量子点联合Cy5双重荧光标记人舌鳞状细胞癌细胞蛋白质的应用研究 - 图文

广东牙病防治2015年4月第23卷第4期·173·

·基础研究·

量子点联合Cy5双重荧光标记人舌鳞状细胞癌细胞

*

蛋白质的应用研究

＊

陈军，盘杰，邱小玲，杨孝勤，马伟群，郑俊发，赵建江＊

广东省口腔医院·南方医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，广东广州（510280）

【摘要】目的方法

QDs）与Cy5荧光染料对人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞中热休克蛋比较以量子点（quantumdots，

HSP70）和survivin蛋白质进行双重免疫荧光标记时蛋白质的分布及荧光的稳定性。白70（heatshockprotein70，

以QDs和Cy5荧光染料对Tca8113细胞内HSP70和survivin蛋白质进行双重免疫荧光标记，在激光共聚

激光共聚焦显微

焦显微镜下同时观察Tca8113细胞内的HSP70和survivin蛋白质表达及分布。激光连续照射2420391ms，用激光共聚焦显微镜自带软件LeicaConfocalSoftware测量QDs和Cy5的荧光信号强度变化。结果

镜下可见Tca8113细胞内HSP70和survivin蛋白质均有明显表达，分别表现为绿色和红色荧光，其中两种蛋白质重叠处呈黄色荧光。激光连续照射2420391ms，QDs标记的绿色荧光未见明显衰减，而Cy5荧光染料标记的红色荧光基本淬灭，随着Cy5荧光的淬灭，绿红黄三色通道下所见的红绿黄3种颜色的荧光也逐渐消退直至变成单色的绿色荧光。结论

QDs对光漂白的抵抗能力强，比Cy5荧光染料具有更高的光稳定性，更加适用于细胞内蛋

量子点；

双重免疫荧光标记；

纳米技术；

热休克蛋白70

白质的长时间动态监测的研究。【关键词】舌鳞状细胞癌；【主题词】癌，鳞状细胞；【中图分类号】Ｒ739．86

荧光抗体技术；

蛋白质组

【文献标识码】A【文章编号】1006－5245（2015）04－173－05

【引用著录格式】陈军，盘杰，邱小玲，等．量子点联合Cy5双重荧光标记人舌鳞状细胞癌细胞蛋白质的应用研J］．广东牙病防治，2015，23（4）：173-177．究［

DoublelabelingandcomparisonoffluorescencephotostabilitybetweenquantumdotsandCy5inhumantonguesquamouscellcarcinoma

CHENJun，PANJie，QIUXiao-ling，YANGXiao-qin，MAWei-qun，ZHENGJun-fa，

ZHAOJian-jiang．Departmentoforalandmaxillofacialsurgery，GuangdongProvincialStomatologicalHospital＆theAf-filiatedStomatologicalHospitalofSouthernMedicalUniversity，Guangzhou510280，China【Abstract】Objective

Toevaluatetheapplicationofquantumdots（QDs）andtheCy5labelingtechniquein

Usingtwo-colourconfocalmicroscopy，QDs

Tca8113cells，andtocomparetheirfluorescencephotostability．Methods

andCy5wereappliedtotagHSP70andsurvivinrespectivelywithindirectimmunofluorescence．TheexpressionofHSP70andsurvivininTca8113cellswasobservedinconfocallasermicroscopy，andthefluorescencephotostabilitybetweenQDsandCy5wascompared．Ｒesults

SurvivinandHSP70expressionwasclearlydetectedintheTca8113cells．After40

QDshavebetterfluorescencephotostability

Heatshockprotein70Proteome

minofcontinuouslaserexposure，nosignificantdeclineintheQDfluorescentmarkerswasobserved，whereastheCy5fluorescentsignalsfadedveryquicklyandbecameundetectable．Conclusion【Keywords】Carcinoma，squamouscell；【MeSH】Carcinoma，squamouscell；

Quantumdots；

thanCy5，andaremoreappropriateforobservationofproteinchangesincellsdynamicly．

Two-colorimmunofluorescence；

Nanotechnology；

Fluorescentantibodytechnique；

Cy5荧光染料作为目前常用的生物分子标记物之一，其较差的光稳定性明显限制了其在生物分子长时间动态研究中的应用

*

［1－2］

dots，QDs）作为荧光探针，由于其良好的荧光稳定

性，成为新一代荧光标记物，近年在生物医学领域尤

［3－8］

。其是在肿瘤蛋白质组学研究中成为研究热点

国外已有利用QDs对乳腺癌细胞膜蛋白及血液细胞［9－10］

。本研究在课题组前期中分子成像研究的报道

将QDs荧光标记技术应用于口腔鳞状细胞癌蛋白质

。量子点（quantum

基金项目：国家自然科学基金（30672340）；广东省科技计划项目（2008B030301183）；广东省医学科研基金资助项目（A2009097）

＊通讯作者：赵建江＊E-mail：zjj2521@sina．com

研究的基础上

［11－12］

，联合Cy5荧光染料同时对人舌

·174·广东牙病防治2015年4月第23卷第4期

鳞状细胞癌细胞中的热休克蛋白70（heatshockpro-tein70，HSP70）和survivin蛋白进行双重标记，研究其细胞亚定位，并对QDs与Cy5荧光染料的荧光稳定性进行比较分析，为今后应用QDs动态性研究口腔肿瘤蛋白质组功能提供进一步的实验依据。11．1

材料和方法

QD525nm标记的HSP70，分布在胞核内，表示该区域有HSP70但无survivin分布；胞膜处可见红色荧光和黄色荧光，红色荧光为Cy5特异性标记的survivin，表示该区域有survivin但无HSP70分布；红绿色两种荧光重叠处则显示为黄色荧光，表示该区域survivin与HSP70蛋白均有分布。

在激光共聚焦显微镜单色通道（绿色和红色）下（图1b和图1c），QD525nm特异性标记的HSP70在细胞浆及胞膜均有明显表达，表现为绿色荧光；Cy5特异性标记的survivin主要分布在胞浆及核膜上，细胞核内也有少量分布，表现为红色荧光。图1d为普通光镜下所见细胞形态。图1e为对照组甲激光共聚焦显微镜下所见，表现为绿色荧光，图1f为普通光镜下所见细胞形态。图1g为对照组乙显微镜下所见，表现为红色荧光。图1h为普通光镜下所见细胞形态。图1i为空白对照组，未发现荧光。图1j为普通光镜下所见细胞形态。

2．2QD525nm和Cy5光稳定性实验

在高强度激光连续激发2420391ms后，随着单色通道下所见的Cy5红色荧光逐渐淬灭（图2g～l），绿红黄三色通道下所见的红绿黄3种不同颜色的荧光逐渐消退直至变成单色绿色荧光（图2a～f），而单色通道下所见的QD525nm绿色荧光未见明显减弱（图2m～r）。

利用激光共聚焦显微镜自带的软件，测量得到在强激光照射2420391ms内每隔16031ms收集到的荧光强度数据，将其输入SPSS后制成图表，对QD525nm和Cy5进行光稳定性比较（图3）。结果发

QD525nm光稳定性显著高于Cy5，现，差异具有统计学P=0．02）。意义（t=2．653，3

讨论

QDs作为近年来发现的一种半导体纳米晶体新

材料

Tca8113细胞株购自于武汉大学中国典型培养

lgG（Invitrogen公司，物保藏中心。羊抗鼠QD525nm-美

国）；鼠抗人HSP70单克隆抗体和兔抗人survivin单

克隆抗体（Abcam公司，英国）；激光共聚焦显微镜LEICATCSSP2（Leica公司，德国）。1．2

方法

Tca8113细胞按1×105个/皿接种到共聚焦专用培养皿中，置于37℃﹑体积分数5%的CO2的培养

HCl缓冲盐溶液洗涤，箱中培养48h后，用Tris-冰冷甲醇固定10min。

将固定好的Tca8113细胞三羟基甲基氨基甲烷

TBS）洗涤2次，缓冲液（trisbuffersaline，加入通透液300μL，TBS洗涤3次，室温孵育10min后，然后滴

加一抗鼠抗人HSP70单克隆抗体与兔抗人survivin4℃过夜后，TBS洗涤，单克隆抗体的等量混合液，然

后滴加封闭缓冲液300μL，置于37℃湿盒中孵育10min，lgG与羊抗兔接着滴加二抗羊抗鼠QD525nm-Cy5-lgG的等量混合液，置于37℃湿盒中孵育45min，TBS洗涤3次，最后避光送检。对照组甲、乙、空白组中则一抗分别以等量的鼠抗人HSP70抗体和TBS的混合液、兔抗人survivin抗体和TBS的

TBS液取代一抗，混合液、二抗同前。1．3

激光共聚焦显微镜下检测

488nm激光连续激发时间为2420391ms，即

可获得一个完整的荧光强度变化记录录像，同时每15s自动测量1张图像的荧光强度值，输出161个荧光强度数据，然后进行统计学分析。1．4统计学分析

应用SPSS11．5统计学软件进行两独立样本t检验。2

果

2．1QD525nm联合Cy5双重标记HSP70和survivin

实验组、对照组甲、对照组乙、空白对照组的镜下观见图1。

在激光共聚焦显微镜绿红黄三色通道下（图1a），红、黄3种荧光，绿色荧光为可见绿、

结

型荧光标记物，斯托克斯（Stokes）位移大，具有很突

出的光谱特性，即对多种蛋白质标记后在同一光源照射下（同一波长光激发下）而发出不同颜色的光，以便于对各种蛋白质进行标记区分。本实验采用的QDs是由CdSe核心和ZnS外壳组成，直径2～6nm，荧光量子产率高，发光度强，光稳定性好，不易被光解或漂白，非常适合于长时间的蛋白质组学的实验研究

［13－16］

。

survivin和HSP70在口腔肿瘤的基因治疗中扮演着重要的角色。survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，只在肿瘤或者胚胎中才有表达，具有抑制细胞凋亡，参与肿瘤细胞耐药等功能，与肿瘤细胞的分

广东牙病防治2015年4月第23卷

［17］

第4期·175·

化增殖及浸润转移密切相关。HSP70在细胞中发

挥最基本的生理功能，如蛋白质折叠、伸展，寡聚体的形成和解聚等，提高细胞的抵抗力，起到应激保护

作用，参与机体的抗肿瘤免疫，具有明显的抗肿瘤活

［18］性。

本实验利用QDs联合Cy5对Tca8113细胞中上述两种蛋白进行特异性双重荧光标记，结果显示：在Tca8113细胞中，survivin表达于胞浆及核膜上，细胞核内也有少量分布；HSP70于细胞浆及胞膜均有明显表达。在高强度激光连续激发2420391ms后，QD525nm绿色荧光未见明显减弱，而Cy5红色荧光基本淬灭。随着Cy5红色荧光逐渐淬灭，绿红黄三色通道下所见的红绿黄3种不同颜色的荧光逐渐消退，直至变成单色绿色荧光。

进一步研究发现整个过程中QD525nm的荧光强度从279．513mW下降到224．957mW，下降幅度为19．51%；而Cy5的荧光强度从453．256mW下降到20．977mW，T2、下降幅度为95．37%。此外，在T1-9．6min、T3、T3-T43个时间段内（5．6min、T2-6．4min）QD525nm下降幅度分别为11．20%、4．66%、1．85%，而Cy5的下降幅度分别为61．66%、

65．73%、23．29%。由此可见在T2时刻

QD525nm的荧光强度下降已经趋于稳（336610ms），

定，但Cy5荧光强度仍然剧烈下跌直至T5时刻基本淬灭。这表明QD525nm对光漂白的抵抗能力强，荧光QD525nm比Cy5具有更高的光稳定性，寿命更长，更加适用于需长时间观察或动态观察细胞内蛋白质的变化。

Cy5荧光寿命短、光漂白率很快，这对需长时间

动态成像的研究来说是极为不利的。本研究采用QDs联合Cy5对细胞内蛋白质进行了双重标记以及光稳定性实验，充分证明了QDs较Cy5具有更加优越的光学特性，光漂白的抵抗能力强，具有极强的光稳定性能，可用于细胞内蛋白质的长时间动态监测。由于不同粒径的量子点在同一光源照射下发射出不同颜色的荧光，利用多种不同粒径量子点同时对细胞内多种蛋白进行标记，长时间动态的成像研究成

·176·广东牙病防治2015年4月第23卷第4期

为可能，有助于推动肿瘤蛋白质组学研究的发展。

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（编辑曾曙光，全春天）

Invisalign隐形矫治器材料理化性能变化的短期研究

＊

王兆红，李志鹏，黄宝鑫，陈奕嘉，朱双林＊

·基础研究·

*

广东省口腔医学重点实验室，广东广州（510055）中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院，

【摘要】目的方法

在患者口腔内及体外模拟口腔环境研究Invisalign隐形矫治器材料使用前后的理化性能变化。

选取进行Invisalign隐形矫治的5名患者，回收佩戴14d后的矫治器5副，作为口内使用组；选取相同患者

未使用的隐形矫治器5副，口外模拟口腔环境浸泡14d，作为口外模拟组；选取相同患者未使用的形矫治器5副，作为空白对照组。使用扫描电子显微镜观察材料表面形貌的改变，能谱仪检测材料表面元素组成变化，傅立叶红外检测材料官能基团的改变。结果

Invisalign隐形矫治器材料表面平整，为锆增韧纳米级有机聚合材料；在患者

口腔环境使用14d后，材料表面较粗糙，可见散在钙化沉积物，部分区域可见裂纹、磨损与分层，有菌斑附着；体外模拟口腔环境浸泡14d后，材料表面可见散在沉积物与少量菌斑，但未见磨损、裂纹及分层区域。傅立叶红外

－1－1

光谱显示材料吸收峰集中在3600～2700cm与1900～600cm两个波段，口腔内使用及体外模拟口腔环境浸

泡后，材料红外吸收特征光谱未发生明显变化。结论注意控制菌斑。【关键词】Invisalign；【主题词】牙科材料；【中图分类号】Ｒ783．5

隐形矫治器；材料试验；

模拟口腔环境；正畸矫正器

Invisalign隐形矫治器材料短期内理化性能较为稳定，但需理化性能

【文献标识码】A【文章编号】1006－5245（2015）04－177－05

【引用著录格式】王兆红，J］．广东牙李志鹏，陈奕嘉，等．Invisalign隐形矫治器材料理化性能变化的短期研究［2015，23（4）：177-181．病防治，

Short-termstudyofphysicalandchemicalchangesinInvisalignappliances

WANGZhao-hong，LIZhi-peng，

HUANGBao-xin，CHENYi-jia，ZHUShuang-lin．GuanghuaSchoolofStomatology，HospitalofStomatology，SunYat-

*基金项目：广东省医学科研基金（B2014166）

E-mail：shuanglinz@163．com

＊＊通讯作者：朱双林

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/0m0t.html