二可溶性总糖的测定(蒽酮比色法)
更新时间:2023-09-15 06:54:01 阅读量: 资格考试认证 文档下载
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摘要: 一、目的 掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。 二、原理 强酸可使糖类脱水生成糠醛,生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合,形成糠醛的衍生物,呈蓝绿色,该物质在 620 nm 处有最大吸收 . 在 10 -100 一、目的
掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法. 二、原理
强酸可使糖类脱水生成糠醛,生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合,形成糠醛的衍生物,呈蓝绿色,该物质在 620 nm 处有最大吸收 . 在 10 -100ug 范围内其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比.
这一方法有很高的灵敏度,糖含量在 30ug 左右就能进行测定,所以可做为微量测糖之用.一般样品少的情况下,采用这一方法比较合适. 三、仪器、试剂和材料
1 、仪器
(1)分光光度计 (2)电子顶载天平
(3)三角瓶: 50m1 X 1 (4)大试管: 9 支 (5)试管架,试管夹 (6)漏斗,漏斗架
(7)容量瓶: 50rnl X 2
(8)刻度吸管: 1m1X3 , 2m1X1 , 5mlX1 (9)水浴锅
2、试剂
(1)葡萄糖标准液: l00ug/ml (2)浓硫酸
(3)蒽酮试剂 :0.2g 蒽酮溶于 100 ml 浓 H2SO4 中当日配制使用. 3、材料 小麦分蘖节。 四、操作步骤
1 、葡萄糖标准曲线的制作
取 7 支大试管,按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液:
管号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖标准液( ml ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 蒸馏水( ml ) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 葡萄糖含量( ug ) 0 10 20 30 40 60 80
在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4.0m1 ,迅速浸于冰水浴中冷却,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加盖玻璃球,以防蒸发.自水浴重新煮沸起,准确煮沸 l0min 取出,用流水冷却,室温放置 10min ,在 620 nm 波长下比色.以标准葡萄糖含量( ug) 作横坐标,以吸光值作纵坐标,作出标准曲线.
2 、植物样品中可溶性糖的提取
将小麦分蘖节剪碎至 2mm 以下,准确称取 Ig, 放入 50m1 三角瓶中,加沸水 25m1 ,在水浴中加盖煮沸 10min ,冷却后过滤,滤液收集在 50m1 容量瓶中,定容至刻度.吸取提取液 2m1 ,置另一 50m1 容量瓶中,以蒸馏水稀释定容,摇匀测定. 3、测定
吸取 lml 已稀释的提取液于大试管中,加入 4.Oml 蒽酮试剂,以下操作同标准曲线制作.比色波长 620nm ,记录吸光度,在标准曲线上查出葡萄糖的含量( ug ). 查表所得糖含量( ug )×稀释倍数 五、结果处理 六、注意事项
1、该显色反应非常灵敏,溶液中切勿混入纸屑及尘埃. 2、 H 2 SO 4 要用高纯度的.
3、不同糖类与蒽酮的显色有差异,稳定性也不同.加热、比色时间应严格掌握. 七、思考题
1、用水提取的糖类有哪些?
2、制作标准曲线时应注意哪些问题?
实验步骤
1. 求标准曲线方程
取6只试管,按下表配制(移取)葡萄糖(G)标准溶液,沸腾7分钟取出,用自来水冷至室温,用721分光光度计比色,波长620nm,1#管作为参比(保留),求标准曲线方程。(G浓度为200μg/mL,蒽酮试剂:2克蒽酮/每升85%H2SO4)
2. 样品含糖量的测定
(1)取菜叶(包菜和白菜两个样)准确称取1.00克剪碎研细后,放入大试管,加入25mL蒸馏水,煮沸10分钟,通过漏斗滤入250mL容量瓶中(可以抽滤),并用煮沸蒸馏水提取两次,滤液并入容量瓶中,滤纸上的残渣用水冲两次,冷却定容至刻度。
(2)吸取0.5mL滤液于编号的三只试管中,以蒸馏水补足1.00mL;另吸取1.00mL滤液于另编号的三只试管中,加蒽酮试剂5.0mL(于冷水浴中操作),摇匀后于沸水浴中煮沸7分钟,取出冷却至室温,以求标准曲线的1#管作为参比,用721分光光度计在620nm处测吸光度或透过率。
最小二乘法求标准曲线方程的公式:
X:G的浓度(μg/mL)Y:吸光度A=-㏒T 本实验要求相关系数r≥0.99
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