤测定了批量样本中丹皮酚含量。该方法计算结果和高效液相色谱分析结果接近，相对误差小于5.0%。测定结果的相对标准偏差为0.4%～1.0%(n=5)，回收率为98.8%～101.3%。该方法快速、准确，操作简单，可为丹皮酚结晶产品及各种制剂质量控制提供可行方案。相对误差小于5.0%，说明该方法的准确度较高。测定结果的相对标准偏差为0.4%～1.0%，说明该方法具有良好的精密度。

6 紫外分光光度法

高锦红[16]采用紫外分光光度法对牡丹皮中丹皮酚进行测定。取对照品溶液，以无水乙醇作空白对照，在200～500 nm范围内进行紫外可见光扫描。丹皮酚在274nm处有最大吸收峰。线性关系考察R＝09999；精密度试验结果，吸光度平均值为0.662，RSD为0.19％（n=6）；样品含量测定,平均检出量6.142μg/mL,丹皮酚含量38.39mg/g。重现性结果RSD为0.32％（n=6），表明该方法重现性良好。稳定性结果的RSD为0.18%（n=6），样品在lOh内保持稳定；回收率的平均值为101.4％，RSD为0.75％（n=6），表明该方法的回收率较好，达到了测定要求，可用于牡丹皮中丹皮酚含量的检测。杨名宇等[17]为考察牡丹皮药材和饮片的有效期，以丹皮酚为检侧指标，采用紫外分光光度法，以274 nm为侧定波长。结果丹皮酚在2.4-12.0μg/mL浓度范围内呈现良好线性关系，得回归方程，R=0.9999；重复性RSD为0.12%(n=5)与稳定性实验RSD=0.32%(n=5),A基本无变化。平均回收率为99.94%,RSD为0.12%(n=5)。我们还可以通过紫外分光光度法对不同生长年限、不同采收期丹皮中丹皮酚含量，揭示丹皮中丹皮酚的积累规律，提示丹皮的最佳采收期[18-19]。

7 近红外光谱

丹皮酚含量的近红外定量分析模型建成之后，可简便、快速、无污染地测定丹皮酚的含量，结果准确可靠。该技术适用于杞菊地黄丸生产、流通等对检测结果要求时效性较强的各个环节，为其质量评价提供一种新的检测方法。白雁等[20]利用近红外光谱技术为杞菊地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚含量，以杞菊地黄丸中丹皮酚含量的HPLC分析作为参照，结合最小二乘法(PLS)建立丹皮酚含量的定量分析模型。结果所建模型的相关系数(R)、外部验证均方差(RMSEP)和内部交叉验证均方差(RMSELV)分别为0.98089,0.06170和0.19403;验证集样品的NIR测定与药典法侧定的进行配对T检验，差异无统计学意义。所以近红外光谱法可用于杞菊地黄丸中丹皮酚含量的快速侧定。AOTF-NIR技术用于浓缩六味地黄丸浓缩液比重及丹皮酚含量分析，具有快速、直接、多成分同时测定，并能实现现场在线分析的特点。胡浩武等[21]在线收集浓缩六味地黄丸浓缩液样品，建立其含量、比重数据库，同时采集近红外光谱图谱，用偏最小二乘(PLSl)法分别建立NIR光谱与含量、密度数据之间的校正模型，并对在线过程中收集的预测集样品进行含量预测来验证所建模型。结果浓缩液NIR光谱与含量、比重数据之间的校正模型相关

系系数R分别为0.9945,0.9967和0.9522,外部样品预测相对偏差分别为0.26%,5.39%和10.44%;该方法精密度、稳定性均小于2.0%，预测回收率分别为99.9%,100.2%,92.8%。 8 荧光增敏法

梁慧婷等[22]建立测定咽炎片中丹皮酚含量的荧光分析法。方法基于AlCl3试剂对于丹皮酚具有荧光增敏作用，在pH7.0的磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲体系中，于最大发射波长λem=455 nm处(最大激发波长λ=295nm)下检测丹皮酚的含量。结果丹皮酚的浓度在1.3×10-4～7.3×110-4μg/ml内与荧光强度增大值ΔF呈线性关系良好(R=0.999)，检出限为0.8×110-4μg/ml，室温下荧光强度在10 h内基本恒定。回收率为95.4%～97.8%，相对标准偏差小于2.53%。荧光增敏确可靠，可应用于咽炎片中丹皮酚含量的测定。 9 电化学方法

郑艳洁等[23]应用交流阻抗法和循环伏安法表征聚苏丹红Ⅲ/GC电极，并研究丹皮酚在该聚合物电极上的电化学行为.实验表明，聚苏丹红Ⅲ/GC电极对丹皮酚具有良好的电催化作用，丹皮酚氧化峰电流(Ipa，μA)与浓度(C,μmol/L)在0.3-22.0μmol/L范围内呈良好的线性关系R=0.9994，检测限为5.0×10-8 mol/L，与在GC电极的响应相比，其灵敏度提高了1个数量级。电极稳定性及重现性良好，干扰实验表明上述共存物均不干扰测量.由此可见聚苏丹Ⅲ/GC电极抗干扰能力强，对丹皮酚的测定有较好的选择性。冯芸等[24]运用循环伏安法(CV)、计时电流法(CA)、方波伏安法(SWV)及电化学交流阻抗(EIS)等电化学方法，研究丹皮酚在十二烷基苯磺酸钠(SDBS)现场自组装膜与离子液体N-丁基毗陡六氟磷酸盐复合修饰碳糊电极上的电化学性质及电分析方法，测定了丹皮酚在该电极上的电极反应动力学参数。用SWV法测得PN的氧化峰电流与其浓度在5.0×10-3.8×10 mol/L范围内呈良好线性关系，检测限(S/N=3)为2.0×10mol/L，电极重现性实验中RSD为2.900%(n=10)，稳定性实验中其RSD为3.000%(n=10)，表明本法具有良好的重现性和稳定性。对模拟样品中丹皮酚含量进行了电化学定量测定，RSD为0.2%-2.1%(n=10)，加标回收率为99.2%～101.3%。表明十二烷基苯磺酸钠现场自组装膜与离子液体复合修饰碳糊电极对丹皮酚电化学氧化具有良好的促进作用，该研究结果可用于丹皮酚片样品中丹皮酚含量的定量测定。

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张叶等[24]利用丹皮酚在超微电极上的电化学行为，建立六味地黄丸中丹皮酚含量监控方法。使用超微电极、快速方波伏安扫描（SWV)技术进行电化学检测。结果可获得丹皮酚的重现性良好的氧化峰，该峰电流与丹皮酚的浓度在1×10-3～5×10-7mol/L范围内成呈良好的线性关系，R=0.9993，检出限为1×10-7mol/L。重现性实验RSD为0.31%（n=5）重现性很好。稳定性实验在12 h内测得的峰电流及峰位置无明显差异，稳定性很好加样回收率实验，平均回收率100.7%，RSD=2.2%（n=5）。样品含量检测获得的样品含量为0.321%，RSD为1.28%（n=5）。 10 讨论

目前除了以上方法外，文献中还常看到的测量方法很多。由于这些方法都有各自的优缺点，因此使用时应根据情况使用。考虑到大部复方制剂中药味较多，有效成分以及构成复杂，多数情况下还是选择高效液相或者气象色谱做定量分析 比较理想，同时操作简单、迅速，结果也较为理想。采用现代科学技术手段对以前的测定方案改革，不断提高测定含量的技术的思路是正确的。如何才能真正控制中成药的质量是一个复杂的问题，有待我们进一步研究。

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