菌种鉴定实验过程

菌种鉴定实验过程

一、仪器与试剂 1、仪器 仪器名称 测序仪 DNA电泳槽 稳压电泳仪 电热恒温水槽 凝胶成像仪 恒温培养箱 恒温摇床 PCR仪 冷冻高速离心机 Surf系列精密单道可调移液器 1. 试剂 试剂名称 Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒 Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒 Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒 DreamTaq-TM DNA Polymerase 仪器来源 Applied Biosystems 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 上海一恒科学仪器有限公司 上海复日科技仪器有限公司 太仓市科教器材厂 太仓市实验设备厂 Applied Biosystems BBI 生工 试剂来源 生工 生工 生工 MBI 生工 BBI 生工 生工 生工 生工 Takara 生工 型号 3730XL DYCP-31DN DYY-5 DK-8D FR980 DHP-9162 TH2-C 2720 thermal cycler HC-2518R SP10-1000 cat. No. SK8255 SK8259 SK8257 EP0702 D0056 AB0014 SK8131 SM0337 合成部合成 铸塑部生产 D101A SK8191 dNTP 琼脂糖 SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒 DNA Ladder Mix maker 引物 枪头、PCR管、离心管等 克隆测序用 pMD18-T Vector 连接试剂盒 SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒 ?二、实验过程

1、基因组DNA提取 按SK8255（细菌）、 SK8259（真菌）、 SK8257（酵母）试剂盒操作。 2、PCR扩增

2.1 菌种鉴定通用引物： 所属类别 名称 序列5'→3' 扩增序列 16S rDNA 16S rDNA 内转录间隔区1和2 18S rDNA PCR长度/bp 1500bp左右 1500bp左右 600bp左右 1300bp左右 7F CAGAGTTTGATCCTGGCT 1540R AGGAGGTGATCCAGCCGCA 27F AGTTTGATCMTGGCTCAG 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC NS6 GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC 细菌 真菌 酵母菌 NL1 NL4 GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG GGTCCGTGTTTCAAGACGG 试剂 Template（基因组DNA 20-50ng/μl） 10×Buffer（with Mg2+） dNTP （各2.5mM） 酶 F（10uM） R（10uM） 加双蒸H2O 至 26S rDNA D1/D2区 500bp左右 2.2 PCR反应体系：

体积（μl） 0.5 2.5 1 0.2 0.5 0.5 25 程序 预变性 2.3 PCR循环条件：

温度 94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃ 4℃ 时间 4min 45 sec 45sec 1 min 10 min ∞ 修复延伸 终止反应 30 cycle 3、凝胶电泳

1％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察（见电泳图DNA Ladder Mix make）。 16SrDNA 18SrDNA ITS 26S

4、纯化回收

PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，纯化方式见附见说明书（SK8131 ），PCR产物用PCR引物直接测序。

如需要做克隆测序需要进行下面的步骤：

5、连接

?

按Takara pMD18-T Vector 连接试剂盒操作。

6、感受态细胞的制备：（氯化钙法）

6.1 从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100 ml LB培养基的1

L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转／分)。

6.2 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在

冰上放置10分钟，使培养物冷却至 0℃。 6.3 于 4 ℃, 以4000转／分离心10分钟，回收细胞。

6.4 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。 6.5 以10 ml用冰预冷的 0.1 mol／L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。 6.6 于 4℃,，以4000 转／分离心10分钟，回收细胞。

6.7 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

6.8 每50ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(含20%甘油)重悬每份细胞沉淀。 6.9 将细胞分装成小份(100μl/支)，放于-70℃冻存。

7、连接产物转化

7.1 取100?l感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。 7.2 加入10?l连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。 7.3 42℃水浴热激90秒。冰上放置15~20分钟。

7.4 加400?l LB培养基，37℃ 200～250 rpm振荡培养1小时。

7.5 用枪头吸取200 ?l培养菌液，涂布在预先用20?l 100 mM IPTG和100?l 20 mg/ml X-gal

涂布的氨苄青霉素平板上。

7.6 平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。 8、蓝白斑筛选

当外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物??半乳糖苷酶??片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落， 9、质粒提取与测序

用M13+_引物扩增（体系如上）。.M13+/-引物测序 三、测序结果分析

16SrDNA 序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp 上比对； 比对结果范例：

domain Bacteria (0/20/1186838) （界）

phylum \(0/20/176308)（门） class Actinobacteria (0/20/176308) （纲）

subclass Actinobacteridae (0/20/167455) （亚纲） order Actinomycetales (0/20/166237) （目）

suborder Streptomycineae (0/20/10027) （亚目） family Streptomycetaceae (0/20/10027)（科） genus Streptomyces (0/20/9681) （属）

S000691624 not_calculated 0.995 1242 Streptomyces sp. a16; DQ513513

按Ctrl并单击可访问连接 匹配程度 被匹配菌登录序列长度 NCBI上登录号 访问

18SrDNA、ITS、26S在NCBI 上blast比对；结果解释：http://www.docin.com/p-545514843.html

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/0pl2.html