饲用角蛋白酶生物学研究进展

饲用角蛋白酶生物学研究进展

杨 刚

(河南农业大学牧医工程学院，郑州 450000)

摘 要 角蛋白酶由微生物产生，可特异性降解羽毛等含角蛋白类的物质，在饲料生产上具有潜在的应用价值。文中概述了不同来源的角蛋白酶及其性质；介绍了角蛋白酶的生物工程研究新进展；对角蛋白酶生产应用途径进行了探讨。 关键词 角蛋白酶 基因工程

角蛋白(keratin)在自然界中非常丰富，它以各种动物的毛发、羽毛、蹄等主要形式存在。含有α螺旋的角蛋白称为α-角蛋白，分软α-角蛋白和硬α-角蛋白2种。角蛋白(keratin)是一种抗性很强的硬性蛋白，角蛋白分子通过二硫键、氢键、盐键和其它交键作用形成高度交联的三维稳定结构，在一般条件下不溶解，只有当二硫键或肽键断裂以后，才会分解成短肽。二硫键的断裂需要特殊PH或强烈的还原作用，而肽键的断裂需要特异性很高的角蛋白酶，常见的水解酶如酪蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等动物来源的蛋白酶都不能水解角蛋白[1]。因此，自然界中角蛋白的大量存在提出了一个处理难题，造成局部环境的严重污染。另外，动物排泄物可能含有许多致病微生物，对人类的健康造成危害。

禽类羽毛中粗蛋白含量很高，达90%以上，主要由角蛋白质构成，羽毛的多肽间存在着很多二硫键(-S-S-)和氢键，呈索状结构，使羽毛蛋白的结构特别稳定。羽毛中含有丰富的赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、甘氨酸、胱氨酸等18种氨基酸，还含有常量元素、微量元素及一些未知的生长因子，在国际上被认为是一种有独特价值的优质蛋白质饲料。国内外多数采用物理(高温、高压)法和化学(强酸、强碱)水解法处理角蛋白，但存在耗能多、破坏了一些氨基酸、三废不易处理、环境污染严重、经济效益不高等问题。

为了更好地利用角蛋白这种丰富的角蛋白资源并且保护环境，许多研究者试图利用微生物来降解角蛋白，并取得了一定的成绩，参与角蛋白的生物降解的酶就是角蛋白酶(keratinase)。我国禽羽、畜

毛资源极为丰富，但目前利用率相当低，研究和开发微生物产生的角蛋白酶对我国环境保护和饲料加工均有着积极的意义。 1角蛋白酶菌种来源和理化性质 1.1角蛋白酶菌种来源

人们对分泌角蛋白酶的真菌研究较早，其中多数为皮肤类真菌，包括须癣毛癣菌、Trichophyton simii HN50、微孢长囊头孢霉菌等；丝状真菌，如Chrysosporium georgiae、拟青霉F1和A1等。有关产角蛋白酶的真菌种类较多，为生物技术研究角蛋白酶提供了良好的基因资源。

可产生角蛋白酶的放线菌主要是链霉菌类，如弗氏链霉菌、链霉菌DSM 40530和嗜热链霉菌[4]

等。丁正民等发现，放线菌SS-1也具有较高的角蛋白酶活性。

可降解角蛋白的细菌主要为芽孢杆菌，如地衣芽抱杆菌PWD-1分离自家禽养殖废物的消化系统，可以降解高压蒸煮过的羽毛[5]

。其他芽孢杆菌包括Bacillus pseudofirmus、Bacillus sp．FK 46、短小芽孢杆菌FH9等，最近Zedani等报道了分离自摩洛哥土壤中的8株细菌，对羽毛有不同的降解作用[3]

。另外具有角蛋白酶活性的细菌包括嗜热厌氧菌闪光杆菌、弧菌科细菌kr2(Vibrio sp．)、海岛闪光杆菌Fervidobacterium islandicum AW-1、Chryseobacteriurn sp．菌株kr6[4]

等，以上细菌角蛋白酶最适温度、pH值等性质特异，具有良好的应用性能。

随着对角蛋白酶研究的不断开展，不同来源、生长条件和产酶特性的微生物将被更多的发现。

1.2角蛋白酶的理化性质

蛋白酶根据活性位点的氨基酸基团和被抑制的情况可分为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等。已报道的角蛋白酶主要集中在丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶两类，两者分别为PMSF(苯甲基磺酰氟)和EDTA所抑制。

不同微生物来源的角蛋白酶分子量范围从18 ku到240 ku不等，最适反应温度主要集中在40～70℃，较低的为30℃，最高达100℃，如海岛闪光杆菌产生的角蛋白酶。另外，根据微生物产生角蛋白酶的位置可分为胞内酶和胞外酶，前者如来自Chrysosporium georgia的胞内酶，后者见于多数角蛋白酶，如Strep—tomyces strain K1-02、Tri- chophyton simii等产生的角蛋白酶，其中细菌来源的角蛋白酶多为胞外酶；根据最适作用pH 可分为酸性、中性和碱性蛋白酶，前者多由真菌产生如念珠菌酶，后两者种类较多，最适pH范围主要分布在7～10之间，部分嗜碱性微生物所产角蛋白酶最适pH值达11以上，Nocardiopsis sp．TOA一1产角蛋白酶最适pH更高达12.5，等电点在10.5[5]

以上；另外根据酶的构成可以分为单体酶和复合酶，前者数量较多，复合酶研究也有报道，在角蛋白的降解机理研究过程中即提出了二硫键还原酶和蛋白降解酶的复合酶降解机理。

2角蛋白酶的分子生物学研究

生物技术在酶制剂生产中具有重要的作用，已经有多种酶制剂应用于工业生产。角蛋白酶的研究虽然主要集中在菌种分离、酶的纯化和酶学性质等方面，但近年来关于角蛋白酶的分子生物学、发酵优化等研究也日渐增多。 2.1 角蛋白酶编码基因

角蛋白酶的编码基因的研究包括来自地衣芽孢杆菌PWD-1基因KerA[6]，嗜热厌氧菌闪光杆菌fls基因[7]，诺卡氏放线菌TOA-1的napA基因[5]、真菌发癣菌(Trichophton sp95)角蛋白酶基因kerB[8]、须癣毛癣菌角蛋白酶(Trichophyton mentagrophytes keratinase，Tri—M—K)编码基因[14]和来自烟曲霉角蛋白酶基因[9]等。

在以上各组研究中，以地衣芽孢杆菌PWD-1的

角蛋白酶基因kerA研究最为透彻，该基因由1457bp核苷酸组成，编码包括前蛋白原、蛋白原、成熟蛋白、5’非编码区及3’非编码区。编码区1137个核苷酸编码379个氨基酸。KerA具有2个潜在的启动子序列(-TATAAT-)，位于123-128和141-146bp处，一潜在的核糖体结合位点位于5’转录起始点8个核苷酸处，转录终止密码子TAA位于3’端的22个核苷酸处。最初产生的多肽为前蛋白原，经信号肽酶剪切形成蛋白原，再进一步剪切成成熟蛋白，由274个氨基酸残基组成。该成熟的角蛋白酶具有保守的催化三联体活性位点，由Asp32、His63 和Ser230组成。

另外，kerB基因来自真菌发癣菌，全长1434个核苷酸，编码477个氨基酸，为一新的角蛋白酶基因；Fls基因是来自嗜热厌氧菌闪光杆菌编码fervidolysin的一段DNA序列，其长度为2103bp，编码699个氨基酸的蛋白，与丝氨酸蛋白酶枯草杆菌蛋白酶家族相似性很高，该基因编码fervidolysin前体和成熟蛋白的分子量分别为75和58ku；napA基因由1152bp组成，编码384个氨基酸，成熟酶蛋白由蛋白原编码序列在Tyr(-1)和Ala(+1)处断裂产生，由188个氨基酸组成，分子量19.1 ku。 2.2 角蛋白酶的表达

在角蛋白酶的表达研究中，对kerA基因研究的最多，涉及大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母3类表达系统，其他角蛋白酶基因表达的研究主要集中在毕赤酵母中进行。

Lin等将kerA基因转入蛋白酶缺陷的B．subtilis菌株DB104中，转化子FDB-3、FDB．108和FDB-29可以在含羽毛的培养基和LB培养基分泌角蛋白酶，而原始菌株在LB培养基中培养无角蛋白酶活性。转化子FDB-29的角蛋白酶产量是原始菌株的3-5倍，推测是因在其启动子Pker上结合了营养型启动子P43而增强kerA基因的表达所致；梁斌等把编码地衣芽孢杆菌L- 25的角蛋白酶基因克隆到载体pUB18-P43质粒上，转化DB104中表达，转化子FD-8可分泌角蛋白酶，对偶氮角蛋白底物具有酶活性。

Porres等把kerA基因和编码前肽的1.2kb DNA片段克隆后转化入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33中表达，转化子pPICZaA-kerA在甲醇诱

导后可产生重组酶，144h后产量为124mg／L。重组的角蛋白酶为糖基化酶，与天然地衣芽孢杆菌角蛋白酶的性质相似[11]。

Descamps等在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71H中表达重组的角蛋白酶r-SUB3，重组酶与天然角蛋白酶性质一致，分子量为31.5 ku，N端氨基酸序列与天然酶均为ALTTQ，产量为150mg/mL。该天然酶被认为是Microsporum canis的致病因子，并具有用作疫苗的潜力。该研究对于特殊细胞的免疫反应和制作疫苗具有重要意义[12]。

Noronha等纯化了烟曲霉产生的角蛋白酶，将其cDNA在巴斯德毕赤酵母中进行了表达，重组菌株具有酪蛋白、偶氮角蛋白和角蛋白的酶解活性。重组酶具有与原始菌株相同的分子量，重组菌株在72 h培养期间内蛋白酶活性和偶氮角蛋白酶活性持续增加。活性为510U的重组酶可以在24 h内水解10％ 的角蛋白粉[13]。

为增加角蛋白酶的生产，Wang等将不同拷贝数的kerA转入地衣芽孢杆菌T399D中，通过Southernblot测定kerA基因拷贝数发现，当kerA基因为3～5个时酶产量较高，超过5个使角蛋白酶的分泌减少。另外在DB104和T399D 中串联表达强组成型的启动子P43和kerA基因时发现，P43增加了两者的角蛋白酶产量，当将2菌株培养于大豆或羽毛培养基中时，角蛋白酶的活性稳定且提高约4～6倍。

最近，Wang等使用重叠延伸PCR 法(Gene SOEing)构建了缺陷的SPO II AC基因，该基因编码芽孢形成必须的sigma因子，当切除地衣芽孢杆菌染色体中了256bp序列时形成了无芽孢突变体WBG，该突变体具有原始菌株相当的角蛋白酶活性[14]

。

3 角蛋白酶生产及其应用途径展望

角蛋白酶多为诱导酶，羽毛等底物的降解和角蛋白酶的生产为一同步过程，酶活性的高低对其实际应用有重要影响，可以从以下方法得到高活性的角蛋白酶并拓宽其应用。 3.1筛选高产酶活性的微生物菌株

目前部分微生物降解羽毛尚需一定的前处理，筛选能够快速、直接利用天然羽毛的微生物菌株更

具应用性，对现存菌株进行诱变筛选提高其酶活性也是有效的方法。

3.2基因工程手段表达具有应用潜力的角蛋白酶基因

部分产角蛋白酶的真菌酶活性较高，但因具有致病性而不宜直接用于发酵生产，可以通过基因工程手段表达该类基因以规模化生产角蛋白酶。 3.3酶工程方法获得适合工业应用酶学性质的角蛋白酶

部分角蛋白酶的酶学性质不适于工业应用，为提高酶的热、酸碱稳定性，拓宽其应用范围，可以通过基因改造等手段改变酶的性质。另外固定化技术也具有一定的应用价值。

3.4 发酵工程手段优化培养基组成和发酵条件以提高酶活性

通过培养基和培养条件的优化可以得到最大降解率的发酵产物，另外调节发酵时间可以控制降解肽段的组成并得到纯化的角蛋白酶。

3.5 结合其他微生物共发酵方法弥补发酵产物的不足

羽毛降解产物可用于饲料工业，如同其他糖质原料如纤维素、淀粉质材料等农业下脚料并用于饲料生产，有望获得高蛋白和碳水化合物的饲用产品，该过程可以通过共发酵等方法实现。

3.6 研究角蛋白酶理化性质并拓宽其应用途径

角蛋白酶具有易降解等问题，通过对其理化性质的研究并添加辅助因子和保护剂等方法可以延长其使用寿命，另外通过对角蛋白酶的纯化可用作抗原，研究皮肤类真菌的致病机理，从而治疗相关疾病。 4 总 结

目前角蛋白酶的研究主要集中在菌种筛选、酶学性质等方面，基因工程手段研究正日渐开展，大规模生产应用未见报道。已经报道的角蛋白酶表达菌株活性相对天然菌株并未完全具有明显的优势，因而在菌种筛选、基因改造和载体选择方面还需进一步研究，以提高角蛋白酶的产量和活性，更好的应用于工业生产。 参考文献:

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/0qr1.html