纳米级金微粒在DNA生物传感器研究中的应用

关于纳米在生物上的应用

生物技术通报

·综述与专论·

BIOTECHNOLOGYBULLETIN

2009年第2期

纳米级金微粒在DNA生物传感器研究中的应用

鲁卫平

摘重点。

关键词：纳米金

生物传感器

ＤＮＡ传感器

周元国

（第三军医大学大坪医院野战外科研究所分子生物学中心，重庆400042）

要：纳米金颗粒具有独特的物理、化学性质和良好的生物兼容性，已广泛应用于生命科学研究中的示踪技术。

将该技术与ＤＮＡ传感器相结合，可显著提高生物传感器的灵敏度，缩短检测时间和提高检测通量，已成为近年来的研究

ApplicationofNano-goldParticlesinDNABiosensors

ＬｕＷｅｉｐｉｎｇ

ＺｈｏｕＹｕａｎｇｕｏ

（MolecularBiologyCenterofDapingHospitaloftheThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400042）Abstract：Ｔｈｅｎａｎｏ-ｇｏｌｄｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｈｉｃｈｆｅａｔｕｒｅｕｎｉｑｕｅｐｈｙｓｉｃａｌ，ｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｙａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｔｒａｃｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｒｅｓｅａｒｃｈ．ＴｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｓｅｎｓｏｒｓａｎｄｎａｎｏ-ｇｏｌｄｐａｒｔｉｃｌｅｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｗｈｉｃｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｓｅｎｓｏｒｓ，ｓｈｏｒｔｅｎｔｈｅｔｅｓｔｔｉｍｅａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｌｕｘ，ｈａｓｂｅｃｏｍｅｔｈｅｆｏｃｕｓｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．

Keywords：Ｎａｎｏ-ｇｏｌｄＢｉｏｓｅｎｓｏｒ

ＤＮＡｓｅｎｓｏｒ

典型的DNA生物传感器的生物受体为固定于载体表面的单链DNA，称为“捕获探针”。分析物为一互补的单链DNA，称为“靶DNA”，它通过碱基互补配对的方式与捕获探针结合，从而固定于载体表面。荧光素是目前使用较广且技术比较成熟的靶

不具备的优越性能。特别是纳米金粒子，具有极佳的比表面积，能大大增加固定的分子数量。此外，纳米金还具有良好的生物兼容性，可与氨基发生非共价的静电吸附而牢固结合，与巯基之间形成很强的

Au-S共价键，这使得纳米金可与生物活性分子结

合，且不会影响生物活性分子的结构和活性。因此，纳米金微粒在DNA传感器以及DNA芯片的制作方面极具潜在而广泛的应用价值。

DNA标记物。荧光素敏感性高，荧光基团的多样性

可允许多色标记，从而在同一阵列中同时检测不同来源的靶DNA。然而，荧光染料和检测设备非常昂贵，荧光信号易淬灭，且操作要求严格，不适合常规开展。作为荧光素的替代，金属纳米微粒特别是纳米直径的金微粒标记具有低价、稳定和独特的理化性质，在生物传感上具有很好的应用前景。

纳米金属颗粒是指直径在1~100nm尺寸的超微粒子，这种微小颗粒具有与同组分的常规材料完全不同的性能，如表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和量子尺寸效应，其电学、磁学、光学和化学性质也会随之发生显著的变化，呈现出常规材料

1

1.1

光学检测

光吸收

纳米金微粒比较容易制作成稳定的胶体悬浮

溶液，胶体金有很强的吸光性，吸收光谱和强度由其大小、形状、组成和体积所决定。胶体金标记

DNA有多种不同的技术，最常用的方法是通过合

成DNA上修饰的巯基吸附到金粒子表面，结合非常稳定，其吸附能与共价结合键相似。且这种吸附不需要特殊试剂，只需对核酸稍作修饰，因此方法

收稿日期：2008-07-23

基金项目：重庆市自然科学基金（CSTC，2007BB5080），军队医药卫生科研基金课题（06G073）作者简介：鲁卫平（1971-），男，在读博士，主要从事病原微生物检验诊断方面的研究通讯作者：周元国，研究员，博导；E-mail：ygzhou@

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简单。Alivisatos等[1]和Mirkin等[2]采用纳米金粒子修饰的单链DNA，通过与其互补的单链DNA模板杂交产生金粒子聚合，金粒子聚合物可产生一个新的较长波长的吸收峰，从而产生一个从紫色到粉红色的颜色变化。由于液相反应中不易除去多余配体等干扰因素，大多数方法是在标准的载玻片上的固定单链DNA捕获探针和纳米金微粒修饰的互补单链DNA杂交，或与未修饰的单链DNA和信号探针实现“三明治”方式杂交。但这种成像检测的方法灵敏度低，为此引入了银染信号放大技术。将玻片上经过杂交固定的纳米金微粒银染15min，信号可用普通的平面扫描仪检测，其灵敏度可达50fM，是

cy3标记法的100倍[3]。

1.2瑞利（Rayleigh）散射和米氏（Mie）散射当球形的纳米微粒暴露于波长比微粒直径至

少长20倍的电磁波中，微粒的电子会发生与入射波同频率的振荡，这种振荡可产生瞬时的电磁辐射，其频率与入射波频率相同，与粒子大小无关，这种弹性散射被称为瑞利散色。如果入射光的波长小于微粒直径，微粒中各个电子的振荡各不相同，产生微粒散射光的干涉。这样随着微粒直径的增加，散色光谱就会向长波长变化，这种现象称为米氏散射。金属离子的光散射，特别是金和银，效率极高。在同样的激发条件下，一个60nm的纳米金微粒的亮度相当于3×105个荧光分子。基于这种散射特性，Taton等[5]用纳米金微粒饰靶ssDNA，与玻片上的探针杂交，然后用白光从载玻片的边缘射入。若无杂交发生，光线均一通过玻片不会发生散射现象，当玻片上有杂交发生，纳米微粒就会紧紧地附着在玻片上并产生光散射，散射光可用CCD照相或胶片成像，该方法检测灵敏度可达到1pM。Taton[5]还利用直径分别为50和100nm的纳米金微粒，在白光照射下会产生绿色和橙色散射光的特点，实现了寡核苷酸阵列的双色分析，这种技术可替代荧光法用于基因表达的比较。

另外，纳米金粒子经银染放大后可轻度增加光散色。目前已有商品化扫描仪测量光散色谱，检测浓度为100fM的靶DNA，只需要1h的杂交和5

min银染放大后即可。这种方法用于检测静脉血栓

相关基因的单核苷酸多态性，其鉴别力是使用荧光

芯片技术的6倍[6]。

1.3拉曼散射

发生弹性散射时，光子与介质中的粒子之间没

有能量交换，光子只改变运动方向而不改变频率，散射光具有与入射光相同的性质。除了这种弹性散射光外，一小部分光子以不同于入射光的波长散射，称为非弹性散射。在非弹性散射过程中，光子不仅改变运动方向，同时光子的一部分能量传递给介质中的粒子，相应散射光频率比入射光的要低；或者介质中粒子的振动和转动能量传递给光子，相应散射光的频率比入射光的要高，表明入射光从介质内部得到了一部分能量，从而改变了光子的频率，这个导致非弹性散射的过程称为拉曼效应。然而，拉曼效应产生的散射光强度较低，不易检测。用拉曼光谱检测法检测玻片表面由纳米金标记的单链

DNA、靶DNA与捕获探针形成的“三明治样”复合

物，若没有银放大，就检测不到拉曼散射。采用银放大后，可检测到浓度低至20fM的靶DNA[7]。这个现象说明银是拉曼散射效应的表面增强剂，具有拉曼活性的染料吸附银后形成大的电磁场，增强了自身的振动，称为表面增强的拉曼散射（Thesurface-

enhancedRamanscattering，SERS）。SERS检测的不

是银而是银包裹的拉曼染料，检测信号不受银沉积的干扰。

1.4表面等离子体共振（Surfaceplasmonresonan-

ce，SPR）

表面等离子体共振传感器是近年来迅速发展起来的新型光化学传感器装置，其基本原理是当入射光以一定的角度经一组光学器件（通常为一高折射率的棱镜上顺序放置一层低折射率的偶合层耦合激发后），在金属膜界面上发生表面等离子体共振，即入射光与界表面的自由电子会发生相互作用，其中部分入射光波被电荷密度波吸收，则入射光线不能发生全反射，从而导致反射光的强度大大减弱，而且这种反射光的强度与界面上吸附的生物物质分子的数量的多少成一定的比例关系。基于这种原理的生物传感器通常将一种具特异识别属性的分子即配体固定于金属膜表面，监控溶液中的被分析物与该配体的结合过程。在复合物形成或解离过程中，金属膜表面溶液的折射率发生变化，随即

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被SPR生物传感器检测出来。

该技术已广泛应用于化学领域，包括物质特性和气体传感。1991年，出现了第一台名为BIAcore的商用生物分析仪，检测双分子复合物的形成。此后，被广泛应用于蛋白质间、蛋白质与DNA相互作用以及结合参数的检测。该方法已成功地用于微阵列检测未标记的DNA，并可在杂交过程中实现实时监测，检测下限可达到纳摩尔（nmol）水平[8]。而利用高分子量或高光密介质如纳米金微粒进行标记，可将该方法的灵敏度提高1000倍，达到pg级[9，10]。

2

机电检测

2.1

石英晶体微量天平（Quartzcrystalmicrobalan-

ce，QCM）

石英晶体微量天平（QCM）和微悬臂都是利用了存在于一些装置的机械和电子参数间的物理耦合。石英晶体微天平是基于石英晶体的压电效应对其电极表面质量变化进行测量的仪器。交变激励电压施加于石英晶体两侧的电极时，石英晶体会产生机械振荡。给电极通上交流电，当频率与石英晶体的固有频率相同时，振幅变大，比一般情况下的振幅要大得多，从而形成压电谐振。若石英晶体表面沉积了一定质量的物质，其振荡频率就会发生相应变化，频率的改变正比于压电石英晶体质量的增加。QCM非常敏感，能够检测低于纳克（ng）水平的质量变化。而且将其完全浸入液体中也能激发出稳定的震荡，因此可用于实时监测未标记的DNA分子与捕获探针的杂交。尽管这种方法的灵敏度可达纳摩尔水平，更低浓度则还需要依赖PCR扩增。使用纳米金标记的信号分子则可以提高灵敏度，可检测浓度为32pM的未标记ssDNA[11]。另一种放大的程序是利用“树枝”方式，类似于依赖于金微粒网络进行检测的光学方法。其灵敏度达100pM[12]。通过在纳米金微粒表面进行金沉积可将灵敏度进一步提高到1fM[13]。

2.2微悬臂

微悬臂是指阵列中每一个位点上覆盖的特殊

传感器，它能将物理和化学的变化转化为一个微机械反应———悬臂的弯曲或偏向。微悬臂生物传感器是通过在悬臂的表面固定上特殊的生物敏感层，当被检测物质经扩散进入该敏感层，与敏感层分子发

生反应引起悬梁产生机械响应，并通过换能器转换为电学信号记录下来进行分析。当悬梁表面吸收分子后，质量增加，引起响应频率的降低，频率改变的大小即反映了所吸附分子的质量[14]。该方法已成功地应用于未标记DNA的检测，灵敏度达10~75nM[15]。近来有文献报道利用13nM直径的金标记并银染放大信号后检测灵敏度增加200倍，达到0.05nM[16]。

3电化学检测

由于纳米粒子具有独特的电学性质和良好的

生物兼容性，许多研究小组将纳米粒子引入电化学

DNA生物传感器中，发展了基于纳米微粒的电化

学DNA杂交检测方法[17~19]。纳米粒子在电化学DNA生物传感器中的应用主要在两个方面：一是改进分子识别物质的固定化方法，提高固定量；二是提高电化学信号指示剂的灵敏度，从而提高电化学

DNA传感器的检测灵敏度。常用的在电极表面固

定DNA的方法有：静电吸附法、共价键合法、自组装法等。在此基础上，先在电极表面修饰纳米粒子，再固定DNA，可大大提高其固定量，相应地提高杂交反应后靶DNA的含量，从而提高DNA检测的电化学响应信号。Cai等[20]将半胱胺酸通过巯基自组装修饰在金电极上，然后在半胱胺酸的氨基端连接金纳米粒子，得到金纳米粒子修饰的金电极。将待测的寡核苷酸组装在金纳米粒子修饰的金电极上，金纳米粒子的高比表面积可大大提高DNA的固定量，从而提高了检测的灵敏度，DNA的检出限为5×

10-10mol/L。

阳极溶出伏安法（ASV）是一种常用的、高灵敏的痕量金属检测法，是电化学DNA传感器常用的电化学信号的检测方法。它是将吸附到杂交体上的纳米金属微粒酸溶解并通过阳极溶出电化学法测量金属离子。应用这种技术时，金属纳米微粒标记的靶DNA与磁性小珠标记的捕获探针杂交，通过磁性吸附去掉未结合的DNA，强酸氧化溶解出金属粒子，用ASV进行检测[21]。这种检测是非直接的，而是将纳米微粒溶解后检测。纳米金微粒、银放大的金微粒以及金包裹的铁、银、锌、镉和氧化铅等微粒已成功用于DNA的检测，灵敏度从pM至fM。每一种微粒产生一种不同的伏安信号，因此可以使用相同的工作电极同时检测检测多个纳米微粒标记

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的DNA。但是将阳极溶出伏安法整合成微阵列很困难，因为来自于标记金属微粒的离子不能扩散到邻近的电极。Ozsoz等[22]使用石墨电极上固定捕获探针，与金标记的靶DNA杂交后使金粒子聚集在电极上，然后用差异脉冲伏安法检测。PCR扩增产物检测限为0.78fM。因此，带有不同捕获探针的石墨电极可集合成阵列。Park等[23]用纳米金电极芯片检测寡核苷酸的报道发表在Science上。该试验把微电极分别固定在芯片两端，形成大约20μm宽的狭缝，电极间的芯片上固定有探针。当一段结合有

13nm金颗粒的目标核苷酸通过碱基互补配对与

芯片上的探针结合时，纳米金颗粒被引入到电极间，银增强剂包裹纳米金颗粒而填补了电极间的空隙，相当于在两电极上搭桥，使得电路被导通，然后用测量两电极间的电阻值，从而得到互补核酸的量。

4展望

随着生物科学、信息科学和材料科学发展，生

物传感器技术飞速发展。光纤传感器正受到研究人员的重视，其原理是在光纤表面固定上生物识别单元，当倏逝波穿过生物识别单元时，或产生光信号，或导致倏逝波与光纤内传播光线的强度、相位或频率的改变，通过测量这些变化，即可获得生物识别单元上的变化信息。光纤传感器是一种光电转换设备，具有抗腐蚀、抗电磁辐射和电子频率干扰的能力。此外，光纤易于集成在一起形成高通量的检测阵列，且每根光纤相互独立检测，互不干扰。若能将该传感器技术与纳米微粒有机地结合，从而改进光纤表面生物活性物质的固定方法，以及生物识别单元信息变化的检测方法，将有利于高通量、便携式、智能化与集成化的新型DNA传感器的研制。

可以预见，高灵敏度和高选择性的DNA生物传感器将得以快速发展，以适应生命科学研究和临床医学的需要。纳米金粒子以其独特的光电以及生物学特性将在DNA生物传感器的研究开发中发挥更重要的作用。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/0i0m.html