基因工程论文

学号：13054107

基因工程结课论文

靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体构建

院（系）名 称： 理学院 专业 名 称： 生物科学 学 生 姓名： 姜己玉 所 在 班 级： 13-1

目 录

摘要 ............................................................................................................................................ 2 第一章 绪论 .............................................................. 3

1..1RNAi的研究进展 .................................................... 3

1.1.1RNAi的分子作用机制 ........................................... 3 1.1.2 RNAi 的特点 .................................................. 3

1.1.3 siRNA简介 ......................................................... 3 1.1.4 s iRNA 的设计原则 .......................................... 3 1.2 用于 RNA i 的载体 .................................................... 4

1.2.1 载体的选择 .................................................. 4

1.2.2 质粒人工构建的目的 ................................................. 4 1.3 MRP1 的研究进展 ...................................................... 4 第二章 实验材料与方法 ..................................................... 5 2.1 实验材料 ............................................................. 5 2.1.1 宿主菌 ............................................................. 5 2.1.3 载体通用引物 ................................................ 5 2.1.5 主要仪器 .......................................................... 5 2.2 试验方法 ......................................................... 5 2.2.1 shRNA 的设计与退火 .................................................. 5

2.2.2 合成干涉片段的退火 .......................................... 6 2.2.3 重组载体的构建 .............................................. 6

2.2.4 菌落PCR初步筛选阳性重组子 .................................. 7 2.2.5 测序鉴定重组载体 ............................................... 7 第三章 结果与分析 ......................................................... 8 3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果 ........................... 8 3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果 ............................. 8 3.1.2 目的片段的回收 ................................................ 8 3.2 重组质粒的菌落PCR ................................................... 8 3.3 重组质粒大量提取 ...................................................... 8 3.4 重组质粒测序结果 ................................................. 8 参考文献 .................................................................. 9

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摘 要

癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。

目的：本课题选用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP表达穿梭载体。构建针对mrp1 mRNA的RNA干扰表达载体。

方法：将预先根据MRP1基因序列设计合成的编码siRNA的cDNA序列与

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒载体连接，构建靶向mrp1 siRNA重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α后大量提取重组质粒，经菌落 PCR和 DNA测序分析检测重组载体构建结果。

结果：成功构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体。为下一步抑制mrp1基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。

关键词：RNA干扰；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒；穿梭载体

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第1章 绪 论

1.1 RNAi的研究进展

RNA干扰(RNA interference , RNAi)是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为一种双链RNA分子在mRNA 水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。RNAi有望成为分析人类基因组功能的有力工具，在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。

1.1.1 RNAi的分子作用机制

RNAi的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。不同生物体内的RNA干扰作用机制也各有不同，但是主要可以分为两种类型：特异效应作用机制与非特异效应作用机制。特异性效应一般发生在短双链RNA（21～23nt）上，非特异性效应发生于长双链RNA（30nt以上）。

1.1.2 RNAi的特点

RNAi具有高效性，也就是说与细胞内的mRNA的量相比，注入细胞内的siRNA的量要少得多。但由于循环放大机制的存在，仍可以有效地阻断目的基因的表达；同时，RNAi也具有高特异性，小干扰RNA由dsRNA降解得到的，除在序列识别中不起主要作用的正义链3′端的两个碱基以外，其余碱基均为必需。

1.1.3 siRNA简介

RNA干扰作用是通过siRNA（small interfering RNA，siRNA）这类小RNA分子作为较稳定的中间介质实现的。通过对植物的研究证明，双链RNA复合体降解为35nt左右的小RNA分子后通过序列互补与mRNA结合，进而降解mRNA。

1.1.4 siRNA的设计原则

RNAi 作用的成功与否，关键在于siRNA序列的结构，不同结构的siRNA序列沉默基因的效率差别很大， 2001年，Elbashir S M等[应用化学合成法合成了siRNA，并发现可以诱导哺乳动物发生RNAi，他们进而据此提出了siRNA 设计方法：1) 从起始密码下游50~100nt开始搜索siRNA以避免出现于5′或3′端的UTRs 的蛋白结合位点，；

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2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果没有相应序列，可以选择5′AA(N21)或5′NA(N21)；3)G/C含量在32%~79%之间[16]； 4) 要确定siRNA对靶基因的特异性，可以利用Blast软件在基因组中进行比对，；5)设置在基因组中无对应序列的siRNA的对照siRNA。但是，Elbashir S M等的设计方法siRNA 筛选效率仍然很低，要更好的掌握RNAi。

1.2 用于RNAi的载体

基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，称为载体。是指能够运载外源DNA片段进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。载体具有以下的功能：（1）运送外源基因高效转入受体细胞；（2）为外源基因提供复制能力或整合能力；（3）为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。

1.2.1载体的选择

质粒是为一种1-200kb不等的双链、闭环的DNA分子。是染色体外稳定遗传，并能以超螺旋状态存在于宿主细胞中的因子。RNA干扰实验通常选用质粒作为载体。质粒载体是为适应实验室操作在天然质粒的基础上人工构建的。但是，天然质粒的缺点是分子量大，拷贝数低，所以为使分子量尽可能减少，必须去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。

1.2.2 质粒人工构建的目的

天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建

1.3 MRP1的研究进展

MRP1的底物 直接通过细胞毒性分析和底物刺激的ATP酶测量进行识别MRP1的底物的，底物是由大量的多样化的疏水复合物，有机阴离子结合物以及阴离子非结合性底物所组成。典型的结合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸盐结合物，MRP1的组织分布 MRP1在体内的表达可以说是无所不在。

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