生理学

逆境胁迫对植物生理生化代谢的影响

摘要：当植物处于逆境的环境中时，会破坏植物的某些结构，而在其同时，植物也会对逆环境做出抵抗去适应环境。在逆境中，植物的叶绿素合成会受阻所以其叶绿素的含量会相应的减少，而其酶的活性也会在一定程度上受到抑制，再次，其中的丙二醛与可溶性糖均会发生相应的含量变化；植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。在正常情况下，细胞膜对物质的具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温或低温、盐渍、病原菌浸染后，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以至于植物细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的强度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。本次实验即是测定植物在逆境中的叶绿素、丙二醛、可溶性糖含量的变化以及其酶活性与细胞透性的改变。 关键字：逆境胁迫、叶绿素、丙二醛、可溶性糖、含量、细胞透性、酶活性、生理生化、影响、

材料与方法：八角金盘叶片、打孔器、试管、研钵、水浴锅、离心机、比色皿、分光光度计、振荡器、TAB试剂、高纯水、10%TCA、蒽酮试剂等。

一、 对叶绿体色素含量的影响：

（一）、实验目的：1、学会测量叶绿素的含量的方法；

2、测量植物叶绿体色素在逆境中的含量变化。

（二）、实验原理：分光光度法：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某特定波长测定其吸光度，即可用公式计

算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：A=αCL 其中α比例常数，当溶液浓度以百分浓度为单位、液层厚度为一厘米时，α为该物质的吸光系数。 （三）、操作方法：1、取0.1—0.2g给定植物叶片样品即八角金盘叶片，加入少量石英砂放入研钵中研磨；

2、待磨至液体无明显大叶片时用95%的乙醇定容至25 ml； 3、过滤或者离心，测OD652nm记录分析实验结果。 （四）、实验结果计算与分析：

处理温度 常温

（25 ℃） -5 ℃

叶片质量/g

0.130 0.130

光波长652nm 0.211 0.117

叶绿素总量/

-1

mg/g.FW 23.523

13.042

计算公式：叶绿素含量（㎎／g·FWˉ1）=色素浓度×提取总量／样品重（g）

CT（浓度）mg/L=OD652×1000÷34.5

处理过叶片CT（浓度）mg/L= OD652×1000÷34.5=0.117×1000÷34.5 =3.391（mg/L）

正常叶片CT（浓度）mg/L= OD652×1000÷34.5=0.211×1000÷34.5 =6.116（mg/L）

叶绿素含量（mg/(g·Fw)）=色素浓度×提取总量×稀释倍数÷样品（1000g）

处理过叶片叶绿素含量（mg/(g·Fw)）=3.391×25×20÷（0.130×1000） =13.042（mg/(g·Fw)）

正常叶片叶绿素含量（mg/(g·Fw)）=6.116×25×20÷（0.130×1000） =23.523（mg/(g·Fw)

结果分析：在逆环境中，植物的叶绿素的合成会受到一定程度上的阻

碍，所以其含量会相应的减少，导致其吸光度会比正常情况下生长的叶片小。

（五）、实验讨论：本实验测定叶绿素的含量，并且对比正常情况下与逆境（低温处理）中的植物中叶绿素的含量变化。在实验中，应该注意以下几个问题：1、为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些；2、取样时应该取各部分均匀的地方，不能过于集中的其中一个部位，均取才能说明其叶绿素的平均含量。 二、对细胞膜透性的影响：

（一）、实验目的：1、用电导率测定植物细胞的细胞膜透性； 2、分析逆境下植物细胞膜透性的变化。 （二）、实验原理：正常环境中中生长的植物，当其处于逆境胁迫中是时，其膜结构会遭到破坏从而导致细胞膜的透性增大，使得细胞的内含物外渗，导致其电导率增大。

（三）、操作方法：1、取八角金盘植物叶片两组，每组各30片，均用打孔器取得；

2、每组分别置于大试管中，加入蒸馏水15ml，然后将两组放入仪器中振荡40min；

3、时间到后取出试管，测定两组的电导率记录数据并分析结果。 （四）实验结果与计算分析：

两种处理的八角金盘叶片

低温处理过的叶片

正常对照的叶片

电导率（ck） 187.5

30.8

156.7

相对电导率 计算公式：伤害程度：处理电导率-ck电导率或者（处理电导率-ck电导率）／（热沸电导率-ck电导率）×100%

结果分析：正常情况下得植物叶片其细胞膜具有选择透过性，一般情况下其细胞膜不会使内含物外渗，具有结构的稳定性；但是，当植物受到一定的外界因素的刺激时，超过了本身的调节能力，其细胞膜就会受到破坏从而导致细胞膜的透性发生改变，导致电导率的改变。 （五）、实验讨论：取样时，应用打孔器取叶，使叶片的大小均为一般大小，从而使实验更加的准确，并且应使叶片一片一片的分开；其次，把握好振荡的时间，做好实验的数据记录。 三、POD活性的变化（愈创木酚法）：

（一）、实验目的：1、用分光光度计测定POD的活性； 2、比较POD活性的变化； 3、理解过氧化氢酶的催化原理。

（二）、实验原理：在过氧化氢酶的催化下，过氧化氢将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm有最大光吸收，故通过测470nm下得吸光度变化就可以测定过氧化物酶的活性。

（三）、操作方法：1、取0.1g样品叶片剪碎放入研钵，加入少量蒸馏水研磨至匀浆；

2、将研磨好的样品定容至50ml，然后将其置于离心机上离心（4000转／min）3min；

3、取0.1ml的离心提取液并加入4ml愈创木酚反应液，置于比色皿中测量其OD470。

（四）、实验结果与计算分析：

处理温

度 常温25 ℃） -5 ℃

叶片质量/g 1.0 1.0

愈创木酚

/ml 4.0

4．0

光波长470nm（每次读数

时间间隔1min） 0.953 0.625

1.190 1.397 0.794

0.904

POD活性/U/g.min 5.55×103.49×10

﹣3

﹣3

计算公式：过氧化物酶活性[U／(g·min) ]=△A470×VT／样品重量×0.01×Vs×t 其中△A470为反应时间内吸光度的变化；VT为提取液体积；Vs为测定时取用酶液体积；t为反应时间。

正常叶片△A470=（1.397-1.190）+（1.190-0.953）÷2=0.222 处理叶片△A470=（0.904-0.794）＋（0.794-0.625）÷2=0.140

正常的叶片过氧化物酶活性（U/(g·min)）=0.222×25÷（1×0.1×0.01×1） =5.55×0.001

处理过叶片过氧化物酶活性（U/(g·min)）=0.140×25÷（1×0.1×0.01×1） =3.49×0.001

结果分析：当加入愈创木酚时，由于过氧化氢酶的催化使得愈创木酚被氧化成茶褐色物质，然而由于反应的液体之间还未混合较为均匀，所以其颜色还比较浅所以其的吸光度小，而随着时间的推移，反应物的接触面积越来越大，混合的程度增大，颜色变深，所以吸光度会逐步增大；而处于胁迫环境下的提取物的由于其结构遭到了一定的破坏，酶活性受到阻碍，有一定的的抑制作用所以其比正常的叶片提取物的吸光度小。

（五）、实验讨论：在实验中，由于酶的反应催化活性比较快，所以在实验中应该快速的测定其吸光度，在加入了愈创木酚之后，应立即

把待测液放入比色皿中，并且立即测量其吸光度，每隔一分钟读一次吸光度数值，才会使数据更加准确，减小误差。 四、丙二醛含量的测定：

（一）实验目的：1、用分光光度计测定丙二醛的含量； 2、比较正常与胁迫环境下丙二醛含量的变化。 （二）、实验原理：MDA与TBA混合的情况下，当其在酸性高温的环境下，可以使三甲川变为红棕色，其最大光吸收为532nm，最小光吸收为600nm。

（三）、操作方法：1、称取1.5—2.0g叶片样品，加入少量的10%浓度的TCA研磨至匀浆；

2、再次用刻度试管加入10%浓度的TCA至10 ml，然后离心3min；

3、取2 ml的离心提取液加入2 ml TBA试剂置于试管中，沸水浴15min；

4、再次离心，并且制作一以2 ml的TCA比色皿作为其对照，测定OD532，OD600纪录数据分析结果。 （四）、实验结果与计算结果分析：

温度处

理

叶片质量/g

提取液体积/ml

光波长

532nm

常温（25 ℃） -5 ℃

1.8

10

0.398

600nm 0.185

7.63×10

﹣5

丙二醛含量

-1

/umol/g.FW

1.8 10

-1

0.417 0.166 9.00×10

﹣5

计算公式：MDA含量（umol/g.FW）=（OD532-OD600）×N(提取液总

量) ／1.55×d（比色杯厚度）×W（鲜重）

结果分析：当植物在低温处理的情况下，其生理代谢会相对较慢，而为了自身的抗逆境增强，植物会积累可溶性糖，而合成糖的中间转物为丙二醛，所以合成的丙二醛在逆境中会有所增加。

（五）、实验讨论：实验中应注意研磨充分，注意做好空白对照实验，测定在两个不同的波长情况下其吸光光度的大小。 五、可溶性糖含量的变化：

（一）、实验目的：1、用分光光度计测量可溶性糖的含量； 2、比较正常叶片与胁迫叶片的可溶性糖含量的变化； （二）、实验原理：糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛或羟甲基糠醛，生成的糖醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区得吸收峰为630nm，可在此波长下进行比色。

（三）、操作方法：1、称取1.0g样品剪碎，加入10ml的蒸馏水，放入大试管中；

2、将大试管放入沸水浴中5min，然后过滤，将其定容至50ml； 3、吸取0.1ml的提取液，加入5ml的蒽酮试剂，再次于沸水浴中1min，冷却后测定其OD620nm。 （四）、实验结果与分析：

处理温

度 常温（25 ℃

叶片质量

/g

1.0

蒽酮体积/ml

5.0

620nm 0.582

可溶性糖浓度μmol/L

14.81

） -5 ℃

1.0 5.0 0.234 36.83

计算公式：C（mg糖）63.29×OD620

处理过的叶片糖浓度C=63.29×OD620=63.29×0.234=36.83（μmol/L） 正常叶片叶片糖浓度C=63.29×OD620=63.29×0.582=14.81（μmol/L）

结果分析：植物为了增强自身的抗逆境能力，会相应的积累可溶性糖类以抵御不良环境，所以其在逆境的低温处理中其可溶性糖会增加导致吸光度增大。

（五）、实验讨论：本实验利用蒽酮比色法测定植物的可溶性糖的含量测定，实验中尽量剪碎待测叶，可以更充分的测定可溶性糖的含量。 总结：这是一次大型的综合性实验，测定正常与逆境环境中的叶片其叶绿素、丙二酮、可溶性糖的含量及其之间的含量差异，并且分析其含量差异的缘由，并且测定其细胞膜透性与酶活性的变化并分析其原因。实验中可能遇到各种各样的问题，不能焦躁、应付，应谨慎、耐心，联系所学的理论知识进行实验，并且做好各个步骤的对照实验，做好实验数据记录与数据分析。对于不明白的可以多问问，使得实验可以顺利的完成，对于实验的不足之处应多思考，只有认识到不足之处并不断的改正才能真正的进步。

参考文献：李合生主编：《现代植物生理学》（第二版）、 王学奎主编：《植物生理生化实验原理和技术》（第二版）、

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