蔬菜中残留农药的提取方法

2009年 7月 1号

《农产品质量检测》作业

蔬菜中残留农药的测定方法

蔬菜中的残留农药一般有四大类，即有机磷农药、有机氯农药、拟除虫菊酯类农药和氨基甲酸酯类农药。

一、常规仪器测定法

1. 蔬菜中有机磷农药的多残留测定

⑴ 原理：含有机磷的试样在富氢焰上燃烧，以HPO碎片的形式，放射出波长526nm的特征光；这种光通过滤光片选择后，由光电倍增管接收，转换成电信号，经微电流放大器放大后被记录下来。试样的峰面积或峰高与标准品的峰面积或峰高进行比较定量。

⑵ 试剂：丙酮、二氯甲烷、氯化钠、无水硫酸钠、助滤剂硅藻土545农药标准溶液的配制：分别准确称取各标准品，用二氯甲烷为溶剂，分别配制成1.0mg/ml的标准储备液，储存于4℃冰箱中，使用时根据各农药品种的仪器响应情况，吸取不同量的标准储备液，用二氯甲烷稀释成混合标准使用液。

⑶ 仪器：组织捣碎机、粉碎机、旋转蒸发仪、气相色谱仪（附有火焰光度检测器）

⑷ 分析步骤：a 提取：称取500g试样，置于300ml烧杯中，加入50ml水和100ml丙酮，用组织捣碎机匀浆1-2min。匀浆液经铺有两层滤纸和约10g硅藻土545的布氏漏斗减压过滤。取滤液100ml移至500ml分液漏斗中。

b 净化：向滤液中加入10-15gNaCl使溶液处于饱和状态。猛烈振摇2-3min，静置10min，使丙酮与水相分层，分离出水相后，水相用50ml二氯甲烷振摇2min，再静置分层。将丙酮与二氯甲烷提取液合并经装有20-30g无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水滤入25ml圆底烧瓶中，再以约40ml二氯甲烷分次洗涤容器和装有无水硫酸钠的漏斗。洗涤液也并入烧瓶中，用旋转蒸发仪浓缩至约2ml，浓缩液转移至5-25ml容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度。

c 气相色谱测定：气体速度：氮气50ml/min、氢气100 ml/min、空气50 ml/min 温度：柱箱240℃、气化室260℃、检测器270℃

测定：吸取2-5uL混合标准液及试样净化液注入色谱仪内，以保留时间定性，以试样的峰高或峰面积与标准比较定量。

2. 蔬菜中有机氯和拟除虫菊酯类农药多残留的测定

⑴ 原理：试样中有机氯和拟除虫菊酯类农药用有机溶剂提取，经液-液分配和层析净化出去干扰物质，用电子捕获检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

⑵ 试剂：a 石油醚、苯、丙酮、乙酸乙酯、无水硫酸钠；

b 弗罗里硅土：层析用，用620℃灼烧4h后备用，用前140℃烘2h，趁热用弗罗里硅土总质量5%的水灭活。

标准溶液的配制：分别准确称取标准品，用苯溶解并配成1mg/ml的储备液，使用时用石油醚稀释配成单品种的标准使用液。再根据各种农药品种在仪器上的响应情况，吸收不同量的标准储备液，用石油醚稀释成混合标准使用液。

⑶ 仪器：气相色谱仪（附电子捕获检测器）、电动振荡器、组织捣碎机、旋转蒸发仪、层析柱

⑷ 分析步骤：a 提取：称取20g蔬菜试样，置于组织捣碎机中，加入30ml石油醚，于捣碎机上捣碎2min，捣碎液经抽滤，滤液移入250ml分液漏斗中加入100ml20g/L硫酸钠水溶液，充分摇匀，静置分层 ，将下层溶液转移到另一250mL分液漏斗中，分别用20ml石油醚萃取，合并三次萃取是石油醚层，过无水硫酸钠层，滤液于旋转蒸发仪上于40℃水浴浓缩至10ml，待测。

b 净化与浓缩：准确吸取试样提取液2ml,加入已淋洗过的净化柱中，用100ml石油醚-乙酸乙酯洗脱，手机洗脱液于蒸馏瓶中，于旋转蒸发仪上40℃水浴浓缩近干，用少量石油醚少量多次溶解残渣于刻度离心管中，最终定容至1.0ml，供气相色谱分析。

c 测定

色谱柱：石英弹性毛细管柱，0.25mm×15m，内凃有OV-101固定液气体充速：氮气40ml/min，尾吹气60ml/min，分流比1：50

温度：柱温自180℃升至230℃，保持30min；检测器、进样口温度250℃

d 色谱分析：吸收1uL试样液注入气相色谱仪，记录色谱峰的保留时间和峰高。再吸取1uL混合标准液进样，记录色谱峰的保留时间和峰高。根据组分在色谱上的出峰时间与标准组分比较定性，用外标记法与标准组分比较定量。

3. 蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留量的测定

⑴ 原理：含氮有机物被色谱柱分离后在加热的碱金属片的表面产生热分解，形成氰自由基，并且从被加热的碱金属表面放出的原子态的碱金属接受电子变成CN-，再与氢原子结合。放出电子的碱金属变成正离子，由收集极收集，并作为信号电流被测定。信号电流的大小和含氮化合物的含量成正比。以峰面积或峰高比较定量。

⑵ 试剂：a 无水硫酸钠、丙酮、无水甲醇、二氯甲烷、石油醚、氯化钠溶液、甲醇-氯化钠溶液

b 标准溶液的配置：分别准确称取速灭威、异丙威、残杀威、克百威、抗蚜威、甲萘威标准品，用丙酮分别配制成1mg/ml的标准储备液。使用时用丙酮稀释配制成单一品种的标准使用液和混合标准工作液。

c 仪器：气相色谱仪（带氢火焰离子化检测器）、电动振荡器、组织捣碎机、恒温水浴锅、旋转蒸发仪

⑶ 分析步骤：a 提取：称取20g蔬菜试样，精确至0.001g，置于250ml具塞锥形瓶中，加入80ml无水甲醇，塞紧，于电动振荡器上振荡30min。然后经铺有快速滤纸的布氏漏斗抽滤于250ml抽滤瓶中，用50ml无水甲醇分次洗涤提取液及滤器。将滤液转入500ml分液漏斗中，用100ml50g/L氯化钠水溶液分次洗涤滤器，并入分液漏斗。

b 净化：于盛有试样提取液的500ml分液漏斗中加入50ml石油醚，振荡1min，静置分层后将下层放入第二个250ml分液漏斗中，加25ml甲醇-氯化钠溶液于石油醚层中，振摇1min，静置分层后将下层放入第三个500ml分液漏斗中。然后用25ml甲醇-氯化钠溶液并入第三个分液漏斗中。

c 浓缩：于盛有试样净化液的分液漏斗中，用二氯甲烷一次提取三次，每次振摇1min，静置分层后将二氯甲烷层经铺有无水硫酸钠的漏斗过滤于250ml蒸馏瓶中，用少量二氯甲烷洗涤漏斗，并入蒸馏瓶中。将蒸馏瓶接上减压浓缩装置，于50℃水浴上减压浓缩至1ml左右，取下蒸馏瓶，将残余物转入10ml刻度离心管中，用二氯甲烷反复洗涤蒸馏瓶并入离心管中。用氮气除尽二氯甲烷溶剂，用病痛溶解残渣并定容至2.00ml，待测。

d 气相色谱测定：取浓缩过的试样液及标准液各1uL注入气相色谱仪中。根据组分在两根色谱柱的出峰时间与标准组分比较定性，用外标法与标准组分比较定

量。

二、蔬菜中残留农药的快速检测

蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测

⑴ 速测卡（纸片法）

原理：胆碱酯酶可催化靛酚乙酯酸水解为乙酸与靛蓝，有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

试剂：固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片；pH7.5缓冲溶液：分别取15.0g磷酸氢二钠与1.59g无水磷酸二氢钾，用500ml蒸馏水溶解。

仪器：常量天平、有条件时配备（37±2）℃恒温装置。

分析步骤：

整体测定法：选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1㎝2左右碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10ml缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上。取仪速测卡，用白色药片蘸取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37 ℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。每批测定时应设一个缓冲液的空白对照卡。

结果判定：结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制、未抑制表示。与空白卡相比较，白色药片不变色或略有蓝色均为阳性结果（抑制）；白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果（未抑制）。

⑵ 酶抑制率法（分光光度法）

原理：在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经会导致代谢产物水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算处抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在，

试剂：a pH8.0缓冲溶液：分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸氢钠，用1000mL蒸馏水溶解。

b 显色剂：分别取160mg二硫代硝基苯甲酸和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保存。

c 底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀至4℃冰箱中保存备用，保存期不超过两周。

d 乙酰胆碱酯酶：根据酶活性情况，用缓冲溶液溶解，3min的吸光度变化值应控制在0.3以上。摇匀后至4℃冰箱中保存备用，保存期不超过4天。 仪器：分光光度计或相应测定仪、常量天平、恒温水浴箱或恒温箱

分析步骤：a 样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1㎝2左右碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液，振荡1-2min，倒出提取液，静置3-5min，待用。

b 对照溶液测试：先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.1mL乙酰胆碱酯酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上。加入0.1mL底物摇匀，此时溶液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3min的吸光度变化值。 c 样品溶液测试：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其他操作与对照溶液测试x相同，记录反应3min的吸光度变化值。

结果判定：结果以酶被抑制的程度表示当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。

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