PCR技术培训教材

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PCR基础理论

一、半保留复制及转录、逆转录

(1)DNA的半保留复制(semiconservative replication)

DNA是所有原核生物和真核生物遗传的主要物质基础。在这些生物中遗传信息以遗传密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过DNA复制(replication)由亲代传给子代。在DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每一条链为模板，在DNA指导下的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制(图1)。

(2)RNA的转录（transcription）过程

以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription）。转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息由DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polynerase ,DDRP）。转录产生初级转录物为RNA前体（RNA precursor），它们必须经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。

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RNA的转录合成从化学角度来讲类似于DNA的复制，多核苷酸链的合成都是以5’→3’的方向，在3’-OH末端与加入的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的目的不同，转录又具有其特点：（1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制；（2）转录是不对称的。（3）转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的。

转录的主要过程分为识别与起始、延长和终止三个阶段。 (3)RNA的逆转录（reverse transcription）过程 以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序(其中U与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为逆转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做逆转录酶(reverse transcriptase)。

大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性。反转录酶的发现对于基因工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。

二、PCR技术的基本原理与PCR技术的特点

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。PCR技术是由Kary B Mullis于1985年联合创造的。该技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品。

PCR技术的基本原理

其原理类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。

①模板DNA的变性

模板DNA经加热至93℃左右一段时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸

DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性－退火－延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链‖,这种新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需2－4分钟，2－3个小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。

PCR反应五要素

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

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PCR反应条件

PCR反应条件为温度、时间和循环次数，温度、时间和循环次数的设置对PCR的成功与否至关重要。

1、温度与时间的设置

基于PCR原理三步骤而设置变性－退火－延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp）可采用二温度点法，除变性温度外，退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。

① 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

② 退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

③ 延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

④ 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

PCR反应特点 特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒

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的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 三、PCR仪：

随着分子生物学的创立与发展，PCR测定方法作为一门崭新的技术已经在遗传疾病的诊断、临床标本中病原体核酸的检测、激活癌基因中突变情况的分析、法医学上的遗传学鉴定以及分子克隆诸方面得以越来越广泛的应用。实现这项技术的工具――PCR扩增仪也应运而生。

PCR扩增仪是整个PCR实验关键的仪器，它性能的好坏决定着实验结果的准确性。而仪器的恒温和变温的性能是决定基因片段完成变性、退火、延伸的最重要的参数。目前国内用户使用的PCR扩增仪品牌很多，原理和样本载量也不尽相同。下面测重给大家从恒温和变温两方面介绍各类扩增仪的原理：

1．梯度水浴法：这种方法一般是水浴槽加上机械臂结构。仪器上设有3个不同温度的水浴槽，通过机械臂携带样品管在这3个槽中浸泡，完成变性、退火、延伸3个过程。其优点是温度变化快，时间准确，温度可调，省时省力，价格较低。缺点是以室温温度为下限，不能实施复杂的操作过程。

2．空气驱动循环恒温装置：本系统用空气作为热传导媒介。外壳采用商品化的家用对流恒温器(烘箱)的外壳，热源包括两部分：强热气由热空气枪来提供，大功率风扇为制冷提供外部空气，或由冷室或更复杂设备产生冷空气。这种装置的优点是不用金属的精密加工，可使成本降低。整个系统不采用制冷液，安全程度高。同时以测定管内温度为控温依据，显示温度真实可靠。缺点是受环境温度影响大，各管的均一性需要严密的设计才能得以保证。

3．变温金属块作恒温装置：此类扩增仪中心是一个热块，上面均匀分布48或96孔，放专用的样品管，内壁加工精密，保证和反应管紧密接触。热块由其下部的电阻丝加热升温，并由微机控制恒温。冷却采用压缩机制冷，可快速制冷，温度变化速率大于1℃/秒。该系统用微机控制，扩增周期的循环条件可选择或编辑，程序可储存。该系统如有加热盖，样品管中则无需加入矿物油。

国内常见的PCR扩增仪：

由于各种PCR扩增仪的原理不同，其发热、制冷机制的方式都不尽相同。国外产品的特点是产品的质量和性能比较稳定。缺点是价格高，且维修麻烦。而国内仪器的性价比较高，售后服务快捷及时。

1、 9600型DNA扩增仪：(美国应用生物系统公司产品) 最大样本数：96孔。 温度范围：4℃－99℃。

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加热冷却速度：平均为1℃/秒。

温度精度：35℃－100℃间误差小于0.75℃。

特点：具有加热盖，可防止样品蒸发，可扩增微量至5ul的反应体积，记忆容量为150个用户文件。

2、 PTC-200热循环仪：（美国MJ Research公司产品） (1)最大样本数：96孔。

(2)温度范围：-5℃－105℃。

(3)加热冷却速度：平均为3.5℃/秒。

(4)温度精度：35℃－100℃间误差小于0.3℃。

(5)特点：采用可调压力和高度加热盖，样品管内无需加石蜡油，三种温控选择：模块、样本内参或电脑模拟计算。

3、 GeneStar9625扩增仪:(厦门安普利生物有限公司产品) (1)最大样本数：96孔。 (2)温度范围：4℃－100℃。

(3)加热冷却速度：平均为2℃/秒。

(4)温度精度：35℃－100℃间误差小于0.1℃。

(5)特点：具有加热盖，可防止样品蒸发，样品管内无需加石蜡油，全自动门，本机使用全自动智能化门，开始扩增时机门自动关闭，结束后机门自动打开，安全可靠。本机控制软件，充分考虑到PCR技术的最新进展的需要，允许用户对扩增各步条件任意修改，实现诸如Touch Down功能等。

目前国内比较流行的实时荧光定量PCR仪则是在PCR扩增仪的基础上加入了荧光检测系统，并由微机进行实时监控，使扩增检测一体化，我们将在后面为大家详细介绍PCR实时荧光定量技术。 四、PCR产物分析：

PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

① 凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小，这是起码条件。本方法包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

②酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

③ 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。

④ Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。

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⑤ 斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

⑥ 核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

⑦PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

⑧荧光定量PCR法：

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

(1)荧光探针技术：在PCR扩增原理的基础上，根据扩增对象的序列，结合两侧引物的特征，在两条引物之间设计一条与扩增对象能特异性识别的荧光探针。探针采用双荧光标记技术，其5′端标记有报告基团(Reporter, R)，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)。当探针完整的条件下会产生荧光能量转移现象，即受激产生的荧光能量会被淬灭基团完全吸收，表现为报告基因受激后不能产生荧光的现象。而若PCR扩增过程中有特异性靶基因存在，荧光探针在退火过程中与目的基因特异性结合，PCR延伸过程中，当引物延伸到探针位置时，Tag酶便以其5′端的外切酶的活性将探针酶解，从而使5′端的报告基团脱离3′端的淬灭基团的抑制，恢复了荧光特性，在无须打开扩增管的情况下，通过适当的设备检测扩增后的荧光。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。

(2)SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 五、PCR应用注意事项：

PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展PCR研究应用工作。PCR技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上马，但毕竟PCR技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，甚至会得到与事实完成相反的结果。

1、 假阳性扩增:

在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源。

⑴ 试剂污染：

检测方法，可按试剂盒使用说明书将试剂分装好，直接置于PCR仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水），便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。

⑵ 实验室污染：

这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列

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扩增到数百万倍以上，扩增产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。

判断方法：可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当然，所用移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。

解决方法：实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。扩增前处理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应严格地分开，不可互换。PCR室应保持良好的通风、清洁、最好能专用。

⑶ 采样污染：

在实验过程中，有时会出现一批结果阳性率很高，一批结果阳性率又下降很多，如此反复，这种现象主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。PCR扩增非常敏感，而一般实验室对重复使用的试管所进行的洗涤方法往往不能去除痕量DNA，这些痕量DNA便成为PCR模板，出现阳性扩增结果，由于采样试管受污染程度不一，所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用一次试管及吸咀取样。

2、 假阴性扩增：

如果连续几次扩增结果都是阴性，或已知阳性样本出现阴性扩增结果，一般认为这是假阴性，出现这现象有以下几种原因：

⑴ 仪器故障： 出现全阴结果，首先考虑到仪器运转是否正常。仪器运转是否正常是PCR扩增最关键的步聚之一。判断仪器是否正常，首先要测定加热体的温度是否准确，波动范围是否符合要求，各孔之间差异是否符合要求，PCR扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度，如果误差太大，势必出现假阴性。

⑵ 试剂失效或无效： 确定所用仪器是正常的，便可对试剂进行检测。首先要了解试剂是否超过有效期，试存放方法是否达到要求，如果试剂盒在有效期内，贮存方法是正确，那么就应该仔细、慎重地判断试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。可以用已知阳性样本，或试剂盒提供的阳性对照，严格按说明书操作扩增一次，然后把扩增产物用双蒸水稀释1000倍，作为模板进行第二次扩增，判断结果，如果是阴性说明试剂无效或不合格，如果结果阳性那么可用以下方法判定试剂的灵敏度。

⑶试剂的灵敏度：

有时试剂检测的阳性率偏低，所谓阳性率偏率就是指出现假阴性结果，这种现象往往与以下三种因素有关：①试剂质量不过关；②操作方法不规范；③主观判断标准不科学。对于试剂质量及操作是否正确这两点是比较容易检查并合理改进。对试剂敏感度的评价标准应该使用下述方法科学地评价，首先选择标准样本如HBV全序列质粒，标准阳性血清，结核菌菌体等用合适的介质如血清、痰液等进行有限稀释按1：10、1：100、1：1000、1：10000如此逐步提高稀释度价其试剂的敏感度，一般认为如果标准

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阳性乙肝的血清用正常血清稀释10000倍以上，结核菌每毫升中在100个左右仍能测出阳性结果时，试剂的敏感度是足够的，判断试剂的灵敏度是足够的，判断试剂的灵敏度后仍需判断试剂的检测覆盖，因为病原微生物有不同的型或变异株，合格的试剂不应漏检。最后还要判断试剂盒的异性，一般的实验室可以用不同病原体的样本按说明书操作来判断其对其它病原体扩增时是否也有阳性出现，其特异可达到怎样的精度，经过以上三个方面的研究便可以科学地判断试剂的质量。

3、 扩增产物拖尾:

有时扩增产物电泳后出现一个个荧光团（Smear现象）或出现一连串的条带，这些种现象主要与以下几种因素有关：

⑴ 扩增系统不完善：

这种现象表明出现非特异性扩增，而产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、引物浓度、DNTP浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。另外也可以适当提高退火温度，从而提高扩增特异性。

⑵ 模板处理方法不完善：

PCR扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的，如对PCR主要成分之一DNA聚合酶的影响因素很多，这些因子是怎样作用于聚合酶，其作用机制至今仍不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能导致非特异扩增。一般分泌物样本，应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。

⑶ 引物设计不合理：

引物与基因组之间的同源性是产生非特异性扩增的最主要原因，而我们一般在设计引物时往往只了解其基因组中的某一段序列，因此我们必须充分利用资料巧妙地设计出一组合理的引物，并通过反复比较、证实，最后才能确定其能否用于检测。

⑷ 产物电泳单萤光带及多萤光带

一般PCR扩增后，对扩增结果的判断最简单的方法是琼脂糖电泳，溴乙淀染色，在320nm的紫外激发观察其萤光条带，如果有明显和特异性扩增产物，就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光亮带，按标准扩增系统配制的反应液，其引物浓度在0.1－0.5mM，一般经30个循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在，因此在电泳平板就有一条20BP左右（电泳速度较快）的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳结果就有两条荥光带，一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。

病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的基因作为引物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生严重畸变，也包括其遗传物质的变化，出现染色体的缺失、不等位交换、其它序列的插入等。如果这些缺失与不等位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上，也会出现不同长度的扩增产物，从而产生多条扩增产物带。

PCR基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践过程中时常现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的现象。诚然，近年来在大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验，使这一技术日趋完善，毕竟PCR是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今仍然不能得到很好地解

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释或解决。想信随着对PCR的深入研究，在PCR的应用过程中不断总结经验，PCR这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献。 六、PCR模板制备

核酸模板是PCR扩增最重要的成份之一，PCR扩增技术对其模板DNA(RNA)的质量及数量要求不高，常规分子生物学方法对DNA及RNA的制备与纯化都足以达到要求。在目前临床PCR工作实践中样本大都有一个共同的特点就是微量，因此结合这一实际情况，及PCR扩增系统的特性，我们简单介绍几种临床常见标本的简化处理方法，可以在保证结果的前提下，省去许多繁琐的操作，相当实用。

一、白细胞（WBC）： 对巨细胞病毒（HCMV），免疫缺陷病毒（HIV），等病原微生物的检测，常需提取白细胞中病毒的模板，其处理方法如下：

⑴ 取200UL含50UL5％EDTA的抗凝血于0.5ml离心管中，1万转/分离心1分钟去上清。

⑵ 沉淀加入500UL 25mM TrisPH7.6、0.5％ Triton X-100，1.5万转/分离心1分钟去上清，重复本步聚一次。

⑶ 于沉淀中加入50UL样品处理液（厦门安普利生物工程有限公司提供），96℃加热10分钟。

⑷ 1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL进行PCR扩增（扩增终体积为30UL）。 二、血清： 对乙肝（HBV），等病原微生物的检测，需要对血清样本进行处理，提取病原体模板。

⑴ 取100UL血清，加入50UL样品处理液混合。 ⑵ 96℃加热10分钟。

⑶ 1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL进行PCR扩增。 三、痰液：

对结核杆菌（M.TB）等呼吸道感染病原微生物的检测需要取痰液样本。 ⑴ 痰液的液化，取晨起血丝痰或带干酷颗粒的痰样本约1ML，加入等量1N NaOH溶液，充分摇匀室温10-20分钟，若痰液浓稠时，可以适当增加1N NaOH溶液用量并延长时间或37℃水浴20分钟，使痰液充分液化。

⑵ 取中层液化良好的痰液1ml，1.5万转/分离心15分钟，去上清。

⑶ 1ml生理盐水或双蒸水将沉淀吹打混悬，充分摇匀，1.5万转/分离心15分钟，去上清。

⑷ 沉淀加入50UL样品处理液吹打混匀置96℃加热10分钟。 ⑸ 1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL进行PCR扩增。 四、分泌物拭子： 对淋球菌（NG），沙眼衣原体（CT）等病原体进行检测时常需采用分泌拭子，对肺炎支原体、EB病毒等检测时常需采用咽部拭子采样，这些样本处理方法如下：

⑴ 取1ml生理盐水置1.5ml离心管中，充分洗涤分泌物拭子。 ⑵ 摇匀后取中层0.5ml，若分泌物较多只需200UL补加300UL生理盐水，于0.5ml

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离心管中。

⑶ 1.5万转/分离心10分钟，去上清。

⑷ 沉淀加入50UL样品处理液吹打混悬，96℃加热10分钟。 ⑸ 1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL进行PCR扩增。 五、尿液、胸腹水、脑脊液沉淀等：

取样本1-1.5 ml于1.5ml离心管，1.5万转/分离心10分钟去上清，如果是检测结核杆菌，可将沉淀用1ml0.5N NaOH混悬室温静置10分钟，再进行洗涤，如果是淋球菌等样本可直接于沉淀中加入生理盐水1ml，充分摇匀，1.5万转/分离心10分钟去上清，重复洗涤一次，沉淀用50UL样品提取液吹打混匀，96℃加热10分钟，1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL扩增。

六、RNA模板的制备

对于RNA病毒如丙肝病毒、柯萨奇病毒、流行性出血热病毒的检测，就必须制备病毒RNA模板，进行逆转录合成cDNA，然后进行PCR扩增。由于自然界存在大量的RNA酶，而对RNA酶的灭活又比较困难，所以能否避免RNA的污染是RNA模板成功制备的关键。

1、 酚氯方法：

① 取待测血清50UL加入100UL裂解液（厦门安普利生物工程有限公司提供），混匀后室温静置20分钟。

② 加入150UL酚：氯仿：异戍醇（50：49：1），混匀置室温10分钟，1.5万转/分离心15分钟。

③ 取水相50-100UL，加入等量异丙醇。

④ -20℃放置30分钟，1.5万转/分离心10分钟。 ⑤ 沉淀用预冷至-20℃的75％乙醇洗涤二次。 ⑥ 沉淀于50℃烘箱内干燥后即可扩增。 2、固相吸附分离法：

首先在乳胶颗粒或活化石英颗粒上接一个与欲提取的RNA互补的特异性探针（约50BP），利用它模板RNA杂交的原理使模板吸咐在固相颗粒上，从而达到分离提取的目的。

① 取待测血清50UL，加入裂解液100UL混匀，再加入适量带有探针的乳颗粒室温静置20-30分钟。

② 1万转/分离心1分钟，去上清。

③ 沉淀用预冷到至-20℃的75％乙醇洗涤二次。 ④ 沉淀于50℃烘箱内干燥后即可扩增。

PCR模板制备方法还有许多，到目前为止仍然没有任何一种方法能适用处理多种样本模板，只能在实际工作中不断积累经验，对现有方法进行改进，以期能更适合实验要求，以上所述的方法仅供参考。

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实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

荧光定量PCR技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。

根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。

1、 为什么终点定量不准确？

我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大。

传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。

对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷贝数，经过PCR扩增以后的DNA拷贝数已经不能反映真实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据CT值确定DNA起始拷贝的数量。

2、 为什么CT值与起始模板拷贝数成线性关系？

CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点

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所对应的循环次数。从图1的重复实验中可以直观地看到，尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。如果用不同浓度的DNA作PCR，可以看出DNA浓度越高，CT值越小。DNA浓度每增加1倍，CT值减小1个循环。CT值与模板DNA的起始拷贝数成反比。

这一结论可以从数学上严格证明。为使表达式简便，以下推导忽略PCR效率等细节。如果考虑这些因素，可以在方程上增加修正项。这些修正项的增加并不改变方程的线性性质。

一般地，我们有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是说第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB) 加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS) 与分子数目的乘积。当循环次数n = CT时，则有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。两边取对数，得log(RT -RB) = logX0 + CTlog(1+ Ex) + logRs。整理此式，CTlog(1+ Ex) = - logX0 + log(RT -RB) – logRs。

所以对于每一个特定的PCR反应来说，EX、RT、RB和RS都是常数，所以CT值与log X0成反比，也就是说，CT值与起始模板拷贝数(X0)的对数成反比，起始DNA浓度每增加1倍，CT值减小1个循环。根据CT值的定量是精确和严格的，而传统的终点定量则比较粗放。

如果读者有兴趣的话，也可以假设PCR的效率(即Ex)为100%，从上式推算出定量PCR标准曲线的最佳斜率和CT值的最佳范围。 3、 怎样确定CT值？

实验操作中，CT值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的PCR循环次数（图2）。―基线上方‖也就是阈值高度的量化定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。阈值所在的横线与PCR扩增曲线的交点所指的PCR循环次数就是CT值。基线范围的定义是从第3个循环起到CT值前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般取第3到第15个循环之间。早于3个循环时，荧光信号很弱，扣除背景后的校正信号往往波动比较大，不是真正的基线高度；而在CT值前3个循环之内，大多数情况下荧光信号已经开始增强，超过了基线高度，都不宜当作基线来处理。

显然，CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。

4、 荧光信号和定量数据的归一化

虽然大多数定量PCR仪都会自动扣除本底，但是仍然需要注意荧光信号强度和定量数据的归一化校正，以便不同样本之间的实验数据可以严格地相互比较。由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等偶然误差不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这些因素对定量结果的影响。这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实现，一般采用红色ROX荧光，称为阳性参比信号。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关。目标基因和对照基因的信号除以

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阳性参比信号以后，即Rn = R / RROX，就可以在同样的起点上进行比较和各种计算。ROX校正可以提高定量数据的精度和重现性，减少孔间差异。

归一后的荧光信号再扣除本底，就得到DRn：DRn = Rn,样本 - Rn,空白。DRn是最后构建PCR实时扩增曲线的纵坐标。

无论绝对定量还是相对定量，在得到实验结果后，还要考虑数据之间的可比性问题。在实验操作中，取样都是以体积或重量为单位的，但是同样体积或重量的样本所来源的细胞数目并不一样，所以拷贝/μL或拷贝/ng的定量数据相互之间实际上并不可比。只有将这些数据归一到以拷贝/细胞或拷贝/基因组为单位后，才可进行严格意义上的比较。

这种校正可以通过适当的参比来完成。参比一般选用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量。校正方法为：[DNA]样本 / [DNA]IPC，或者DCT = CT, 样本 - CT, IPC。因为CT值与起始DNA拷贝数的对数是反比关系，可以证明，这两种计算方法在数学上是等价的。

为了减少误差，目标基因和参比基因最好在同一反应管内同时进行定量测定，所以这种对照称为阳性内对照(Internal Positive Control，IPC)。要进行IPC归一化校正，定量PCR仪必须具备多色检测能力，最好是4色。否则，目标基因和参比基因只能分两管作定量，就不成其为―内‖标了。 5、 标准曲线、重复实验和阴性、阳性对照

定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小。所以定量实验的每个样本至少要重复3次以上，严格的定量更应当重复6～8次，以满足小样本统计的要求。

如果作绝对定量，则标准曲线需要在5个点以上。标准曲线使用的标准品是浓度已知的DNA样本，可以自己制备，也可以购买商品化的试剂盒。其PCR反应条件应当与未知样本的一致，以便在同一反应板上同时定量。

阴性对照中不加模板DNA，而以水或缓冲液代替，用于检验是否存在PCR污染。阳性对照则用于检验PCR试剂和实验操作上可能出现的问题。如果实验中设立了IPC，则IPC既可以用来校正数据，也可以起到阳性对照的作用。 一、 荧光PCR原理

1、SYBR Green I荧光染料技术原理

SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料（图6）。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引

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物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。

2、TaqMan技术

TaqMan技术是PE公司开发的，目前已开始应用于基因检测。该技术的基本原理见图1。它利用了Taq酶的5’外切酶活性，合成一个能与PCR产物杂交的探针，该探针的5’端标记一个荧光分子，3’标记另一个荧光分子。其中3’端荧光分子能够吸收5’端荧光分子发出的荧光，因此正常情况下该探针检测不到的5’端荧光分子发出的荧光，只能检测到3’端荧光分子的荧光信号，但当溶液中有PCR产物（模板）时，该探针与模板结合，激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。其主要不足是： （1）采用荧光淬灭及双末端标记技术，因此淬灭难以彻底，本低较高； （2）采用酶外切活性，因此定量时受酶性能影响；

（3）探针标记成本较高，不便普及应用。TaqMan技术在HCV病人血清HCV RNA定量分析及基因遗传突变分析等领域有广泛应用。

图1.TaqMan探针的原理 R：报告基因；Q：淬灭基因

3、Amplisensor技术

Amplisensor也是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一淬灭物。两探针长度不同，其中一种探针5’端多出7个碱基（GCGTCCC）。PCR扩增前需将此探针与PCR引物连接，PCR引物的5’末端应有一端与长探针互补的序列，以便连接酶将引物与探针连接。扩增时该探针一引物复合物中的代引物部分作为半套式引物参入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏了FRET，而产生荧光。荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法的主要特点；

（1）由于采用了半套式PCR扩增可提高灵敏度，但无法区分因引物二聚体形成产生的非特异扩增信号，这样定量准确度受影响；

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（2）每次PCR反应前，要先进行Amplisensor的标记，增加了操作步骤和检测成本；（3）中间需要加入半套式引物，增加污染机会。

后来有人对上述方法进行了改进，将合成时将荧光探针的3’末端。这种改进虽然省去了PCR扩增前的连接步骤，但仍无克服非引物二聚体等非特异扩增信号对定量结果产生的影响。

图2.Amplisensor引物荧光定量PCR的原理

R：报告基团； Q：淬灭基团

4、Molecular beacon技术

分子信标技术也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与TaqMan探针不同的是，该探针5’和3’末端自身可形成—8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构即FRET，于是溶液便产生荧光，荧光的强度与溶液中探针的量成正比，因此可用于PCR定量分析，该方法的特点是采用非荧光染料作为淬灭分子，因此荧光合成时标记较复杂。分子信标技术结合不同荧光标记可用于基因多突变位点同时分析，如结核杆菌耐药基因rpoB的耐药分析。

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图3.分子信标杂交定量的原理 R：报告基团：Q：淬灭基团

后来，Nazarenko等基于MB的原理，使用了一种发卡引物式引物（Sunrise primer）,这一方法的特点是所有的扩增产物均能标记上荧光分子，因此荧光信号响反快，但无法共分特异和非特异扩增是其致命的不足。

图4 发卡引物PCR荧光定量原理 R：报告基团； Q：淬灭基团

最近 Whitcombe等上述方法进行了改进，发明了一种称之为蝎状引物（scorpion

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primer）的荧光定量PCR技术，该技术在引物与MB探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至MB分子，这样非特异扩增产物便无荧光信号，但当有特异扩增产物时MB即可与扩增产物进行分子内杂交，产生荧光信号。既解决了非特异问题，又保留了其响应快的特点。但是仍存在杂交时探针不能完与模板匹配及合成复杂的问题。该方法已成功地就髟于k-ras及BRAC2基因的突变分析[ ]

图5.蝎状引物PCR荧光定量原理

R：报告基团； Q：淬灭基团； S：间隔臂

5、Lightcycler技术

LightCycler是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术，该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针，发光探针的5’端连接荧光分子；淬灭探针的3’端连接荧光分子。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬来分子便紧密相邻，从而发生FRET而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上因此影响扩增效率，此外由于需要合成两个较长的探针，因此合成成本相对较高。

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图6.LightCycler探针荧光定量PCR原理

R：报告基团： Q：淬灭基团

二、内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：

在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。 2）竞争法：

选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。 3）PCR－ELISA法：

利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的〔6〕

。

2．内标在传统定量中的作用

由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

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图4. 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图

终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性

三．内标对荧光定量PCR的影响 1．实时荧光定量PCR无需内标

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： 1）Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（见图4） 2）Ct值与起始模板的线性关系

由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。 2．内标对实时荧光定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方。

Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。

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综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

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PCR技术在临床上的应用

随着分子医学及分子生物学的发展，在生物医学实验室诊断领域，发生了飞跃的变化，至此，自第一代的细胞形态学检验技术之后，发展到50年代生化指标作临床诊断疾病的依据，到60年代抗原抗体酶标记技术的迅猛发展形成了第三代免疫学诊断技术，到80年代初期基因重组技术的应用形成了第四代基因诊断技术。

在现代医学对疾病的诊断中，各种诊断技术密切配合，有机的结合在一起，构成了现代生物医学领域中最活跃的学科——临床实验诊断学的有机整体，为人类的健康发挥其重要作用。

从病原微生物检测角度看，PCR检验的应用以长程培养或无法分离培养者为优先考虑，如TB、衣原体、HPV、HBV 、HCV和军团菌。从遗传学考虑，则以有明确基因突变而引起疾病者适于此项检测。从肿瘤诊疗考虑可以研究发病机制及治疗中耐药问题。下面主要从传染病、性病、优生优育、遗传病、肿瘤五个方面举例PCR在临床检验中的应用。

PCR技术在传染性疾病方面的应用

乙型肝炎病毒 (HBV)

我国是乙肝高发区，乙肝病人占世界乙肝病人总数的50%，乙型肝炎对我国危害很大；乙型肝炎的病因学诊断和治疗效果的判定一直是医生和病人所关心的问题，目前乙型肝炎的实验室辅助诊断主要有：

1) 肝功能检测

主要依据谷丙转氨酶、谷草转氨酶是否异常，白球蛋白比例、总蛋白等指标判断患者的肝功情况， 2) 乙肝两对半

通过酶联免疫法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，依据阳性与否判断患者乙型肝炎病毒感染及传染性，常与肝功能检测进行综合评价。 3) PCR检测

PCR检测的是乙肝病毒DNA，是一种病因学诊断 ，它的优势表现在

（1）早期诊断 接种0.04μl的感染血液就足以导致传染，这么微量的病毒是

一般方法无法检测到的（酶免能测到0.1ng，核酸杂交能测到0.1pg，PCR能测到0.1fg）。PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病人血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。 （2）低复制持续感染乙肝病人的诊断 有些乙肝病人体内的病毒长期处于低复

制感染状态，血清病毒浓度极低。 （3）病情判断和疗效跟踪 PCR能判定病人血液中有否乙肝病毒及病毒含量，

从而得知病毒在肝脏的复制情况；定量PCR可测出病人血液中病毒的拷贝数，从而了解病毒在体内复制的动态情况，判断病情，观察药物疗效，适时调整治疗方案；还可以决定乙肝治疗的终点。 （4）乙肝病毒变异株的检测。

（5）肝炎病毒复制的直接实验室证据，可判断病毒携带者有否传染性。

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PCR结果与血清免疫学结果的综合评价

(一) HBV DNA 与 HBSAg/ HBSAb的关系

HBsAg阳性代表机体感染乙肝病毒，HBsAb的出现通常认为表示病毒已清除或既往感染或已接种过疫苗，患者自身有保护作用；但有报道HBsAg阴性而HBV DNA 阳性结果，可能原因是：

（1） 机体急性感染乙肝病毒期，HBSAg检测呈阳性通常需要经历所谓窗口期，而HBV DNA的检出可提前6~15天；

（2） HBsAg的水平过低造成无法检出，或者HBsAg确已消失但病毒仍处于低水平复制状态； （3） 暴发性乙型肝炎时肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg; S区基因发生逃避免疫变异造成HBsAg阴性而HBV DNA 阳性； （4） 血清亚型的漏检；

（5） 老年人HBsAg检出率低于5%，处于HBV的低感染和高免疫状态，老年中HBV感染引起的慢性肝病，血清学表现不典型，病毒较多已发生变异，病毒免疫逃避而感染持久。

也有报道，HBsAb与HBV DNA 同时出现阳性，这一般发生在乙型肝炎感染窗口期，通常HBV DNA 检出率逐步下降。 (二) HBV DNA 与 HBeAg/ HBeAb的关系

HBeAg/ HbeAb分别是乙肝传染性及恢复早期的标志。HBeAg的出现通常是一过性阳性，HBeAg提示病毒复制和血清具有传染性。HBeAg消失和HBeAb出现，标志着病程进入了恢复期，通常认为将伴随临床及生化指征的消退。因此多数情况下，临床医生主要依靠HBeAg/ HBeAb状况来判断传染性，PCR技术的应用为评价HBV的传染性增加了一种手段。如前所述，HBeAg与HBV DNA两项标志的符合率很高，都指示HBV的复制及传染性。但PCR检测研究为抗HBe的意义带来了新观念。对于抗HBe和抗HBc慢性的病人，探针杂交和常规PCR方法检测HBV—DNA的阳性率分别为22%和33%。但PCR结合探针杂交法其阳性率达89%，几乎全部患者血清中都能检测到HBV-DNA。说明患者血清出现Hbe抗体后，虽然病情向好的方向转化，血液中的病毒可能减少，但并未完全消失。

丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒是一种单链正股RNA病毒，归类于黄病毒科，主要通过血液传播。此病毒呈全球性分布，无明确地理界限。全球约有1%的人感染此病，约50%以上慢性肝炎是由HCV感染引起的。我国由于对献血员筛选方法不够灵敏，急性病毒性肝炎中，输血后乙肝发病率占2/3,其余1/3为丙型肝炎，其中20—30%病人发展为肝硬化。因此，为保障血液安全，维护受血者的健康利益，寻找一种快速、简便、准确的诊断方法，对患者提供早期诊断，是时势所趋。

目前临床上常用的HCV检测方法主要有两类： 1) 血清学方法(EIA或RIA)测定抗HCV

抗HCV联免疫试剂是目前诊断丙肝的主要手段，普遍应用于检查血源和血液

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制品。但HCV抗体存在着较大局限性-----窗口期平均长达70天，不利于早期诊断；而且只代表既往感染，可在病毒清除后仍长时间存在，有报道说该时间可长达9年，无法准确判别抗-HCV阳性者是否有病毒血症。 2) 荧光PCR检测HCV RNA

血清中的HCV RNA是病毒复制和进程的确切标志。所以，检测血清HCV-RNA已成为诊断HCV病毒血症的“金标准”。HCV感染者血清病毒滴度通常很低，常规分子杂交技术难以检出HCV-RNA。近年发展的RT-PCR,巢式PCR技术将HCV-RNA的特异性和灵敏度大大提高，而荧光PCR的出现又将此技术推向了另一台阶。

通过荧光PCR的方法可以直接检测HCV-RNA,大大提高HCV感染的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将窗口期缩短50多天，对窗口期感染的筛选和提高输血安全也非常有意义。此外，在抗病毒药物治疗中，HCV RNA是对其疗效评价的指标之一，其检测HCV RNA的滴度和基因型可对用药和预后提供参考。在治疗过程中，HCV RNA的动态监测同时还可为临床上的用药剂量、时间提供依据。

结核杆菌

近20年来，曾经控制在很低水平的结核病，在世界范围内有死灰复燃的趋势。我国卫生部组织的第四次全国结核病流行病学抽样调查显示：目前我国有4亿人感染过结核杆菌，现有传染性结核病人200万人，这使我国成为全球22个结核病高负担的国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。结核病的致病菌是结核杆菌，主要通过呼吸道传播，亦可以从消化道进入人体，其对外界的抵抗力较强，在阴湿的地方可以存活5个月以上，带菌的痰液是结核杆菌的主要传染源。结核病尚有一个不同于其他传染病的特点：大多数人被感染上结核杆菌后并不马上发病，多数可以终生不发病。临床上常用的辅助检验方法主要有：

1） 涂片染色法

在结核杆菌的实验室检查中，直接涂片染色法找抗酸杆菌，报告查见抗酸杆菌或未查见抗酸杆菌，这种检查方法的特异性不高。其一，分枝杆菌的众多细菌都具有抗酸性，如果标本中混杂有非致病性分枝杆菌，可导致假阳性结果，所以单凭形态染色不能确定是不是结核杆菌；其二，直接涂片染色法灵敏度不高，每毫升痰中有10万个结核杆菌以上才能检出，且痰涂片抗酸染色镜检找结核杆菌，检验者需在同一张涂片上连续查找200~300个镜头，这大大加强了医生的工作强度。其三，TB特别是肺TB痰涂片，由于患者存在着间断排菌及痰液标本的取材与患者当时所处的疾病状态紧密相关，且治疗手段较以前进步，痰阴转率大大提高，这更显示出了痰涂片法的缺陷。目前临床标本常取早、中、晚深咳出的痰进行浓缩集菌后直接涂片，以提高其阳性率。 2) 培养法

结核杆菌培养法属金标准，但培养条件要求高、时间长、培养出菌落需要几周时间，不利于患者早期诊断、早期治疗。 3) 影像学

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胸部X线检查可以早期发现肺结核，而且对病灶部位、范围性质、发展情况

和治疗效果做出判断，但易与矽肺、肺癌等混淆。属于辅助性诊断，适用于集体性健康体检。

4) OT实验或PPD实验

OT实验或PPD实验均属于免疫学检测，其阳性只能证明患者接触过结核杆

菌或接种过疫苗，不能作为有效性诊断，仅作为参考。 5) PCR检测

PCR检测结核杆菌DNA是一种病因学检测，取材方便、简便快速，整个过

程仅需1个多小时，可以做到当天取材，当天检测，当天出结果，利于患者的早期诊断、早期治疗。而且目前荧光PCR检测的灵敏度和特异性极高，数据由计算机处理，客观公正，保证了诊断的准确性.

肺炎支原体

肺炎支原体以引起间质性肺炎为主，并有支气管肺炎，也称原发性非典型性肺炎。支原体肺炎是儿科常见传染病，约占儿童肺炎的10%，主要通过飞沫传播，成人偶发。在秋冬交接之季发病率高，该病症状较轻，多数不表现出任何症状，无特异性体征。

现阶段对于肺炎支原体感染的辅助诊断主要有：

1） 分离培养 将可疑患者的痰或咽拭接种进行培养，经较长时间后，分离出来

的支原体经形态、细胞吸附、生化反应及特异性抗血清作生长抑制试验（GIT）进行鉴定。此种方法耗时长，培养及检测鉴定都较为复杂。

2） 血清学检测 临床上常用冷凝集试验，但是阳性率比较低，约为50%。且

此反应是非特异性反应，呼吸道的其他疾病可能导致假阳性的产生。

3） ELISA实验 应用单克隆通过ELISA实验从患者的痰液、鼻洗液或支气管

洗液检测支原体的分子量。

4） PCR检测 从患者的痰中检测肺炎支原体DNA，可以从病因学上作出明确

的诊断，并可实时跟踪治疗效果。诊断方法科学简便，快速。 另外PCR尚可检测幽门螺杆菌、柯萨奇病毒、EB病毒、伤寒杆菌等。

PCR技术在性传播性疾病方面的应用

爱 滋 病

艾滋病是英语\中文名称，AIDS是获得性免疫缺陷综合征的英文缩写。它是由于感染了人类免疫缺陷病毒（简称HIV）后引起的一种致死性传染病。HIV主要破坏人体的免疫系统，使机体逐渐丧失防卫能力而不能抵抗外界的各种病原体，因此极易感染一般健康人所不易患的感染性疾病和肿瘤，最终导致死亡。一个感染上艾滋病病毒的人，也许会在很长的一段时间内看上去或是自我感觉起来很好，但是他们却可以把病毒传染给别人。艾滋病从发现至今还不到20年，但它在全球所引起的广泛流行，已使3000多万人受到感染，1000多万人失去了生命。目前，世界上每天有万余人新感染上艾滋病病毒。不但医学界在竭尽全力研究预防治疗艾滋，各国政府，社会各阶层也都纷纷投入了对抗艾滋病的运动。但到目前为止，我们人类还没有找到一种治疗此病的方法。因此，为了自身的健康和家庭的幸福，大家都应该关注艾滋病。

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PCR 培训教材

了解艾滋病，进而预防艾滋病。

HIV的传播途径只有三个： 1）水平传播 2）血液传播 3）母婴垂直传播

爱滋病分布范围广，遍布全国的的20多个省市，感染者呈年轻化趋势，男女比例大致为：4~5：1，目前尚无一个比较好的检测方法，医学实验室常用检查主要有：

1）检测抗体 目前主要有ELISA、IFA、RIA、WB等，这些方法的敏感性都比较高，但是由于HIV的全病毒抗原与其他逆转录病毒存在交叉反应，HIV感染的淋巴细胞抗原与一些人血清中的抗HLA抗体存在交叉反应，故有一定的假阳性反应，因此此类实验仅适用于筛查HIV抗体，不宜用于确诊。

2）病毒分离 取新鲜的分离的正常人淋巴细胞或脐血淋巴细胞，用PHA刺激并培养，用以接种病人的血液，单个核细胞、骨髓细胞、脑脊液等标本。培养过程需要定期换液和补加PHA处理的新鲜正常人淋巴细胞，操作复杂，培养时间较长，需2~4周，不利于早期诊断。

3）测定病毒逆转录酶 主要测定病毒的逆转录酶的活性，可做定量测定，但其敏感性较低。

4）测定病毒抗原 常用ELISA法检测HIV的核心蛋白P24，这种抗原通常出现于疾病的急性感染期，潜伏期常为阴性，至感染发展爱滋病症状出现时，P24又可重新上升，由于潜伏期常为阴性，所以不利于爱滋病的预防控制及早期诊断。

5）PCR测定病毒核酸 运用PCR法检测HIV的RNA，可以检测出标本中微量的HIV基因组，属病因学检测，敏感度高，特异性好，几乎不存在交叉反应，且在患者早期就可作出诊断，大大缩短窗口期，利于爱滋病疫情蔓延的控制。

淋 病

性传播疾病是当今世界上广泛流行的传染病，其中淋病的发病率最高，临床上男性一般有典型症状，女性症状不典型或无症状，但可引起宫颈炎,尿道炎,子宫内膜炎,输卵管炎,盆腔炎,不孕症等多种妇科疾病。孕妇可经产道感染婴儿致淋菌性眼结膜炎。目前，淋病约占性病的70％以上，近年来我国的发病率呈上升趋势。发病人数每年以二三倍速度增加，而且逐渐由沿海地区向内地漫延，由城市向农村扩散。由于淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要靠实验室检查，常用的方法有：

1） 临床标本涂片 在中性粒细胞中寻找革兰氏阴性双球菌的方法，简便易行，

但灵敏度不高，女性病人检出率仅50％左右。

2） 分离培养 目前难度不大，但其生化鉴定复杂，需要较长时间，达不到快

速检测目的。

3） PCR检测 直接检测细菌的DNA,实现了快速、特异、敏感地检测和鉴定淋

球菌的目的。可对分离培养的菌株进行鉴定和进一步分析，提高检测临床标本的阳性率和准确性，同时还可作为抗生素治疗的疗效观察。

梅 毒

由梅毒螺旋体引起。是性传播疾病中危害较大的一种疾病。症状表现多样化，

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且时隐时现，病情可持续很长。早期主要侵犯皮肤和粘膜，晚期侵犯心脏血管系统及中枢神经系统。梅毒可通过胎盘传给胎儿引起流产、早产、死产或分娩出先天性梅毒儿，若不经治疗半年内死亡。 1. 潜伏梅毒

感染梅毒后经一定活动期，或肌体免疫性增强，或由于治疗的影响，症状暂时消退但未痊愈，此阶段称为潜伏梅毒。将感染2年以内的潜伏梅毒定为早期潜伏梅毒，约有20%病人可发生二期复发梅毒。说明有传染性。2年以上者定为晚期潜伏梅毒，传染性较小，但10-20%可发生心血管或神经梅毒，10-15%可能 发生晚期 皮肤、 粘膜或骨骼梅毒。 早期潜伏梅毒的孕妇，会胎传给胎儿，故妊娠期内应进行治疗。 2. 妊娠梅毒

孕期发生活动性梅毒或潜伏梅毒称为妊娠梅毒。梅毒螺旋体可通过胎盘传给胎儿，引起胎盘坏死，导致流产、早产、或足月分娩先天梅毒儿。妊娠梅毒对母体和胎儿都是有害的 ，从优生优育考虑患梅毒妇女未经治愈前不能结婚并避免怀孕，如已妊娠应在妊娠早期接受充足治疗，防止胎儿被感染。

目前梅毒的主要检测方法有：

1） 检查梅毒螺旋体 选最适标本——下疳渗出液置于显微镜下观察运动活泼

的梅毒螺旋体，在光学显微镜下难以看清，需要在暗视野显微镜下观察。易与其他的螺旋体混淆，且医生工作强度大。

2） 非螺旋体抗原试验 国内常用USR和RPR试验，这类方法均用于初筛，一

期梅毒阳性率70%，二期可达100%，三期梅毒阳性率低。一些非梅毒疾患可能导致假阳性的产生。

3） 螺旋体抗原试验 用梅毒螺旋体抗原检测病人血清中抗梅毒螺旋体特异性

抗体，对梅毒感染的整体敏感性达98％以上，特异性可达99％，但对一期梅毒敏感性仅82％，在STD人群中会出现更高的假阳性反应，且非性病的密螺旋体也可以引起这类抗体。

4） PCR检测 PCR采用直接检测梅毒螺旋体的DNA，其敏感性、特异性更高，

可效防止交叉反应，对早期梅毒，特别是症状不典型的梅毒患者有较高的临床意义，且PCR法检测简便快速，整个过程仅需1.5小时左右，可以做到早期发现、早期治疗。

尖锐湿疣

由人类乳头瘤病毒引起。近20年来世界各地发病率迅速增加，我国亦然。该病潜伏期很长（1-8个月），大部分病人无症状，孕妇患此病婴儿通过产道可发生喉部感染导致喉部乳头瘤发生。该病复发率高，须定期复查。

该病实验室诊断有细胞学、组织病理学检查，免疫学实验，这些方法或繁琐或敏感性差而被更敏感的核酸检测技术取代。而在核酸检测技术中PCR以其方便、快速、特异、敏感 而最适用于临床。

性传播疾病的检查范围

性传播疾病的检测范围不只是病人以及高危人群。目前专家认为在婚前、产前、输血前后、升学、就业、参军 以及幼教老师等体检应做梅毒及其他性传播性疾病检

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测。

PCR在优生优育五项中的应用

沙眼衣原体

沙眼衣原体除致沙眼外，在临床上常引起泌尿生殖道感染，有时还可以引起不育，严重影响患者生活。发展的临床检测方法也有多种，其中培养法属金标准，但沙眼衣原体为专性细胞寄生性，一般培养不能生长，只在活细胞内才能增殖复制，较难直接用于临床检测，多用于科研；免疫学方法有直接免疫荧光测定，有一定主观因素；而EIA法，对高危人群筛查尚可，但易与金葡、链球菌、淋球菌等发生交叉反应使其特异性受影响。PCR检测克服以上诸方面不足，是目前较有发展前途的一种检测手段。当然，在使用中也有不足：易有假阳性和假阴性，但随着防污染盒的使用和其它技术的完善，以使该检测方法更适用于临床。

TORCH感染

TORCH感染是围产期慢性非细菌性感染，这些病原体通过孕妇的胎盘经血流，淋巴循环或污染的羊水感染胎儿。孕妇感染这些病原体后其自身绝大多数无明显症状，因此极易漏诊和误诊。但这些病原体经胎盘传给胎儿后危害很严重。使胎儿被感染导致流产、死胎、畸胎及先天性感染等。目前主要检查弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹I 病毒、单纯疱疹II病毒，即TORCH感染。TO即刚地弓形虫，R即风疹病毒，C即巨细胞病毒，H即单纯疱疹病毒I、II型。

弓 形 虫

弓形虫是一种寄生在人和动物组织细胞内的寄生虫。弓形虫病一般分为先天性和获得性两种。先天性弓形虫病是指母亲在妊娠期间感染弓形虫而发生虫血症经胎盘传给胎儿引起胎儿宫内感染，中枢神经系统是最受累的部位，其次为眼；获得性弓形虫病是经消化道感染，也可通过皮肤和粘膜感染，多发于轻壮年，淋巴结受累较多见，严重病例可侵犯多个器官。

本病广泛分布于世界各地，传染源主要为动物。

临床表现：1 先天性弓形虫病：脑病：小头畸形、脑积水、无脑儿；眼部：脉络膜视网膜炎、视神经炎、虹膜睫状体炎、白内障；2 获得性弓形虫病：低烧、淋巴结肿大。

风疹病毒

风疹病毒感染分为先天和后天两种，先天风疹综合症（congenital rubella syndrome CRS ）：孕妇妊娠头四个月感染风疹，病毒可经血流通过胎盘侵犯婴儿。除流产死产外，活产者部分可无症状，但相当部分表现出单个或多个器官受侵后的损害，观察时间愈长，异常率愈高。主要表现如下：

低体重：出生时常 ≦2500g，生后发育也缓慢。全身各器官损害导致的畸形或发育功能异常；白内障，视网膜、色素膜病，小眼，青光眼，角膜云翳，虹膜发育不全等；感觉性神经性耳聋或听力迟钝；持续性动脉导管未闭，肺动脉狭窄或发育不全，心肌损害；小头畸形，急性脑膜脑炎，智力低下，嗜睡，进行性全脑炎；肝脾肿大，黄疸，肝炎；血小板缺少性紫癜，骨髓外造血；间质性肺炎；其它晚

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期症状：糖尿病， 胸腺发育不全，甲状腺机能不全，生长激素缺乏。

巨细胞病毒

CMV是引起人类先天畸形的重要原因之一，在许多地区比风疹病毒更重要。孕妇的原发或新的复发感染均可引起胎儿宫内感染或新生儿围产期感染。 CMV先天感染的婴儿中约5%表现为典型的全身巨细胞包涵体病。严重的感染可使婴儿在数日或数周内死亡。5%的病例表现为非典型的临床表现。其余90%属亚临床型。新生儿巨细胞包涵体病的特症是网状内皮系统和中枢神精系统受侵，有的合并听觉系统损害。 有部分患儿临床表现轻微易被忽视或误诊，而到后期发生严重中枢神经系统损害。患CID的婴儿有90%以上在出生后二年发展成显著的智力或感知缺陷。 有的患儿发生严重听觉、视觉异常。亚临床感染预后较好，约有10%婴儿发生神经性耳聋，通常在2岁内发生，有的合并轻度脑功能障碍。

单纯疱疹病毒

单纯疱疹病毒分I 型和II型两种，型单纯疱疹病毒存在于女性阴道和宫颈，与宫颈癌的发生关系极为密切。孕早期感染者该病毒能破坏胚芽而导致流产，孕中晚期感染者虽然很少发生畸形，但可引起胎儿发病。新生儿可以在通过产道时获得感染。单纯疱疹病毒可引起角膜炎，其特点是分泌物少或无。复发性病变表现为树枝状角膜炎或角膜溃疡。病变可达角膜基层，引起角膜永久性混浊，甚至失明。

由于这些病原体感染的临床症状不典型，在临床诊断上就造成了一定的困难，所以以上疾病的诊断主要依靠实验室诊断。 PCR是通过对病原体基因中高保守特异性核酸序列的扩增来检测病原体是否在患者体内存在。 PCR技术在遗传性疾病方面的应用

遗传性的基因缺陷导致的疾病占人口总数1％，是临床中不可忽视的一类疾病。按遗传方式与遗传物质的关系，遗传病总括可分为单基因遗传病，多基因遗传病及染色体异常遗传病。遗传病是由基因在性细胞的突变引起的。突变可分为以下几类：1.基因取代；2.缺插性点突变；3.非编码序列的点突变；4.DNA重排。突变可以自发或诱导产生。

作为基因突变的检测，实验室较易做的基因分析，PCR方法使用主要可分为四种，分述如下。

一、 PCR结合等位基因特异性寡核苷酸（ASO）探针法 其原理基于对已知有突

变热点基因进行检测。用PCR扩增目的基因，将产物固定于尼龙膜上，针对各种常见突变点合成一系列正常及突变的寡核苷酸探针，将产物与探针杂交，利用非同源序列不能杂交的原理，可发现突变位点。

二、 PCR扩增特异等位基因（PASA） 其原理为引物3’末端的碱基决定PCR反

应特异性及扩增效率，引物3’末端碱基与模板相互配对时，Taq酶才能使引物延伸，产生特异PCR扩增产物。因此设计引物，使突变位点位于3’末端，根据特异性产物出现与否可判断样品中是否有基因突变存在。

三、 限制性片断长度多态性分析（PCR--RELP） 如果碱基突变位置与某种限制

性内切酶识别位点相关，突变会产生新的或消除原有内切酶位点。选用特定

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的限制性内切酶消化PCR产物，通过电泳酶切图谱可直接判断基因突变。

四、 单链构向多态分析（PCR—SSCP） 单链DNA呈复杂构象，空间结构依靠链

内碱基配对维系，聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳迁移率的改变敏感地发现突变的存在。

除基因分析外，还可使用定序克隆或序列分析决定突变，但在技术上及设备上均要求较高，不是一种实验室易实践的方法。 地中海贫血 血友病 苯丙酮尿症 脆——X综合症 肿瘤（略）

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临床基因扩增检验实验室管理暂行办法

卫医发[2002]10号

第一章 总 则

第一条 为规范临床基因扩增检验实验室管理,保证临床基因扩增检验质量,使临床诊断和治疗更为科学、合理,特制定本办法。

第二条 临床基因扩增检验技术指以临床诊断治疗为目的,以扩增检测DNA或RNA为方法的检测技术,如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录依赖的放大系统(TAS)、自主序列复制系统(3SR)和链替代扩增(SDA)等。

第三条 本办法适用于开展临床基因扩增检验的实验室。 临床基因扩增检验实验室设立在二级以上医院。

第四条 临床基因扩增检验实验室必须使用经国家药品监督管理局批准的临床检验试剂开展临床基因扩增检验项目。

第五条 卫生部临床检验中心(以下简称卫生部临检中心)和省、自治区、直辖市临床检验中心(以下简称省临检中心)负责对所辖行政区域内临床基因扩增检验实验室的质量监督管理工作。

第二章实验室设置和验收

第六条 拟设置临床基因扩增检验实验室的医疗机构按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》(见附件)筹建实验室;筹建完成后,由其法定代表人向卫生部临检中心提出技术验收申请。申请时需提交以下材料:

(一)〈医疗机构执业许可证〉复印件; (二)可行性研究报告:

1.拟设临床基因扩增检验实验室医疗机构的所在地医疗卫生资源、状况、本机构的基本情况、对临床基因扩增检验的需求情况以及临床基因扩增检验实验室运行的预测分析；

2..拟设临床基因扩增检验实验室的设置平面图;

3.拟设临床基因扩增检验实验室将开展的检测项目飞实验设备条件和有关技术人员资料。

第七条 卫生部临检中心和省临检中心共同组织相关专业的专家组(以下简称专家组)，按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》对提出申请的临床基因扩增检验实验室进行技术验收。验收完成后,在20日内将验收报告寄送至申请机构。

第八条 经专家组技术验收合格的,医疗机构将本办法第六条规定的材料及专家组验收报告送省级卫生行政部门备案。在将符合规定的全部材料送达省级卫生行政部门备案后15日内,未收到省级卫生行政部门不同意的意见,方可开展专家组技术验收合格的临床基因扩增检验项目。

第九条 未经专家组验收合格并报省级卫生行政部门备案,医疗机构不得擅自开

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展临床基因扩增检验项目。

第三章实验室监督管理

第十条 临床基因扩增检验实验室必须按照《临床基因了扩增程验实在室工作规范》(另发)开展临床基因扩增检验工作。

第十一条 临床基因扩增检验实验室技术人员必须进行上岗培训。经培训合格者,由培训单位发给合格证书,并将培训合格人员名单报卫生部临检中心备案。获得培训合格证书者方可从事临床基因扩增检验工作。

培训单位为卫生部临捡中心,或由省级卫生行政部门指定并经卫生部临检中心认定的机构。培训时使用规定的统一教材。

第十二条 以科研为目的的基因扩增检验项目,不得向临床出具检验报告,不得向病人收取任何费用。

第十三条 临床基因扩增检验实验室必须按照《临床基因扩增检验实验室工作规范》开展室内质量控制,并参加卫生部临检中心组织的室间质量评价。

第十四条 卫生部临检中心按照本办法和《临床基因扩增检验实验室工作规范》协调、组织省临检中心对临床基因扩增检验实验室的检验质量进行监测。监测结果报省级卫生行政部门,同时抄送被监测的临床基因扩增检验实验室所在医疗机构。

第十五条 卫生部临检中心或省临检中心受省级以上卫生行政部门委托可对临床基因扩增检验实验室进行现场检查,现场检查工作人员在履行职责时应当出示证件。在进行现场检查时,检查人员有权调阅有关资料,被检查机构不得拒绝或隐瞒。

第十六条 卫生部临检中心对在室间质量评价中不合格的临床基因扩增检验实验室提出警告;对连续二次或三次中有二次发现临床基因扩增检验结果不合格的临床基因扩增检验实验室,卫生部临检中心报省级以上卫生行政部门,由省级以上卫生行政部门责令其暂停有关临床基因扩增检验项目,限期整改。经专家组进行再次技术验收并合格,并报省级卫生行政部门核准后,方可重新开展被暂停的临床基因扩增检验项目。

第十七条 对于未经卫生部临检中心组织的专家组技术验收合格并报省级卫生行政部门备案,擅自开展临床基因扩增检验项目的医疗机构,由省级卫生行政部门依据《医疗机构管理条例》第四十七条和《医疗机构管理条例实施细则》第八十条予以处罚,并予以公告。公告所需费用由被公告机构支付。

第十八条 出现下列情况之一的临床基因扩增检验实验室,由省级卫生行政部门责令其停止开展临床基因扩增检验,并对其所在医疗机构予以公告。公告所需费用由被公告机构支付:,

(一)开展超出卫生部临检中心组织的技术验收合格并报省级卫生行政部门备案的临床基因护增检验项目的;

(二)使用未经国家药品监督管理局批准的试剂开展临床基因扩增检验的； (三)在临床基因扩增检验中未开展室内质量控制的; (四)在临床基因扩增检验中未参加室同质量评价的; (五)在临床基因扩增检验中弄虚作假的;

(六)以科研为目的的基因扩增检验项目向临床出具报告并向病人收取费用的；

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(七)使用未经培训合格的专业技术人员从事临床基因扩增检验的。

第四章 附则

第十九条 对采供血机构的基因扩增检验实验室开展基因扩增检验项目的管理,参照本办法执行。

第二十条 卫生部临检中心和省临检中心组织的专家理对申请开展临床基因扩增检验的实验室进行技术验收所需费用按国家有关规定执行。

第二十一条 本办法由卫生部负责解释。 第二十二条 本办法自发布之日起施行。

附录 1

临床基因扩增检验实验室基本设置标准

根据《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》，制定本标准。 一、临床基因扩增检验实验室区域设置原则

（一）临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域： 1 试剂贮存和准备区 2、标本制备区

3．扩增反应混合物配制和扩增区 4 扩增产物分析区

如使用全自动分析仪，区域可适当合并。

（二）各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。 （三）进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂贮存和准备区——标本制备区——扩增反应混合物配制和扩增区——扩增产物分析区。

（四）不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。

二、工作区域仪器设备配置标准 （一）试剂贮存和准备区 1. 2－8℃和-15℃冰箱 2. 混匀器

3. 微量加样器（覆盖l－1000ul） 4. 移动紫外灯（近工作台面） 5. 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）

6. 专用工作服和工作鞋 7. 专用办公用品 （二）标本制备区

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1. 2－8℃冰箱、－20℃或80T冰箱 2. 高速台式冷冻离心机 3. 混匀器

4. 水浴箱或加热模块

5. 微量加样器（覆盖l—1000ul） 6. 可移动紫外灯（近工作台面） 7. 超净工作台 8. 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）

9. 专用工作服和工作鞋 10. 专用办公用品

如需处理大分子DNA，应备有超声波水浴仪。 （三）扩增反应混合物配制和扩增区 1 核酸扩增仪

2 微量加样器（覆盖1—1000ul） 3 可移动紫外灯（近工作台面）

4 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）

5 专用工作服和工作鞋 6 专用办公用品

（四）扩增产物分析区

视检测方法不同而定。基本仪器设备如下： l 微量加样器（覆盖l－200ul） 2 可移动紫外灯（近工作台面）

3 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心） 4 专用工作服和工作鞋 5 专用办公用品

中华人民共和国卫生部 二00二年一月十四日

附录 2

临床基因扩增检验实验室工作规范

卫检字「2002］8号

为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。

一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理

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临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号文）附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。

临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记，以避兔设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进人各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。

清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

（一）试剂贮存和准备区

下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。

含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂血分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。

主反应混合液的组成成分尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于“热启动”技术（在第一个高温变性步骤后加人酶），聚合酶也可不包含在主反应混合液中。

在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。

严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。

工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台上60－90cm内照射。由于扩增产物仅几百bp，对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。

（二）标本制备区

下述操作在该区进行：临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加人至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。

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要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进人本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加人待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。

用过的加样器吸头必须放人专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液）容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等）如出现外溅，则必须分别处理并作出记录。

对实验台适当的紫外照射（254nm波长，与工作台面近距离）适合于灭活去污染。可移动紫外线管灯可用来确保工作后对实验台面的充分照射。

样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法，可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价。

用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成，因为cDNA链较RNA稳定，保存相对容易。为保证逆转录反应的需要，应在标本制备区设置一个以上的温育装置。

cDNA合成的理想温度依所使用的酶而定，倾向于使用一步法：即使用在扩增反应缓冲液条件下具有逆转录活性的热稳定的DNA聚合酶进行逆转录，其较cDNA合成后再开盖以调节缓冲液或加人聚合酶进行扩增发生污染的可能性降低。

待测RNA的cDNA拷贝须保存在标本制备区，不得在本区对样本进行PCR扩增。 （三）扩增区

下述工作在本区内进行：DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA（来自样本制备区）的加人和主反应混合液（来自试剂贮存和制备区）制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。

不能从本区再进人任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。

为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。如有加样则应在超净台内进行。打开预处理过的反应混合液时必须防止液体溅出，尤其是在巢式扩增步骤之间。一个简单的方法是在打开反应管前快速离心数秒。可使用体积较小的离心机，因其所占实验台面小，易于用一只手操作，适合于大多数超净台。防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用，但必须注意的是，矿物油本身也可能成为一种持续性的污染源。用过的加样器必须注意清洁消毒。

完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出，必须处理井作出记录。

（四）扩增产物分析区

下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。

核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法（同位素标记或非同位素标记）、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酷胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法等。目前国内的商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标记的微孔板上探针杂交方法，即PCR－ELISA方法，也有膜上探针杂交方法。

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本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCR－ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至 lmol／L HCI中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离 PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放工 lmol／L HCI中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。

由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如澳化乙锭、丙烯酸胺、甲醛或同位素等，故应注意实验人员的安全防护。

本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压情况下（如安装排风扇）可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。

二、临床基因扩增检验实验室质量保证

临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验的所有阶段，即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。

（一）标本的采集

常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或构撤酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。

玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。

全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸椽酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是如酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。

临床用于 RNA（如 HCV RNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免BNA的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。

（二）标本的稳定化处理

用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。

由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐（Guanidine thiocyanate，GITC）可使 DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1：4的比例加至含有5mol/L GITC的试管中，从而使血清（浆）中的 RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。

（三）标本的运送

标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本。通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。

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（四）标本的贮存

临床体液标本如血清／血浆等可于-70℃下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/LTriS－1mmol／L EDTA缓冲液（pH7.5－8.0）中4℃保存。用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。

（五）标本的处理（核酸提取）

标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等），这些物质对其后的Taq酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则必须先进行液化处理，再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理及核酸提取试剂的RNA酶的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现有RNA降解的证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。

（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增 1. 靶RNA的逆转录

cDNA合成为逆转录PC R中的第一个酶反应步骤，所产生的cDNA为靶RNA的反向互补链，为后面扩增的模板。下述因素通常影响cDNA合成的效率：（1）逆转录效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等；（2）用于逆转录的标本中存在逆转录或 Taq酶的抑制物（如酚、氯仿、血红素等）；（3）RNA酶的存在导致RNA的降解。

2. 核酸的扩增

有多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg2+浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极为重要，必须定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查，以避免假阴性结果。

（七）污染

在实际工作中，常见有以下几种污染类型：扩增片段的污染（产物污染）；天然基因组DNA的污染、试剂污染（贮存液或工作液）以及标本间交叉污染（如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本）。临床基因扩增检验实验室中污染的最主要来源是扩增产物的污染。

由于一旦发生污染后，再围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还很繁琐，所以防止污染重在预防。但如果发生了污染，实验就必须停止，直到发现了污染源为止，并且实验结果必须作废。

1. 测定分析前的污染源

测定分析前实验材料的污染主要来自非病人标本来源的核酸。

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2. 测定分析阶段的污染源

通常，测定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合液的任何成分及核酸的制备和反应建立阶段所涉及到的实验设备的任何部位都是可能的污染源。如受污染的试剂（例如牛血清白蛋白，明胶或矿物油）、商品酶制剂、消耗品（如反应管，吸头）和实验设备（如加样器、离心机）等。

在前面三个工作区中，不当的实验操作会引起所使用的试剂、消耗品或实验设备的污染。而在产物分析区，当吸取扩增产物用于检测时，非常容易引起污染，因此必须制定标准操作程序（SOP），并严格执行。

3. 污染的避免

要避免污染，首先应是预防而不是排除污染，前面所述对工作区的严格划分的目的即是为了预防污染。

为避免以前测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉。如在扩增反应中用dUTP取代部分dTTP，使得产生的特异扩增片段含有尿嘧啶，这样扩增前在反应混合液中加人尿嘧啶糖苷酶（UNG），可破坏来自以前测定的扩增产物，从而避免其对以后要进行的扩增测定的污染。另外一种方法是持续的长波紫外灯照射，通过异补骨脂素光化学产生DNA加合物，由于DNA加合物对扩增没有反应但又不妨碍PCR后杂交过程，所以这种方法也能防止污染。

上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其来替代严格的实验室设置和管理，尤其是这些方法不能防止外来非扩增的天然DNA的污染。

4. 去除污染的措施

工作完后必须定期对实验室采取有效的去污染措施，结合各种不同的方法可达到最佳效果。去污染措施包括但不仅限下面几种：（1）用10％（v／v）次氯酸钠清洁表面；（2）试验后长时间的紫外照射实验操作台面和其他表面；（3）实验设备如加样器的高压消毒。

（八）扩增产物的分析

扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等，但临床PCR检验项目基本上都使用探针杂交方法。

杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂交或洗涤方法不合适等。

最常使用的基因探针有：DNA片段、合成的寡核苷酸和体外转录的反义RNA探针。探针的标记物常用的有生物素、地高辛、荧光素和同位素等。

在扩增后的杂交检测中，应该严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交的严格性，还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反，提高温度和／或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此，严密控制温度和试剂的离子强度是避免假阳性和假阴性结果的先决条件。要注意的是，温度和离子强度不能同时改变。

（九）质量控制

质量控制包括两个方面，即室内质量控制（以下简称质控）和室间质量评价。 l 室内质量控制

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必须对DNA和RNA分析的各步进行质量控制，以避免假阳性和假阴性，保证测定结果的准确性和重复性。由于核酸扩增测定的高敏感性，所以标本制备、逆转录、扩增本身和产物分析中的每一步都要求有质控措施。

（1）标本制备：常用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA提取效果，以判断所提取的DNA是否发生降解。用常规的手工提取方法制备的DNA的平均长度一般为~100kb，用适合PCR的DNA提取试剂盒制备的DNA的长度平均范围为30—40kb。明显出现降解的DNA（在1和10kb的低分于量范围内）在经琼脂糖凝胶电泳分离和用溴化乙锭染色后也可见强的荧光信号。用对甲基化不敏感的限制性内切酶（如 EcoRI）消化DNA，然后电泳分离，能够对酶活性的抑制剂进行质控（在抑制剂存在的情况下，高分子量的片段不被酶切）。潜在的抑制剂的存在通常用260nm和280nm的分光光度测定来估计，质量好的DNA提取物，A260／A280比值应该在1.75—2.0之间；否则，残留的蛋白或酚可能会很高。仅用光度计比色方法不能对DNA的完整性下结论。

最快的对总RNA提取质量控制的方法是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电泳，这一点跟DNA分离相同。但如果对结果有疑问，就应该在变性的条件下作琼脂糖凝胶电泳以检测RNA的完整性。在理想情况下，三种主要的核糖体RNA（28S、18S和5S）在凝胶上出现的带相对较窄。如发生RNA的降解，则出现大量低分子量带或出现带的消失。测定核糖体RNA带的密度指数可作为对RNA制备的质量评价的实验室内的标准；对向低分子量拖尾的、不对称性的峰的评估也是RNA完整性的合适的指标。另外，琼脂糖凝胶电泳能显示出在RNA的制备中被DNA污染的程度。由于这些原因，单独的光度计比色方法也不能对RNA的完整性下结论。

对于血清（浆）中病毒的测定，则要评价标本出现溶血、脂血和黄疽情况下标本处理方法对扩增检测的影响，避免由于标本处理方法的不当而出现假阴性结果。此外，还可采用已知浓度标本评价核酸提取方法的效果。

（2）逆转录和扩增：本部份包括阳性质控和阴性质控。

对逆转录和核酸扩增的质控既可使用内标质控方法也可采用外标质控方法。逆转录—扩增检测的内标通常为在整个细胞周期中均匀表达的mRNA，如HLA、β在肌动蛋白和组蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外，也可在标本制备时将外来内标加人到样本中共同提取、逆转录及扩增。当标本中存在逆转录抑制物，或核酸提取中发生RNA降解，或逆转录酶失活，内标即会表现为阴性结果。

对于DNA测定内标可使用对有机体存活所必须的靶基因，如维生素D血浆结合蛋白的基因。对于病原体的基因检测，内标多采用人工制备的竞争性内标。内标可以监控每一扩增孔中假阴性的产生情况。

目前的商品试剂盒大部分没采用内标方法质控。因此在测定血清／血浆病原体核酸如 HBV DNA、HCV RNA等时，应使用已知的弱阳性血清／血浆作为质控样本，与待测临床标本等同处理提取核酸及扩增，以判断逆转录及扩增检测的效果。

使用这些外加弱阳性质控不但可检测扩增反应液的质量，还可获得有关PCR试剂的检测下限和特异性的信息。这些质控样本在扩增检测时必须使用与患者的标本相同的主反应混合液。

每一个PCR实验中都必须设有外加阴性质控（污染监测质控），为判断扩增过程

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中污染出现的阶段，阴性质控可包括如下几种，即在样品制备的整个过程中所带的空白管、仅有扩增反应液但不含扩增模板的反应管、阴性标本等。阴性标本可以评估PCR实验的综合质量。

在扩增靶RNA的RT－PCR实验中，可做省略逆转录的污染质控，通过这种方法，可发现以前扩增的DNA片段所引起的污染。

（3）板上杂交和膜卫斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。

（4）测定结果的评价与报告：采用实时荧光定量PCR检测方法；在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后再进行定量分析，避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。

结果的报告必须简单清楚。定性测定报告“阳性”或“阴性”即可。定量测定则必须报告量的多少，如结果高于测定方法线性范围上限，则对样本稀释后再测，结果乘上稀释倍数；如结果低于方法的测定范围下限，则报告＜多少即可，不能报告为“0”或“阴性”。

2 室间质量评价

所有开展临床基因扩增检验的实验室都必须参加由卫生部临床检验中心组织的全国临床基因扩增检验项目的室间质量评价，评价结果将作为其开展临床基因扩增检验的依据之一。本工作规范自公布之日起实施。

卫生部临床检验中心 2002年2月20日

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