跨界融合选育生物脱硫催化剂

跨界融合选育生物脱硫催化剂

石　油　炼　制　与　化　工

2007年6月　　　　　　　　　PETROLEUMPROCESSINGANDPETROCHEMICALS　　　　　第38卷第6期　

跨界融合选育生物脱硫催化剂

沈齐英1,2,赵锁奇1

(1.中国石油大学重质油加工国家重点实验室,北京102249;2.北京石油化工学院化工系)

摘要　采用混合有机硫化合物为限制性底物的驯化方式,从被原油污染土壤中驯化、筛选,分离得到对有机硫具有一定脱除效果的菌株,鉴定为枯草芽孢杆菌亚种;以该菌株和白腐真菌作为出发菌株,通过原生质体融合获得了遗传稳定,可产生孢子,能有效脱硫的融合子。成品油的脱硫实验结果表明,融合子直接应用于油品的脱硫,有较高的脱硫率和较大范围的环境耐受力,的实际应用价值。

关键词:原生质体融合　生物脱硫　催化剂

1　前　言

,。,而且难以,因此迫切需要。

随着生物技术的发展以及石油炼制工业的不断复杂化和尖端化,采用生物技术脱硫越来越为人们所关注,但生物催化脱除石油及产品中硫化合物的技术仍处在研究开发阶段,尚未投入工业化生产。目前的研究主要集中在新菌种的开发,生物催化剂制备、性能的改善,脱硫工艺研究等方面。迄今为止已分离出的脱硫菌种主要包括:假单胞菌(Pseudomonassp.)、红球菌(Rhodococcussp.)、棒杆菌(Corynebacteriumsp.)、短杆菌(Brevibacteri2umsp.)、戈登氏菌(Gordonasp.)、诺卡氏菌(No2cardiasp.)等[1～3]。其中,1989年美国天然气研究所分离得到的Rhodococcusrhodochrous.IGTS8是研究最多的菌种。1998年,JeHwanChang等人分离得到戈登氏菌(Gordinasp.CYKS1),该菌株除了分解二苯并噻吩(DBT)外,还可以分解20种其它有机硫化合物,包括硫醇、亚硫酸盐及噻吩等。2000年,MaghsoudiS等人从石油样品中分离得到一株脱硫棒杆菌(Corynebacteriumsp.P32C1),该菌株对数生长期后期的休止细胞可在30min内完全转化0.5mol/LDBT,与IGTS8相比,P32C1具有更强的脱硫能力。但这些菌株均为遗传稳定性较差、易变异的原核微生物(细菌),且多数以DBT为模型化合物来进行脱硫过程研究,

,这些菌种普遍对DBT,但油品中还含有其它有机硫化合物,包括DBT衍生物(DBTs)、苯并噻吩(BT)及苯并噻吩衍生物(BTs)等。本研究采用跨界原生质体融合技术获得了具有双出发菌株性状、遗传稳定、选择性宽、高活性、可产生孢子,且可同时降解多种含硫化合物的丝状微生物,为实现油品生物脱硫技术工业化提供可使用的生物催化剂。2　实　验2.1　原材料

脱硫菌种来源于天津大港油田被原油污染的土壤中,经过一定方式驯化获得。实验中使用的原油来自于天津大港油田;实验中使用的93号汽油、0号柴油为燕山石油化工公司炼油厂提供。2.2　主要实验仪器

实验中培养基灭菌使用上海申安医疗机械厂的不锈钢手提式灭菌器;菌种的培养使用天津市泰斯特仪器有限公司生产的SH23600A电热恒温培养箱;脱硫菌种的筛选、富集等使用哈尔滨市东明医疗仪器厂生产的HZQ2C恒温空气浴振荡器;菌体的收集使用北京医用离心机厂的LGR1024.2型冷冻离心机;DBT含量的确定使用北京彩陆科学

收稿日期:2006210210;修改稿收到日期:2006212228。作者简介:沈齐英(1963-),女,北京石油化工学院副教授,中国石油大学(北京)2005级博士,现从事生物化工的教学和科研工作。

基金项目:北京市教育委员会科技发展计划项目资助,项目编号KM200610017001。

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第6期　　　　　　　　　　　　　　沈齐英等.跨界融合选育生物脱硫催化剂

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仪器有限公司生产的CL3010高效毛细管电泳液相色谱一体机。2.3　主要试剂

脱硫微生物驯化中使用的混合有机硫化合物苯并噻吩、二苯并噻吩、4,62二甲基二苯并噻吩和苯硫醚均为ACROS公司产品。原生质体融合实验中使用的溶菌酶和蜗牛酶为中国科学院上海生化所产品;使用的青霉素和制霉菌素为ACROS公司产品。测定DBT含量时使用的溶剂正十六烷为德国HALTERMANN公司产品。2.4　主要培养基实验中使用的无机盐培养基、富集培养基、琼脂平板培养基、斜面培养基、基本培养基、完全培养基、再生选择培养基的配方及配制方法见参考文献[4～6]。

鉴别培养基1为基本培养基中加入青霉素(Penicillin,Pc);鉴别培养基2入制霉菌素(Nystatin,Nt);2.5　2.5.1　取5g被原油污染的土壤充分溶于100,从中取出10mL接种于80mL无机盐培养基和10mL原油混合液中(原油中分别加入0.1mmol/L的苯并噻吩、二苯并噻吩、4,62二甲基二苯并噻吩和苯硫醚),混合液置于恒温振荡器中,在120r/min、28℃条件下,振荡培养48h(1个周期);取振荡培养后水相液体10mL,重新接种于80mL无机盐培养液和10mL

条件下,振荡培养12h和24h后,测定有机相中DBT的含量。测得的DBT浓度越小,说明微生物

脱硫效果越好,即为优势脱硫菌种[8]。2.5.4　二苯并噻吩含量的测定　DBT的定量采用高效液相色谱法。高效液相色谱仪的使用条件及方法:调节高效液相色谱检测波长为254nm,流动相为90%的甲醇水溶液,流速为1mL/min,C18色谱柱温为25℃,进样量20μL。在使用条件下,测定各标准DBT溶液浓度对应的峰面积,由色谱工作站绘制成DBT浓度与对应峰面积的标准曲线,通过测定各样品中DBT的峰面积即可确定DBT的量[9]。2.5.5　原生质体融合　(subsp.),以。:活化出发菌株→制备原生质→原生质体再生→检出融合子。凡是在再生选择培养基上呈丝状生长的菌落,将其接种到斜面培养基上4℃冰箱保存[10,11]。2.5.6　出发菌株和融合后丝状生长的菌株抗生素抗性实验及其形态学比较　活化富集出发菌株和融合后丝状生长的菌株,以鉴别培养基制成倾注平板后,置于32℃培养箱内培养观察,在鉴别1、鉴别2和鉴别3培养基内均呈丝状生长菌落可以认为是融合子,将其接种到斜面培养基上冰箱保存备用。2.5.7　融合子的筛选　融合子的筛选方法与2.5.3节相同。

2.5.8　融合子的增殖培养及稳定性检验　融合子

原油混合液中,在120r/min、28℃条件下,振荡培

养48h;如此重复10个周期(480h)[7]。2.5.2　菌种的琼脂平板分离和保存　驯化10个周期结束后,水相液体以画线分离的方法进行琼脂平板分离菌种后,置于30℃恒温培养箱内培养,待琼脂平板培养基长出孤立菌落后,将孤立菌落转接于斜面培养基上,置于4℃冰箱保存备用。2.5.3　脱硫微生物的确定(脱硫菌株的筛选)　菌种的活化富集培养:以无菌操作将保存在斜面培养基上的菌株接种于100mL富集培养基中,置于恒温振荡器内,在120r/min、28℃的条件下振荡培养24h后使用离心机,在6000r/min、15℃条件下离心分离收集菌体,制备0.5g/mL菌悬液备用(0.5g湿菌体悬于1mL无机盐培养基中)。分别取浓度为2.72mmol/L和5.44mmol/L的DBT正十六烷溶液10mL,与90mL0.5g/mL菌悬液混合,置于恒温振荡器内,在120r/min、28℃

活化富集培养后离心分离收集融合子,取0.5g湿

重融合子,接种于100mL富集培养基中,置于恒温振荡器内,在120r/min、28℃条件下振荡培养24h后;离心分离收集富集培养后的融合子,取0.5g湿重融合子,重新接种于100mL富集培养基

内,相同条件振荡培养,收集融合子;如此重复5个周期。每1周期结束后检测融合子的脱硫能力(方法同融合子的筛选),观察融合子脱硫的稳定性。2.5.9　脱硫融合子对成品油中有机硫的脱除实

验　脱硫融合子富集培养后离心收集菌体,将其接种于85mL无机盐培养基和15mL93号汽油混合液中,置于恒温振荡器内,在120r/min、28℃条件下振荡培养12h后,分离油相;将分离获得的油相,与重新接种脱硫融合子的85mL无机盐培养基混合,置于恒温振荡器内,在120r/min、28℃条件下振荡培养12h;如此循环3个周期。同时进行

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以24h为1个周期的平行实验。循环3个周期结束后,测定其有机相的总硫含量,再分别与循环脱硫前总硫含量进行比较,观察融合子对93号汽油中有机硫的脱除能力[12,13]。

将上述实验中的15mL93号汽油更换为0号柴油,观察融合子对0号柴油中有机硫的脱除能力。2.5.10　硫含量的测定　93号汽油和0号柴油中

为:Bacillussubtilissubsp.枯草芽孢杆菌枯草亚种。3.2　出发菌株和融合子的抗生素抗性实验及其形

态学比较

出发菌株和融合子的抗生素抗性实验及其形态学比较结果见表2。由表2可见,白腐真菌与枯草芽孢杆菌通过原生质体融合,获得了具有双出发

菌株的性状,可产生孢子的跨界融合子(RH)。

表2　出发菌株和融合子的抗生素抗性及形态

培养基、性状鉴别培养基1鉴别培养基2鉴别培养基出发菌株

TL23-+---

的总硫含量采用微库仑法测定。微库仑仪操作条件:汽化段温度为600℃,燃烧段温度为800℃,稳定段温度700℃,氮气流量为150mL/min,氯气流量为150mL/min。通过分析硫标准溶液,计算总硫的转化率,消除三氧化硫未参加反应带来的误差;对未知试样进行测定,并进行计算后可求得未知样品中的硫含量。实验中DBT浓度和油品硫含量数据以均值表示,样本数量n为8,对脱硫前后DBT的量进行T检验。当概率p>0.05跨界融合子

(RH)++++++

+-++

白腐真菌

+;-表示出发菌

株在鉴别培养基上不能生长。

差别无统计学意义;当p≤0.05计学意义;当p≤0.意义。T时,p均小于0.3　结果与讨论

3.1　脱硫微生物的驯化、筛选和分离

3.3　融合子的筛选

出发菌株和融合子对DBT的脱硫效果见表3。由表3可见,RH21和RH22对DBT中的硫均有一定的脱除能力,并且随着脱硫时间的延长,RH21和RH22的脱硫能力逐渐增加。虽然RH21和RH22的脱硫性能与TL23差异不显著,但RH21

使用高效液相色谱仪获得DBT的浓度与吸收峰峰面积的关系,绘制标准曲线,得到DBT的工作曲线方程为:y=7.055+0.04x,线性相关系数r=0.999912,线性范围为不大于800μg/g,线性关系较好。

实验经过驯化、分离、筛选获得3株具有一定脱硫能力的菌株,分别用TL21,TL22,TL23表示,其脱硫能力见表1。

表1　脱硫菌株对含DBT培养液脱硫效果

DBT浓度

和RH22为丝状生长微生物,其脱硫稳定性较原核微生物TL23强。

表3　菌株对含DBT培养液的脱硫效果

DBT浓度

脱硫12h后

%47.79041.9146.3236.21034.0036.39

脱硫24h后

mmol L-1

1.002.711.351.152.565.353.052.59

%63.24050.3657.7252.94043.9352.39

菌种　(脱硫前)/DBT浓度/脱硫率,DBT浓度/脱硫率,

L-1mmol L-1mmol

TL23

2.722.722.722.725.445.445.445.44

1.422.711.581.463.475.463.593.46

白腐真菌

RH21RH22TL23

脱硫12h后

DBT浓度/1.822.271.424.004.273.47

%33.8316.5447.7926.4721.5036.21

脱硫24h后

脱硫率,

%42.6525.7363.2440.6326.4752.94

mmol L-1

1.562.021.003.234.002.56

菌种(脱硫前)/

TL21TL22TL23TL21TL22TL23

2.722.722.725.445.445.44

脱硫率,DBT浓度/

L-1mmol L-1mmol

白腐真菌

RH21RH22

3.4　脱硫融合子对成品油中有机硫的脱除实验

脱硫融合子对成品油中有机硫的3周期循环脱除实验结果见表4和表5。由表4和表5可见,RH21和RH22在脱硫12h、3个周期循环后和24h、3个周期循环后,均具有较高的脱硫效果,且24h

由表1可见,3菌株对DBT中的硫均有一定的脱除能力,其中TL23脱硫效果最好;同时可以看出3菌株随着脱硫时间的延长,对硫的脱除能力逐渐

的脱硫效果明显好于12h的脱硫效果。以上实验结果表明,经过原生质体融合得到的微生物可以直

增加。3菌株均经中国科学院微生物研究所鉴定

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第6期　　　　　　　　　　　　　　沈齐英等.跨界融合选育生物脱硫催化剂

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参　考　文　献

接应用于油品的脱硫。汽油、柴油中含硫有机物种类较复杂,本实验使用的成品油未作任何处理,说明RH21和RH22能脱除多种含硫化合物中的硫,有较大范围的环境耐受能力。

表4　柴油循环脱硫实验

总硫浓度

菌种(脱硫前)/

mg L-1

RH21RH22

129.75129.75

12h

24h

1　KonishiJ,MaruhashiK.Residue345ofdibenzothiophene

(DBT)sulfonemonooxygenaseisinvolvedinC—Sbondcleav2agespecificityofalkylatedDBTsulfones.BiotechnologyLet2ters,2003,25:1199～1202

2　孙志娟,余谟鑫,张心亚等.油品中噻吩类硫化物脱除技术研

总硫浓度/

mg L-131.1352.27

脱硫率,

%76.0159.71

总硫浓度/

mg L-122.4431.64

脱硫率,

%82.7175.61

究进展.化工进展,2005,24(9):1002～1005

3　GuptaN,RoychoudhuryPK,DebJK.Biotechnologyofdesul2

furizationofdiesel:prospectsandchallenges.ApplMicrobiolBiotechnol,2005,66:356～366

4　施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学(第二版).北京:科学出版

注:表中数据为循环3个周期后的结果。表5同。

社,2003.299～341

5　钱存柔.微生物学实验教程.北京:,1999.

205～223

表5　汽油循环脱硫实验

总硫浓度

菌种(脱硫前)/

mg L-1

RH21RH22

138.46138.46

12h

24h

总硫浓度/

mg L-135.7372.00

脱硫率,

%74.1947.99

总硫浓度/

mg L-127.5639.66

脱硫率,

%80.0971.6　史德青,,..()7　.:,2004.231～238,.重油生物脱硫菌的筛选.环境技

,3(2):1～3

4　结　论

(1),9　朱明华编.仪器分析.北京:高等教育出版社,2004.64～97,

183～192

10　陈劲春,尉渤,周代福等.原生质体技术在工业微生物育种中

,筛选、分

离得到3,鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtilissubsp.)。

(2)枯草芽孢杆菌通过与白腐真菌的原生质体融合,获得了具有双出发菌株性状,丝状生长,遗传稳定,可产生孢子,具有一定脱硫能力的融合子。

(3)融合子可以直接应用于油品的脱硫,具有较高的脱硫率,且有较大范围的环境耐受能力,有一定的实际应用价值。

的应用.工业微生物,1997,27(4):34～36

11　TanakaY,MatsuiT,KonishiJ,etal.Biodesulfurizationofbenzo2

thiopheneanddibenzothiophenebyanewlyisolatedRhodococ2cusstrain.ApplMicrobiolBiotechnol,2002,59:325～32812　陈明燕,邹长军,刘宇程等.油品微生物脱硫技术研究进展.石

油与天然气化工,2005,34(1):489～491

13　CarolinaHdelO,AlmudenaA,VictoriaES,etal.Modeling

theproductionofaRhodococcuserythropolisIGTS8biocata2lystforDBTbiodesulfurization:Influenceofmediacomposition.EnzymeandMicrobialTechnology,2005,37(7):157～166

BREEDOFDESULFURATIONBIOCATALYSTWITH

FUSIONOFSTRIDEKINGDOM

ShenQiying1,2,ZhaoSuoqi1

(1.StateKeyLaboratoryofHeavyOilProcessing,ChinaUniversityofPetroleum,Beijing102249;

2.DepartmentofChemicalEngineering,BeijingInstituteofPetro2chemicalTechnology)

Abstract　In

ordertoeffectivelyremovethesulfurcontainingorganiccompoundsfrompetroleum

products,ingsaidstrainandwhite2rotfungiasparentstrainsthroughprotoplastfusion,geneticstablefusinggameteshavingeffectivedesulfurationfunctionwasobtained.Theresultsofbio2desulfurationtestswithgasolineanddieselfuelshowedthatsaidfusionmicroorganismcouldbeusedtoremovethesulfurcontainingorganiccompoundsfrompetroleumproducts,andsaidstrainwasobservedwithrelativelyhighsulfurremovalrateandadaptabilitytowiderangeoftestconditions.KeyWords:protoplastfusion;biodesulfuration;catalyst

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/0h6e.html