基因工程复习资料

第一章 核酸的制备

1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表

2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基

础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

第二章 基因工程工具酶

1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。 2.限制性内切核酸酶：

定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），

并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和

种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。

3.DNA连接酶：

定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。

种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。 4.DNA片段的连接方法：

①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。

②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。

③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。 5.DNA聚合酶：

①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。

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②大肠杆菌NDA聚合酶Ⅰ：具有5′→3′DNA聚合酶活性；5′→3′外切核酸酶活性；3′→5′外切核酸酶活性。

③T4噬菌体DNA聚合酶：具有5′→3′DNA聚合酶活性；3′→5′外切核酸酶活性；没有5′→3′外切核酸酶活性；

④反转录酶：具多种酶活性，主要包括RNA指导的DNA聚合酶活性、RNase H活性和DNA指导的DNA聚合酶活性，不具有3′→5′外切核酸酶活性； 8.碱性磷酸酯酶

1）定义：是指从DNA或RNA的三磷核苷酸上除去5′磷酸根残基的酶。 2）用途：①避免DNA重组时载体分子的自我连接；②用于DNA的末端标记； 常用碱性磷酸酯酶：①从大肠杆菌提取的细菌碱性磷酸酶（BAP）；

②从牛小肠中提取的牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。

第三章 基因克隆载体

1.克隆载体定义：克隆载体实际上是一种具有特定功能的DNA分子，它们能携带外源DNA

片段或基因进入受体细胞，并使其在受体细胞中得以维持或表达。

2.根据构建克隆载体的DNA来源不同分为：

①质粒载体：

②噬菌体载体：λ噬菌体载体、M13噬菌体载体。 ③Cosmid载体 ④植物病毒载体 ⑤动物病毒载体 ⑥人工染色载体

3.克隆载体必须具备以下条件：

①针对受体细胞的可转移性； ②自主复制功能； ③显著的筛选标记； ④特定的多克隆位点； ⑤安全性。

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4.构建质粒克隆载体的策略：

①能在受体细胞中进行有效的复制； ②含有外源DNA片段的克隆位点； ③含有供选择克隆子的标记基因； ④载体DNA分子应尽可能的小；

⑤构建不同用途的质粒载体时，可以根据特殊需要组装各种元件（小DNA片段）。

5.构建质粒载体的一般原则：

①选用合适的出发质粒； ②正确获得构建质粒载体的元件； ③组装合适的选择标记基因； ④选用合适的启动子。

6.噬菌体作为构建克隆载体的依据：

①λ噬菌体是一种温和噬菌体； ②能承载较大的外源DNA片段；

③在λDNA分子上有多种限制性内切核酸酶识别位点。

7.λ噬菌体的应用：主要用于建立cDNA基因文库。

8.M13噬菌体载体的应用：M13载体主要用于克隆和分离单链外源DNA片段。 9.Cosmid载体的特征：

①Cosmid载体是一种环状双链DNA分子，大小不超过36.4kb，一般在10kb以下；

②具有质粒的性质，可以像质粒载体一样承载外源DNA片段，转化大肠杆菌受体细胞，并在其中自我复制和增殖； ③含有一个cos位点；

④能承载比较大的外源DNA片段。 10.农杆菌

Ti质粒四个功能区：T-DNA区、Vir区、Con区和Ori区。

11.构建SV40基因载体的基本策略：取代型基因载体；病毒-质粒重组型基因载体。

12.质粒：是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1kb-200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要出现在细菌细胞中、蓝藻、绿藻。 13.电泳速度：ccDNA > 线状DNA > oc-DNA

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第四章：目的基因的分离与修饰

1.原核生物的基因组成包括：基因区、启动区、SD区、转录终止子和终止因子。 2.真核生物的基因组成：基因区、转录启动区、转录终止子。 3.基因的排列顺序：重叠基因、重复基因、加倍基因、基因重排。

4.基因组文库概念：某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个受体菌群体就是该种生物的基因组文库。 5.基因文库分类：基因组文库(DNA文库)和cDNA文库。

6.cDNA文库的概念：某种生物材料的基因转录产物mRNA经反转录形成不同的cDNA

片段，与克隆载体重组后贮存在受体菌群体中，这样的群体成为cDNA基因文库。

7.cDNA文库的构建：

①分离细胞总RNA，并从总RNA中分离纯化出mRNA；

②以mRNA为模板，合成cDNA第一链； ③双链cDNA合成；

④将合成的双链cDNA与载体重组，导入大肠杆菌宿主细胞增殖。

8.特殊PCR策略：套式PCR,反向PCR，不对称PCR，锚定PCR，长程PCR，反转录PCR，Alu PCR。

9.锚定PCR概念：锚定PCR，又称单侧PCR或单边PCR,是指通过添加锚定引物接头的

方式来扩增合成未知序列或未全知序列的方法。

10.聚合酶链式反应（PCR）：是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

第五章 重组基因导入受体细胞

1.受体细胞概念：又称宿主细胞或寄主细胞，从实验技术上讲是能摄取外源基因DNA

并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。

2.受体细胞选择的基本原则： ①便于重组DNA分子的导入；

②能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； ③便于重组体的筛选；

④遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长；

⑤安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；

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⑥选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达；

⑦受体细胞在遗传密码上的应用无明显偏倚性；

⑧具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。

3.原核受体细胞：

①种类：大肠杆菌（革兰氏阴性菌）

枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性菌）、 蓝细菌（革兰氏阴性菌）。

②用途：构建基因组文和cDNA文库；

建立生产目的基因产物的工程菌； 作为克隆载体的宿主菌。

4.转导与转化的区别：

1）转导：是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程；

2）转化：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持与表达的过程； 5.重组基因导入受体细胞的途径： 1）重组基因导入原核受体细胞： 转化（如Ca2+诱导大肠杆菌转化法） 转导 转染

电激穿孔（基本原理是利用高压电脉冲作用） 三亲本杂交 2）植物受体细胞：

①土壤农杆菌介导Ti质粒转化：

叶盘法转化植物细胞； 整体植株接种转化法； 原生质体融合转化法； 悬浮细胞共培养转化法。

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②植物病毒介导基因转移：如烟草脆裂病毒（TRV）转基因载体系统。 ③化学诱导DNA直接转化：多聚物介导法；脂质体介导基因转化；

④物理方法介导DNA直接转化：基因枪转化；超声波转化；激光微束穿孔转化；显微注射。 ⑤花粉管通道法：如涡流法、碳粉法等。 3）动物受体细胞：

①转染法：磷酸钙转染；DEAE-葡聚糖转染；聚阳离子-DMSO转染。 ②脂质体介导转化。 ③动物病毒介导转导法。 ④胚胎干细胞介导的转基因。 ⑤生殖细胞介导的转基因。

6.转化子与重组子的区别：通常我们将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子；而含有重组子DNA分子的转化子称为重组子。 7.遗传表型直接筛选：

1）利用载体选择标记筛选转化子： ①抗药性筛选； ②插入失活筛选； ③插入表达筛选； ④显色互补筛选。

2）利用报告基因筛选植物转化细胞。

3）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞。 4）营养缺陷型检测。 5）噬菌斑筛选。

8.依赖于重组子结构特征分析筛选：

①快速裂解菌落鉴定分子大小；②限制性内切核酸酶酶解分析。

9.核酸分子杂交分析： （1）分子探针：

①放射性探针，常见的放射性探针有P、H、S、C、I等，其中以P、H、S最为常用；

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②非放射性探针：生物素标记探针、地高辛标记探针、荧光素标记探针； （2）标记探针的方法：切口平移标记法、随机引物标记法、末端标记法、PCR

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标记法、光敏标记法、化学衍生结合标记法、交叉相连标记法。

（3）核酸探针杂交分析：Southern印迹杂交；Northern印迹杂交；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落（噬菌斑）原位杂交。

（4）影响探针杂交的因素：探针分子与目标分子之间序列的同一性；探针的长度；探针浓度；杂交加速剂；影响核酸分子杂交的因素还包括杂交漂洗液的组成、反应温度和盐浓度等。

第六章 外源目的基因表达与调控

1.基因表达的调控元件：

①启动子：原核生物的启动子；真核生物的启动子。 ②增强子。 ③终止子。 ④衰减子。

2.外源基因在大肠杆菌表达的形式：包涵体蛋白、融合蛋白、寡聚型外源蛋白、整

合型外源蛋白的表达、分泌型外源蛋白的表达。

⑤绝缘子。 ⑥反义子。

3.在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略：优化表达载体的设计；提高稀有密码子

tRNA的表达作用；提高外源基因表达产物的稳定性；优化发酵过程。 4.外源目的基因的表达包括转录和翻译两个阶段。 5.外源目的基因表达产物的检测：

①外源基因转录产物的检测。 ②报告基因的酶法检测。

③免疫学检测：免疫沉淀法、酶联免疫吸附法、Western印迹法、固相放射性免疫检测（RIA）。

④基因表达产物生物学活性检测。 6.外源基因表达产物的分离纯化：

①细胞收集：

离心法收集细胞；过滤法收集细胞；絮凝法收集细胞；吸附收集细胞；自由流细胞电泳技术。 ②细胞破碎。

③基因表达产物的粗分离：

离心分离、蛋白质的盐溶和盐析、透析和超滤、凝胶过滤、等电点沉淀、有机溶剂提取、萃取。

④基因表达产物的纯化：装柱，柱平衡，上样，洗脱，样品收集。 ⑤基因表达产物的精细分离：电泳分离；亲和层析；高效液相色谱。

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