酶工程实验(new)

酶工程实验

西北民族大学生命科学与工程学院

柏家林 刘俊林

仅供2008级生物工程专业和生物技术专业本科生试用

前 言

生物工程已成为发展最快、应用最广、潜力最大、竞争最为激烈的科技领域之一，也是最有希望取得关键性突破的学科之一。生物工程产业作为一个正在崛起的主导性产业，已成为产业结构调整的战略重点和新的经济增长点，将成为我国赶超世界发达国家生产力水平、实现后发优势和跨越式发展最有前途、最有希望的领域。

酶工程是生物工程的四大重要组成部分之一，是酶学和工程学相互渗透、相互结合发展而形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程等有机结合而产生的边缘学科。酶作为生物催化剂具有催化专一性好、效率高、作用条件温和等优点，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工、能源、环保、检测、生物技术等领域，深刻影响着许多重要的科学和实践领域。

《酶工程实验》与教材内容紧密结合,旨在通过实验强化学生对课堂内容的理解和掌握。结合我院实验条件，《酶工程实验》选择了十三个实验，主要集中在酶及酶工程概论、微生物发酵产酶、酶的提取和分离纯化、酶活力测定、酶的固定化和酶的分子修饰等章节，基本上反映了教材内容。

《酶工程实验》可作为生物技术、生物工程、食品生物技术、生物制药等专业学生的参考用书，也可供相关行业的技术人员参考。

编者 柏家林 刘俊林 二00九年十二月

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目 录

实验一 酶促反应中初速度时间范围测定 实验二 pH对酶活力的影响—最适pH的测定 实验三 温度对酶活力的影响—最适温度的测定 实验四 米氏常数和最大反应速度的测定

实验五 抑制条件下米氏常数和最大反应速度的测定及抑制类型的判定

实验六 碱性蛋白酶的吸附固态发酵生产 实验七 溶菌酶的提纯结晶 实验八 α-淀粉酶活力测定

实验九 酸性磷酸酯酶的提取和酶活力测定 实验十 溶菌酶的制备及活力测定 实验十一 果胶酶的固定化 实验十二 固定化酶活力测定

实验十三 胆绿素还原酶的修饰与活性基团的鉴定

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实验一 酶促反应中初速度时间范围测定

一、实验目的

1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理； 2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。 二、实验原理

酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。

酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。

利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。

酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。

要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。

三、实验试剂与器材 1.试剂

（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取） （2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）

取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6～0.7之间。

（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯

精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。

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（4）0.3mol/LNaOH溶液 2．器材

恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。 四、操作步骤

1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备

称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，臵滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，臵4°C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液臵透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，臵冰箱待用。

2.酶促反应

取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min。然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH终止反应。冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A405值。

3.数据处理

以反应时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中直线部分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。

表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量

试管号 NPP（mL） 稀释酶液(mL) 1 1.0 1.0 2 3 4 1.0 1.0 10 3.0 5 1.0 1.0 12 3.0 6 1.0 1.0 15 3.0 7 1.0 1.0 20 3.0 8 9 10 1.0 1.0 40 3.0 11 1.0 1.0 50 3.0 0 1.0 1.0 25 3.0 1.0 1.0 1.0 1.0 5 7 1.0 1.0 1.0 1.0 25 30 反应时间（min） 3 0．3M NaOH(mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 4

五、实验报告

绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。

实验二 pH对酶活力的影响—最适pH的测定

一、实验目的

1.了解pH对酶活力影响的机理； 2.掌握测定最适pH的基本原理； 3.掌握最适pH测定方法。 二、实验原理

pH对酶活力的影响极为显著。酶表现其最高活性时所处的pH即酶的最适pH。通常各种酶只在一定的pH范围内才能表现它的活性。一种酶在不同的pH条件下所表现出来的活性不同。

pH之所以对酶活性有很大影响，可能是它改变了酶活性部位有关基团的解离状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适于酶与底物的结合。而高于或低于最适pH时，酶活性部位基团的解离状态均不利于酶与底物的结合，酶活力也就相应降低。pH也可影响底物的解离及反应体系中其它组分的解离。缓冲体系中离子的性质和离子强度也可能对酶促反应产生影响。另外，pH除了对酶活性有很大影响外，对酶的稳定性也有影响。过高或过低的pH都会改变酶的活性中心的构象，甚至改变整个酶分子的结构而使其变性失活。

在保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的pH下测定酶活力，以pH为横坐标，OD405值为纵坐标作图，可得到一条pH—酶活力曲线，从中就可求出最适pH。

三、 试剂与器材 1.试剂

（1）酸性磷酸酯酶原酶液 （2）酸性磷酸酯酶酶溶液

将原酶液用水稀释10倍左右，使pH—酶活力曲线中第六管OD405在0.6～0.7之间。

（3）2.4mmol/L NPP水溶液

精确称取NPP 0.8908g，用水溶解并定容至1000mL。

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（4）0.3 mol/L NaOH溶液。 （5）各pH缓冲液 ①0.05mol/L柠檬酸溶液。 ②0.05mol/L柠檬酸三钠溶液。 2．器材

恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管。

表2.1 各pH缓冲液配制

0.05mol/L柠檬酸（mL） 100 82 18 3.0 71 29 3.5 59 41 4.0 47 53 4.5 35 65 5.0 23 77 5.5 11.5 88.5 6.0 4 96 6.5 1 99 7.0 0.05mol/L柠檬酸三钠（mL） 0 pH 2.0 四、操作步骤 1.酶促反应

取11支试管编号，0号为空白。各加入2.4mol/L NPP 0.2mL，相应加入不同缓冲液各1.8mL，每管再各加入35°C预保温（另取2支试管，各加入稀释好的酶液5～6mL，于35°C恒温水浴槽中保温2min）的酶液1mL，立即摇匀计时，15min后加入0.3mol/L NaOH 2.0mL终止反应。

2.测定OD405值

0号管先加入0.3mol/L NaOH 2.0mL后再加入酶液，各管终止并冷却后测OD405，将结果按不同pH对应记录。

3.数据处理

以反应pH为横坐标，OD405为纵坐标，绘制pH—酶活力曲线，求出酸性磷酸酯酶的最适pH。

四、实验报告

绘出pH—酶活力曲线图，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶最适pH。

实验三 温度对酶活力的影响—最适温度的测定

一、实验目的

1.了解湿度对酶活力影响的机理； 2.掌握测定最适温度的基本原理；

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3.掌握最适温度测定方法。 二、实验原理

温度对酶的影响有双重作用。 一方面，温度加速酶促反应的速度；另一方面酶是蛋白质，温度升高会引起酶蛋白质的变性。因此，在较低温度范围内，酶促反应速度随温度升高而增大，超过一定温度后，反应速度下降。酶促反应速度达到最大值时的温度称酶促反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的温度下测定酶活力，以温度为横坐标，反应速度为纵坐标作图，可得到一条温度-酶活力曲线，从中就可求得最适温度。

各种酶的最适反应温度是不同的，一般动物组织中各种酶的最适温度在35～40°C，植物和微生物中各种酶的最适温度范围较大，大约在32～60°C之间。但最适温度不是酶的特征常数，一种酶的最适温度不是一个恒定的数值，它与反应条件有关。如果反应时间延长，一般最适温度降低。因此，对同一种酶来讲，应该说明是在什么条件下的最适温度。

温度是影响酶促反应速度的重要因素之一。在温度较低时，绝对温度对Vmax的影响遵守Arrnenius公式：

lgVmax=-Ea/2.3R(1/T)+常数

式中，Ea 表示酶促反应的活化能，J〃mol-1；R表示气体常数，8.314 J〃mol-1〃K-1；T表示绝对温度，K；Vmax表示当酶全部被过量底物饱和时所测得的反应速度。

实验时，测定不同温度下酶促最大反应速度Vmax，以lgVmax对绝对温度的倒数1/T作图，得一斜率等于-Ea/2.3R的直线，由此可求得活化能Ea。

三、试剂与器材 1.试剂

（1）酸性磷酸酯酶原液 （2）酸性磷酸酯酶酶液

将原酶用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，使测定的第五管OD405值在0.6～0.7之间。 （3）1.2mmmol/L NPP

精确称取NPP 0.4454g，用缓冲液溶解定容至1000mL。 （4）0.3mol/L NaOH

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2.器材

恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管。 四、操作步骤 1.酶促反应

取8支试管，编号制表，0号管为空白。各管加入1.2mmol/L NPP 1.0mL，另取8支试管加入酶液2mL。酶与底物对应在10°C、20°C、30°C、35°C、40°C、50°C、60°C、70°C恒温水浴槽保温2min。酶液预热时间不要超2min，否则酶易失活，特别是在温度较高时。预热后各管加入酶液1.0mL，精确反应15min后，加入0.3mol/L NaOH 3.0mL终止反应。

2.测定OD405值

0号管反应温度为50°C，先加入0.3 mol/L NaOH 3.0mL后再加入酶液。各管反应终止并冷却后以0号管为空白，测定OD405值。

3.数据处理

①以反应温度为横坐标，A680（代表反应速度）为纵坐标，绘制温度酶活力曲线，求出酸性磷酸酯酶在此条件下的最适温度。

②以反应绝对温度的倒数（1/T）为横坐标，lgA405为纵坐标作图，求出直线部分的斜率，计算酶促反应的活化能。

五、实验报告

绘制温度-酶活力曲线图，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶最适温度；绘制Arrnenius图，计算本酶促反应的活化能。

实验四 米氏常数和最大反应速度的测定

一、实验目的

1.了解米氏方程的含义及其重要意义；

2.掌握测定米氏常数（Km）和最大瓜速度（Vmax）的基本原理； 3.掌握Km和Vmax的测定方法 二、实验原理

在温度、pH和酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大影响。在底物浓度很低时，酶促反应速度（V）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度继续

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增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。

底物浓度与反应速度的这种关系可用米氏方程表示： ｖ=Vmax[S]/Km+[S]

式中，ｖ表示反应速度；Km表示米氏常数；Vmax表示酶促反应最大速度；[S]表示底物浓度。

从米氏方程可见，米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位（mol/L或mmol/L）。

在酶学分析中，Km是酶促反应的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。

测定Km、Vmax一般用作图法。作图法有很多种，最常用是的Linewaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，1/v对1/[S]作图。可得到一条直线。直线在横轴上的截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax，可求出Km与Vmax。

三、实验试剂与器材 1.试剂

（1）酸性磷酸酯酶原酶液（从绿豆芽中提取） （2）0.05mol/L柠檬酸缓冲液（pH5.0） （3）酸性磷酸酯酶酶液

将原酶液用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，使测定的第五号管OD405在0.6～0.7之间。

（4）1.2mmol/L NPP

称取NPP 0.4454g，用缓冲液溶解并定容至1000mL. （5）0.3mol/L NaOH溶液 2.器材

恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管。

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四、操作步骤 1．酶促反应

取10支试管按表4.1编号。1～5号加入各不相同的底物浓度样品，并设空白管。各空白管在加入NPP和缓冲液后，先加入NaOH溶液，再加入酶液。其余各管按表4.1操作。精确反应15min后，各管加入0.3mol/L NaOH溶液终止反应。

表4.1 酶促反应各试管物质加入量

1 2 3 空白管 1.2mmmol/L NPP(mL) 0.05mol/L柠檬酸缓冲液（mL） 稀释酶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 0.2 1.8 0.4 1.6 0.6 1.4 0.8 1.2 1.0 1.0 0.2 1.8 0.4 1.6 4 5 6 7 8 反应管 0.6 1.4 0.8 1.2 1.0 1.0 9 10 35°C保温2min 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 35°C精确反应15min 0.3mol/L NaOH(mL) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2．测定OD405值

终止各管反应，待冷却后以1～5号管中相应底物浓度作空白，在可见分光光度计上测定OD405值。

3．数据处理

通过测定，得到一组数据OD405，由于酶促反应产物对硝基盐离子在0.1～0.2mol/L NaOH溶液中，在405nm处的摩尔消光系数为18.8×103，则OD405值与反应速度的换算为：

ｖ[（μmol/L对硝基酚）/min]=OD405/t×106/18.8×103×测定液体积（mL）/1000 式中，OD405为每管测定吸光度值；t为反应时间，min。 反应液中底物浓度换算式： [S]=XM/3

式中，X为底物加入量， mL; 3为反应液体积； M为加入时的底物浓度，mmol/L。

通过计算求得[S]，ｖ，1/[S]，1/ｖ等值，然后作双倒数图，获取纵横截距，求出Km和Vm值。

五、实验报告

绘制1/ｖ-1/[S]直线图，计算Km和Vmax 值。

实验五 抑制条件下米氏常数和最大反应速度的测定

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及抑制类型的判定

一、实验目的

1．了解抑条件下米氏方程的变化；

2．掌握不同抑制类型中米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的变化特点； 3．掌握米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定方法。 4．掌握不同抑制类型的判别方法。 二、实验原理

抑制剂是影响酶促反应的因素之一，根据抑制剂与酶结合的特点可将其分为不可逆抑制和可逆抑制两种类型。其中可逆抑制又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种类型。

1．竞争性抑制

酶不能与底物和抑制剂同时结合。酶促反应动力学特征为：米氏常数Km增大，Vm

不变。

2．非竞争性抑制

非竞争性抑制指抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进一步分解为产物，酶促反应动力学特征为Km不变、Vm下降。

3．反竞争性抑制

抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但此复合物不能分解为产物，酶促反应动力学特征为Km和Vm都发生变化（都变小）。

三、试剂与器材 1．试剂

（1）酸性磷酸酯酶原酶液（从绿豆芽中提取） （2）0.05mol/L柠檬酸缓冲液（pH5.0） （3）酸性磷酸酯酶酶液

将原酶液用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，使测定的第五号管OD405值在0.6～0.7之间。

（4）1.2mmmol/L NPP

精确称取NPP 0.4454g，用缓冲液溶解并定容至1000mL。 （5）0.3mol/L NaOH溶液

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（6）10mmol/L KH2PO4溶液 （7）3mmol/L NaF溶液 2．器材

恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管。 四、操作步骤 1．酶促反应

取20支试管按表5.1编号。1-5管加入各不相同的底物浓度样品，并设空白管。各空白管在加入NPP和缓冲液后，先加入NaOH溶液，再加入酶液。其余各管按表5.1、表5.2操作。精确反应15min后，各管加入0.3mol/L NaOH溶液终止反应。

2．测定OD405值

终止各管反应，待冷却后以1-5号管中相应的底物浓度作空白，在可见分光光度计上测OD405。

3．数据处理

根据实验四数据处理方法，通过计算求得[S]、V、1/[S]、1/V、[I]等值。，然后作双倒数图，三条曲线作在同一坐标纸上，求出Km、Vm、Ki，并据此判定抑制类型。

五、实验报告

绘制1/V-1/[S]直线图，计算Km、Vm、Ki值。并判定本实验所属抑制类型。

表5.1 非抑制条件下酶促反应各试管物质加入量

1 2 3 空白管 1.2mmmol/L NPP(mL) 10mmol/L KH2PO4（mL） 3mmol/L NaF(mL) 0.2 - - 0.4 0.6 - - - - 0.8 - - 1.2 1.0 0.2 - - - - 0.4 - - 1.6 4 5 6 7 8 无抑制剂 0.6 - - 1.4 0.8 1.0 - - - - 9 10 0.05mol/L柠檬酸缓冲液（mL） 1.8 稀释酶液（mL） 1.0 1.6 1.4 1.0 1.8 35°C保温2min 1.2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 35°C精确反应15min 0.3mol/L NaOH(mL) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

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表5.2 抑制条件下酶促反应各试管物质加入量

1 2 3 KH2PO4 1.2mmol/L NPP/mL 10mmol/L KH2PO4/mL 3mmol/L NaF/ml 0.2 0.3 - 0.4 0.3 - 1.3 0.6 0.3 - 1.1 0.8 0.3 - 0.9 1.0 0.3 - 0.7 0.2 - 0.3 1.5 0.4 - 0.3 1.3 4 5 6 7 8 NaF 0.6 0.8 - - 1.0 - 0.3 0.7 9 10 0.3 0.3 1.1 0.9 0.05mol/L 柠檬酸缓冲液/mL 1.5 稀释酶液/mL 1.0 35°C保温2min 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 35°C精确反应15min 0.3mol/L NaOH(mL) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

实验六 碱性蛋白酶的吸附固态发酵生产

一、实验目标

1．了解聚氨酯软质泡沫塑料吸附固态发酵碱性蛋白酶的原理和碱性蛋白酶活性测定的基本原理；

2．学会蛋白酶活性的测定方法；

3．掌握吸附固态发酵生产碱性蛋白酶的方法。 二、实验原理

1．惰性载体吸附固态发酵的基本原理

惰性载体吸附固态发酵既不同于传统的利用农作物产品为底物的固态发酵，也不同于液态搅拌通气发酵。在载体吸附固态发酵过程中，使用的载体材料可以是孔隙均匀一致的人工合成材料如聚氨酯泡沫塑料。这类材料与麸皮等农作物产品不一样，麸皮不仅颗粒大小不一，就是同一颗麸皮颗粒，其不同部位的组成和性质都存在着差异。而这类载体材料，不仅各处均匀一致，而且还可以根据需要在生产过程中调节其孔径大小。这样的载体在发酵过程中充当固相成分，它们对微生物的生长没有副作用，微生物也不能够分解利用这类材料生长。这种固相组成与农作物产品的固相组成相比，固态发酵过程中的微生物环境的均匀和一致性有了较大地提高，微环境的多样性也明显降低，大大提高了发酵的效率。

在惰性载体固相吸附发酵过程中，发酵液是微生物生长的营养来源。在配制发酵液时，可以像液态发酵的培养液一样进行精确调配，而且其中的营养成分处于易于被微生物利用的溶解状态，所以说，其又具有液态发酵的特点。在发酵液均匀吸附在惰性载体表面，整个发酵系统中形成比较稳定的、一致的、有利于微生物生长的界面环境，强化

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了发酵过程中氧、热等的传递过程。

2．碱性蛋白酶酶活力测定的基本原理

根据福林试剂（磷钼酸和磷钨酸混合物）在碱性条件下被酚类化合物还原而且呈蓝色的反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质分子中含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨基酸及苯丙氨基酸等），使蛋白质或其水解产物也呈这个反应，于是就可利用这个原理来测定蛋白酶活力的强弱，即以酪蛋白为作用底物，在一定pH及温度下，同酶液反应，经一定时间后，加入三氯乙酸，以终止酶反应，并使残余的酪蛋白沉淀，同水解产物分开，过滤后取滤液（即含蛋白质水解产物的三氯乙酸液）用碳酸钠碱化，再加入福林试剂使之发色，作分光光度计或光电比色计测定。蓝色反应的强弱同三氯乙酸中蛋白质水解产物的多少成正比，而水解产物的量又同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可以推测蛋白酶的活力。

三、试剂与器材 1．菌种

短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus），菌种用营养肉汤琼脂斜面培养基30°C培养48h后于4°C保存。

2．培养基

营养肉汤琼脂斜面培养基：1L水中加入蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，NaCl 5.0g，琼脂 15g。

发酵液培养基：1L蒸馏水加入牛肉膏5.0g，大豆蛋白胨10g，NaCl 5.0g。 3．试剂

福林试剂，0.4mol/L碳酸钠溶液。 4．仪器用具

恒温摇床，恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，250mL三角瓶等。 四、操作步骤 1．种子液制备

在250mL三角烧瓶中加入50mL营养肉汤培养液，接种保存在营养肉汤琼脂斜面培养基上的菌种，在35°C恒温摇床培养18h（200r/min）后，作为固态发酵的培养液。

2．固态发酵

在250mL三角烧瓶中放入4.0g洗涤并烘干的聚氨酯软质泡沫塑料后在121°C灭菌

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液化糖酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，故又称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品一定时间内生成的麦芽糖的量来表示酶活力。

淀粉酶存在于几乎所有的植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70°C 加热15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可以测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。

三、试剂与器材 1．材料

萌发的小麦种子（芽长约1cm） 2．器具

离心管,离心机,研钵,电炉,50mL和100mL容量瓶各一个,恒温水浴,20mL具塞刻度试管10个,试管架,2mL刻度吸管3个,1mL刻度吸管2个,10mL刻度吸管1个,分光光度计等。

3．试剂

（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）

精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。 （2）3，5-二硝基水杨酸试剂

精确称取3，5-二硝基水杨酸1g,溶于20ml、2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液浑浊可过滤后使用。

（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液

①A液（0.1mol/L柠檬酸）。称取C6H8O7〃H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 ②B液（0.1mol/L柠檬酸钠）。称取Na3C6H8O7〃2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解定容至1L。

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取A液55mL与B液145mL混匀，即为0.1mol/L pH5.6柠檬酸缓冲液。 （4）1%淀粉溶液

称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 四、操作步骤

1．麦芽糖标准曲线的制作

取7支干净的具塞刻度试管，编号，按下表加入试剂。

麦芽糖标准液（mL） 蒸馏水（mL） 1 0 2.0 麦芽糖含量（mg） 3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 0.2 2.0 0.6 2.0 1.0 2.0 1.4 2.0 1.8 2.0 2.0 2.0 2 0.2 1.8 3 0.6 1.4 4 1.0 1.0 5 1.4 0.6 6 1.8 0.4 7 2.0 0 摇匀，臵沸水中煮沸5min，取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标、光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

2．淀粉酶液的制备

称取1g 萌发3天的小麦种子，臵于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放臵提取15-20min，每隔数分钟搅动一次，使其充分提取。然后在3000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。

3．酶活力测定

取3支干净试管，编号，按下表α-淀粉酶活力测定取样表进行操作。

淀粉酶原液（mL） 纯化β-淀粉酶 3,5-二硝基水杨酸（mL） 预保温 1%淀粉溶液（mL） 保温 3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2．0 I-1 1．0 α-淀粉酶活力测定 I-2 1．0 臵70°C水浴15min，冷却 0 0 I-3 1．0 将各试管和淀粉溶液臵于40°C恒温水浴中保温10min 1.0 1.0 在 40°C恒温水浴中准确保温5min 2.0 2.0 1.0 将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。

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五、结果计算

计算I-2、I-3光密度平均值与I-1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算α-淀粉酶的活力。

α-淀粉酶活力（麦芽糖质量（mg）/样品鲜重（g）〃5min =麦芽糖含量（mg）×淀粉酶原液总体积（mL）/样品质量（g） 六、思考与分析

1．为什么要将I-1、I-2、I-3试管中的淀粉酶原液臵70°C水浴中保温15min？ 2．为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别臵于40°C水浴中保温？ 七、注意事项

1．样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。 2．为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3，5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时，恒温水浴温度变化应不超过±0.5°C。

3．如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。

实验九 酸性磷酸酯酶的提取和酶活力测定

一、实验目的

1．掌握胞内酶的分离提取方法； 2．掌握酸性磷酸酯酶的活力测定方法。 二、实验原理

酸性磷酸酯酶存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一性的水解磷酸单酯键。本实验以绿豆芽为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经酸性磷酸酯酶作用，可水解生成酚和无机磷。当有足量底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1μmol产物所需要的酶量为1个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。

三、试剂与器材

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1．器材

高速离心机，托盘天平，滴管，漏斗，纱布若干，滤纸若干，研钵一套，培养皿一个，100mL量筒1支，可见分光光度计，恒温水浴锅，5mL、1mL移液管各一支，试管20支，试管架一支。

2．材料

绿豆芽（当日采摘，50g ） 3．试剂

（1）酸性磷酸酯酶液

取原酶液用0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液稀释10-20倍。 （2）5mmol/L磷酸苯二钠溶液（pH5.6）

精确称取磷酸苯二钠2.54g，加蒸馏水溶解后定容不得至100mL，即配成为100mmol/L磷酸二苯钠水溶液，密闭保存备用。用0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液稀释20倍，即得5mmol/L磷酸苯二钠溶液（pH5.6）。

（3）0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液 （4）Folin-酚试剂

于200mL磨口回流装臵内加入钨酸钠100g、钼酸钠25g、水700mL、85%磷酸50mL以及浓盐酸100mL。微火回流10h后加入硫酸锂150g、蒸馏水50mL和溴数滴摇匀。煮沸约15min，以驱残溴，溶液呈黄色，轻微带绿色；如仍呈绿色，如重复加液体溴的步骤。冷却定容到1000mL，过滤，臵于棕色瓶中可长期保存，使用前，用蒸馏水稀释3倍。

（5）1mol/L碳酸钠溶液 （6）0.4mmol/L酚标准溶液

精确称取分析纯的酚结晶0.94g溶于0.1mmol/L盐酸溶液中，定容至1000mL，即为酚标准贮存液，储存于冰箱中可永久保存，此时酚浓度约为0.01mol/L。使用前将上述的酚标准贮存液用蒸馏水稀释25倍，即得到0.4mmol/L酚标准溶液。

四、操作步骤

1．酸性磷酸酯酶的提取 （1）材料处理

将绿豆芽掐去根和叶得绿豆芽茎，称取50g的绿豆芽茎，在研钵中彻底研碎，室温

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静臵30min，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。

（2）离心

将滤液移至2支离心管中，平衡后放入离心机中，以4000r/min的速度离心20min。 （3）酶液回收

将离心管中大部分上清液转移至量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后转移至三角瓶中，做好标记，用塑料薄膜密闭，作为?原酶液?在冰箱中保存备用。

2．酸性磷酸酯酶酶活力的测定 （1）标准曲线的制作

取试管6支，编号，空白为0号，按照下表操作。

以0号试管为空白，在可见分光光度计上680nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680作为横坐标，酚标准溶液的体积（mL）为纵坐标作一标准曲线，此曲线应是一条直线。

0.4mmol/L酚标准溶液（mL） 0 0 1 0.1 0.2mol/L、pH5.6乙酸盐缓冲液（mL） 1 0.9 1mol/L碳酸钠溶液（mL） 5.0 Folin-酚试剂（mL） 0.5 A680值 0 5.0 0.5 0.5 0.5 5.0 5.0 0.8 0.7 2 0.2 3 0.3 4 0.4 0.6 5.0 0.5 摇匀，35°C保温显色10min以上 0.5 5.0 0.5 5 0.5 （2）酶活力测定

取2支试管，按下表编号和操作。

5mmol/L磷酸苯二钠溶液（mL） 酶液（35°C预热过的，mL）,一加入就计时 Folin-酚稀溶液（mL） A680值 0.5 1‘号试管 0．5 35°C预热2min 0 0‘号试管 0．5 精确反应10min,加入1mol/L碳酸钠溶液5mL 0.5 0’号试管加入酶液0.5mL 摇匀，35°C保温显色10min以上 0 0.5 用可见分光光度计测1‘号试管在680nm处光吸收值A680,注意加样顺序要正确，否

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则不能显色。

（3）酶活力的计算

用1‘号试管的A680在标准曲线上查出其在对应的酚标准应用液的体积（V，单位mL），根据公式：

酶活力=2×0.4×V×1000/10，可计算出1mL酶液中所含有的酶的活力。 五、实验报告

试管 A680 V（mL） 1mL酶液的活力 0 0 0‘ 0 1 2 3 4 5 1‘ 六、注意事项

1．酶促反应应保持在温和条件下进行，避免反应液剧烈搅拌或振荡。 2．实验前要设计好试管的加样顺序，确保反应时间的准确性。 3．酶促反应的加样顺序要正确，否则无法显色。

实验十 溶菌酶的制备及活力测定

一、实验目的

1．掌握从鸡蛋清中制备溶菌酶的原理和方法（等电点沉淀和盐析法）； 2．掌握用菌悬液测定溶菌酶活力的原理和方法。 二、实验原理

溶菌酶能催化革兰氏阳性菌（如溶壁微球菌，micrococus lysodeikticu）细胞壁粘多糖水解，因此可以溶解以粘多糖为主要成分的细菌细胞壁，溶菌酶对革兰氏阳性菌作用后，细胞壁溶解，细菌解体，菌悬液的透明度增加。透明度增加的程度与溶菌酶的活力成正比。因此，通过测定菌悬液透光度的增加（650nm波长）来测定溶菌酶的活力。

三、试剂与器材 1．器材

试管及试管架，恒温水浴箱，电动搅拌器，大烧杯，玻璃缸，显微镜，离心机，恒温箱，三角瓶（250mL），振荡器等。

2．试剂和材料

①鸡蛋清（pH不低于8.0）1000mL; ②氯化钠；

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③1mol/LNaOH溶液； ④1mol/L盐酸溶液； ⑤五氧化二磷； ⑥丙酮；

⑦溶菌酶晶体（5%无形溶菌酶溶液10mL，加NaCl0.5g，用NaOH调节pH至9.5-10.0，溶液放臵4°C冰箱，溶菌酶即结晶出来）；

⑧菌体培养基（琼脂20g、牛肉膏5g、葡萄糖1g、NaClg5、蛋白胨10g，用蒸馏水稀释至1000mL，分装到250mL三角瓶中，每瓶装入100mL，15磅高压灭菌20min。

⑨0.1mol/L(pH6.2)磷酸盐缓冲液； ⑩乙二胺四乙酸钠。 四、操作步骤 1．溶菌酶的制备

（1）取两个新鲜鸡蛋清（pH不低于8.0），搅拌5min左右，使蛋清稠度均匀，用3层纱布过滤，去除脐带块等，测量其体积，记录。

（2）按100mL蛋清加5gNaCl的比例，向蛋清中慢慢加入NaCl细粉，边加边搅拌，使氯化钠及时溶解，避免NaCl沉于容器底部，否则可使局部盐浓度过高而产生大量白色沉淀。

（3）再加入少量溶菌酶结晶作为晶种，臵于4°C冰箱中，1周后观察，待见到结晶后，取结晶一滴于载玻片上，用100倍观察，记录晶形。

（4）结晶于布氏漏斗上过滤收集，再用五氧化二磷真空干燥，或在布氏漏斗上用丙酮洗涤脱水，最后用五氧化二磷真空干燥，并放一盘石蜡屑吸收丙酮。

2．酶活力测定 （1）底物制备

将溶壁微球菌菌种接种于斜面培养基上，28°C培养4h，用蒸馏水将菌体刮洗下来，若掺杂有培养基则用纱布过滤除去，以4000r/min离心10min，离心收集滤液中的菌体，倾去上层清液，用蒸馏水洗菌体数次，离心除去混杂的培养基，收集菌体，用少量水悬浮，冰冻干燥，或将菌体涂于下玻璃板上，成一薄层，冷风吹干。菌粉于干燥器中保存。

（2）底物的配制

称取干菌粉5mg，加入少量0.1mol/L(pH6.2)的磷酸盐缓冲液，在匀浆器内研磨

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2min，倒出，稀释至20-2mL，此时菌悬液在650nm波长处的透光度读数应在20-30%范围内。

（3）酶液的制备

酶的贮存液：准确称取5mg溶菌酶结晶样品，加入0.1mol/L（pH6.2）的磷酸盐缓冲液，使每mL缓冲液含有溶菌酶样品1mg；

酶的应用液：临用前再将酶的贮存液稀释20倍，使其浓度达到50μg/mL，甚至可稀释至10-20μg/mL。

（4）测定酶的溶解能力

先将底物（菌悬液）及酶的应用液分别臵于25°C恒温水浴中约10-15min，再将菌悬液摇匀，吸取4mL，放入比色杯中，于650nm波长处读出透光度，此即为零时读数，然后吸取0.2mL酶的应用液（相当于10μg酶量）加到比色杯中，迅速混合，同时用秒表计算时间，每隔30s读一次透光度，到120s时共计下5个透光度读数。以时间为横坐标、透光度为纵坐标作图。最初一段时间（30s）左右因稀释会有假象，数据不很可靠，因此计算时应取直线部分。

（5）测定酶样品的蛋白质含量

用Folin-酚法测定酶样品的蛋白质含量，标准蛋白质可用凯氏定氮法测其含量。 五、实验报告

酶活力可用经下两种方法表示。 （1）酶活力单位

25°C、pH6.2、波长于650nm时，每分钟引起菌悬液透光度上升0.02%的酶量为一个酶活力单位。

每mg的酶活力单位数计算式为：

U/mg酶=直线部分透光度增加（%）/酶样品的质量（μg）×测定时间（min×0.02%）

另一种表示方法是酶活力单位数表示为A，其式中的t40为透光度增加40%所需时间（min），即

A=106/ t40 （2）酶的比活力

溶菌酶的比活力=A/P，其中P为蛋白质单位数，当样品与浓度为0.167mg氮/mL的

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蛋白质溶液给出的颜色相同时，样品所含的蛋白质的量为1个蛋白质单位。

实验十一 果胶酶的固定化

一、实验目的

1．了解用包埋法固定果胶酶的原理； 2．掌握用包埋法固定果胶酶的方法。 二、实验原理

共价偶联法是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是报道最多的酶的固定化方法之一。共价偶联法所用的载体主要有天然有机载体、无机载体、合成聚合物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有氨基、羟基、巯基、咪唑基、酚基等。

要使载体与酶形成共价键盘，首先必需使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活性基团，然后此活性基团与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。

用共价偶联法制备的固定化酶，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，可以连续使用很长时间。但载体活化的操作复杂，而且由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化酶，酶活回收率一般为30%左右，甚至会影响底物的专一性，或影响酶的空间构象而影响酶的催化活性，使酶的性质发生变化。本实验以壳聚糖为材料制备载体，用戊二醛活化载体，采用偶联法固定果胶酶。

三、试剂与器材 1．仪器及用具

两孔水浴箱，六孔水浴箱，天平，瓷盘，三角瓶，烧杯（50mL，250mL），试管架，试管，量筒（50mL，100mL）,滴管，移液管架，移液管（2mL,5mL），注射器，吸耳球，洗瓶，纱布，玻棒，药匙，标签纸，吸水纸，剪刀等。

2．试剂

乙酸-乙酸钠缓冲液（0.2mol/L, pH4.4），磷酸盐缓冲液（0.1mol/L,pH7.5），3,5-二硝基水扬酸，NaOH，冰醋酸，丙三醇，戊二醛，95%乙醇，浓盐酸，果胶酶（300mL），果胶（100mL）。

四、操作步骤 1．载体的制备

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①取壳多糖4g加入180mL的3%的乙酸中，加20mL甘油搅拌溶解，制得壳多糖溶液。 ②每组配制40mL 4%的NaOH溶液，用注射器吸取约10-15mL壳多糖溶液滴入4%NaOH溶液中，即得到壳多糖的微珠。静臵10min，用蒸馏水清洗6次，每次5min，水洗至中性，最后用pH7.5的磷酸盐缓冲液浸洗一次（3min）。

2．载体的活化

倾去磷酸盐缓冲液，载体中加入4%戊二醛溶液约40mL，过夜或者室温活化5h。 3.偶联

①水洗除去游离的戊二醛（5min×5次）。

②加入0.25%果胶酶的水溶液20mL，覆盖活化载体，4°C过夜，中间摇几次。 4．酶活性检测

①水洗除去游离酶（2min×4次）。

②取两支试管编号后各加入完整的因定化酶颗粒10粒，再按下表加样。

试剂 乙酸乙酸钠（pH4.4） 0．4%果胶 反应温度 反应时间 对照管 1mL 2mL 100°C 10min 反应管 1mL 2mL 45°C 2h ③中取两支试管分别加入对照管和反应管上清液各1mL，再分别加入3，5-二硝基水扬酸2mL，沸水浴保温5min，观察颜色变化，记录并分析。

④再取两支试管分别加入对照管和反应管上清液各1mL，分别各加入2mL 95%乙醇（含1%的浓盐酸），摇匀，静臵15min，观察现象，记录并解释。

五、思考与分析

1．制备载体的关键步骤是什么？ 2．载体为什么要活化？

实验十二 固定化酶活力测定

一、实验目的

1学习和理解尼龙固定化木瓜蛋白酶基本原理； 2．掌握固定化木瓜蛋白酶的活力测定方法； 3．了解固定化酶比水溶性酶具有的优点。 二、实验原理

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通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶的载体结合，固定在载体上，在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶 的固定化方法有吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法。本实验中的尼龙固定木瓜蛋白酶属交联法，尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH基团，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO由与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙（载体）-戊二醛（交联剂）-酶，即尼龙固定化酶。

三、试剂与器材 1．仪器

电力搅拌器（机），离心机，紫外分光光度计，磁力搅拌器，恒温水浴锅，冰箱 2．器材

市售木瓜蛋白酶，尼龙布（86）或（66）：140目并剪成3cm×3cm。 3．试剂

18.6% CaCl2溶液，甲醇溶液，3.65mol/L HCl溶液，0.2mol/L硼酸缓冲液(pH8.5)，5%戊二醛（以0.2mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制），0.1mol/L硼酸缓冲液(pH7.8)，木瓜蛋白酶溶液（1mg/mL），0.5mol/L NaCl溶液，0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2），激活剂[用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L、EDTA菜1mmol/L的混合液]，1%酪蛋白[用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制]，10%三氯乙酸(TCA)。

四、操作步骤 1．固定化酶的制备

①取5块尼龙布洗净、凉干。用含18.6êCl2和18.6%水的甲醇溶液在室温下保温10min左右，并轻轻搅拌至尼龙膜发粘，取出用水冲去污物，用吸水纸吸干。

②尼龙布用3.65mol/L HCl在室温水解45min。 ③尼龙布用5%戊二醛在室温下浸泡偶20min。

④取出尼龙布，用0.1mol/L硼酸极地冲液反复洗去多余的戊二醛，吸干，立即用酶液（0.5-1mg/mL）在4°C下固定3.5h(酶液用量每块布不宜超过0.8mL)。

⑤从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/L NaCl(用0.1mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液配制)洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。

2．酶活力测定

①溶液酶活力测定。取0.1mL酶液，加入2.4mL激活剂，37°C预热10min，加入

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37°C预热的1%的酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入10%三氯乙酸1.5mL终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加入酪蛋白溶液，其他与测定管相同。离心（4000r/min,5min）或过滤，上清液于280nm波长处测定光吸收值。

在上述条件下，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U），以下同。 ②残余酶活力测定同溶液酶活力测定。

③固定化酶活力测定取一块尼龙布固定化酶，加入2.5mL激活剂，其余步骤与溶液酶活力测定相同。

五、数据计算

①活力回收=固定化酶总活力/溶液酶总活力×100%；

②相对活力=固定化酶总活力/（溶液酶总活力-残留酶活力数）×100% 六、注意事项

1.尼龙布的处理是实验成功的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。 2．固定化酶液浓度最好为0.5-1.0mg/mL，每一个块尼龙布用量不宜超过0.8mL。 3．酶活力测定的反应时间一定要准确。

实验十三 胆绿素还原酶的修饰与活性基团的鉴定

一、实验目的

1．掌握酶化学修饰的基本原理和方法； 2．熟悉判断酶的必须基团的方法。 二、实验原理

1.掌握酶化学修饰的基本原理和方法； 2．熟悉判断酶的必需基团的方法。 二、实验原理

酶分子中的许多侧链基团可以被化学修饰。这种修饰可以帮助了解哪些基团是保持酶活性所必需的，哪些基团对维持酶的催化反应并不重要。当化学修饰试剂与酶分子上的某种侧链基团结合后，酶的活性降低或者丧失，表明这种被修饰的残基是酶活性所必需的。

酶分子中有许多基团，如巯基、羟基、咪唑基、胍基、氨基和羧基等可被共价化学修饰。可以用来进行化学修饰的试剂也很多，如二-硝基苯甲酸(DTNB)和N-乙酸马酰亚

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胺(NEM)是巯基的修饰剂，可以用来鉴定半胱氨酸残基是否是酶活性所必需的。磷酸吡哆醛(维生素B6)可以与赖氨酸残基起反应；2，3-丁二酮(2，3-BD)则可以和精氨酸残基起反应。本实验以胆绿素还原酶为材料，分别以DTNB、NEM、磷酸吡哆醛和丁二酮为化学修饰剂，研究胆绿素还原酶活性所必需的残基。

三、实验试剂与器材 1．试剂

(1)胆绿素 浓度配制成2mmol／L； (2)NADPH 浓度配制成10mmol／L； (3)DTNB 浓度配制成0.25mol／L； (4)NEM 浓度配制成0.05mol／L； (5)磷酸吡哆醛 浓度配制成20mmol／L，； (6)2，3-丁二酮 浓度配制成0.115mol／L； (7)胆绿素还原酶

(8)0.01mol／L，pH7．4磷酸盐缓冲液 2．仪器用具

72l型分光光度仪，试管。 四、操作步骤

①酶的测定是在0.01mol／L，pH7．4磷酸盐缓冲液中完成。总体积为4mL，内含5μmol／L胆绿素、100μmol／L NADPH，酶量固定。根据修饰实验的需要，加入不同的修饰试剂。

②在DTNB修饰反应中，向不同的反应试管中分别加入0．00mmo]／L、0．10mmol /L、0．20mmol／L、0．30mmol／L、0．40mmol／L的DTNB。

③在NEM修饰反应中，向不同的反应试管中分别加入0．00mm01／L、0．50mmol /L、1．00mmoI／L、1．50mmol／L、2．00mmol／L的NEM。

④在磷酸吡哆醛修饰反应中，向不同的反应试管中分别加入0．00mm01／L、1．00mmol/L、2．00mmol／L、3．00mmol／L的磷酸吡哆醛。

⑤在2，3-丁二酮修饰反应中，向不同的反应试管中分别加入0．0mmol／L、10．0mmolL、20．0mmol／L、30．0mmol／L的2，3-丁二酮。

⑥在加入各修饰试剂后，于37°C在暗处保温30min，测定450nm处的吸光值来测

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定酶活性变化，判断胆绿素还原酶所必需的基团。

五、思考与分析

1．以修饰试剂浓度为横坐标，以残存酶活性为纵坐标，分别绘制出修饰试剂浓度变化对酶活性的影响。

2．分析胆绿素还原酶活性所必需的基团。

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