生化分离工程期末考试

第一章 绪论

1、生物分离工程：从发酵液或酶反应液或动植物培养液中分离、纯化生物产品的过程。

2、生化分离工程的特点：①目标产物浓度低、杂质含量高；②物料体系复杂——多相，非牛顿流体；③目标产物稳定性差；④分离过程可变性；⑤质量要求高⑥产品价格与产物浓度呈反比

第二章 发酵液的预处理和固液分离

1、预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率。 2、预处理的方法：凝聚和絮凝、加热法、调节悬浮液的PH值、杂蛋白的去处、高价无机离子的去除、助滤剂和反应剂 。

3、凝聚：指在投加的化学物质作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１mm 大小块状凝聚体的过程。机理：1）中和粒子表面电荷 ；2）消除双电层结构；3）破坏水化膜。

4、絮凝：指使用絮凝剂将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。机理：架桥作用。采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。

5、絮凝的影响因素：1.发酵液的性质；2.絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖；3.絮凝剂的分子量；4.pH 控制；5.搅拌速度。 6、混凝：对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好絮凝效果；对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。 7、杂蛋白的去除方法：沉淀法（等电点沉淀法、酸碱调节）、变性法（蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性）、吸附法（加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去）。

8、固液分离的方法：过滤、离心、膜分离、双水相萃取、扩张床吸附。

9、影响发酵液固液分离的因素：1）发酵液中悬浮离子的大小；2）发酵液的黏度（固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。）

10、过滤:借助于过滤介质，在一定的压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。 11、离心技术分类：(1)按分离因子Fr分类：①常速离心机（Fr < 3,000 ）；②中速离心机（Fr = 3,000 — 5,0000）；③高速离心机（Fr≥5,0000 ）；④超速离心机（Fr = 20,000 — 2,000,000）。 (2)按用途分类：①分析性（超速离心机）；②制备性（实验室用、工业用）。 (3)工业应用分类：①管式离心机；②多室式离心机；③碟式离心机；④螺旋卸料沉降离心机；⑤离心过滤

12、离心沉降原理：在重力场中，当一固体微粒通过无限连续介质时，它的运动速度受两种力的影响：一是微粒受到因微粒和流体介质间密度不同而产生的作用力Fg；二是微粒所受到的流体阻力作用Ff。 13、离心机的种类按速度和离心力：

1)常速离心机 ：用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；

2)高速（冷冻）离心机：用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离； 3)超速离心机：用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。

14、超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心。

第三章 细胞破碎与分离

1、细胞破碎技术:利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。

2、细胞破碎方法及其原理

①机械破碎：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。

②物理破碎：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。

③化学破碎：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。 ④酶促破碎：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。

3、选择破碎方法的依据：1.细胞处理量； 2.细胞壁强度和结构；3.目标产物对破碎条件的敏感性；4.碎程度；5.目标产物的选择性释放。

4、包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。 5、高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？

答：①蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀②蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀③蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀④表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态⑤蛋白质自身不稳定。 6、基因工程包涵体的纯化方法：收集菌体细胞 → 细胞破碎 →包涵体的洗涤→目标蛋白的变性溶解 →目标蛋白的复性。 7、包涵体获得几种常见的工艺路线

(一)：机械破碎→ 离心提取包含体 → 加变性剂溶解 → 除变性剂复性

特点:是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。 （二）：机械破碎 → 膜分离获得包涵体 → 加变性剂溶解包含体 → 除变性剂复性 特点：应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。优点：封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开，而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。 （三）：化学破碎→ 离心除细胞碎片→ 除变性剂复性

优点：用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。缺点：是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。

第四章 沉淀法

1、沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。

2、沉淀法基本原理：采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。

3、沉淀法的分类：根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：①盐析法；

②等电点沉淀法；③有机溶剂沉淀法；④非离子型聚合物沉淀法；⑤聚电解质沉淀法；⑥成盐类复合盐沉淀法；⑦亲和沉淀法；⑧选择性变性沉淀法。

4、沉淀法操作步骤：①加入沉淀剂②沉淀剂的陈化，促进粒子生长③离心或过滤，收集沉淀物。

5、盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。机理：（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集；（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域；（3）中和电荷，减少静电斥力。

6、硫酸铵饱和度：250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度。 7、盐析的影响因素：①pH值；②温度；③蛋白质浓度；

8、有机溶剂沉淀法：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。

9、有机溶剂沉淀法机理：①降低溶剂介电常数；②破坏水化膜；③相反力，疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。

10、乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 11、选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。

第五章 膜分离技术

1、膜分离技术：用半透膜作为选择障碍层，利用膜的选择性，以膜的两侧存在的能量差作为推动力，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。

2、截留分子量：微滤 0.02～10μm；透析 3000～ 几万Dalton；超滤 50 nm～100 nm或5000～50万Dalton；纳滤 200～1000Dalton或1nm；反渗透 200Dalton。 3、膜材料的特性：对于不同种类的膜都有一个基本要求：①耐压：膜孔径小，要保持高通量就必须施加较高的压力，②耐高温:高通量带来的温度升高和清洗的需要；③耐酸碱：防止分离过程中，以及清洗过程中的水解；④化学相容性：保持膜的稳定性；⑤生物相容性：防止生物大分子的变性；⑥成本低。

4、表征膜性能的参数：①截断分子量；②水通量；③孔的特征；④pH适用范围；⑤抗压能力；⑥对热和溶剂的稳定性等。

5、影响截留率的因素：分子形状；吸附作用；浓差极化作用；温度/浓度；错流速度；pH、离子强度影响蛋白质分子构型，影响?。

6、水通量：纯水在一定压力(0.35MPa) ，温度(25℃)下试验，透过水的速度L / h?m2。JW = W / A t

7、微滤、超滤、纳滤、反渗透相同点：①以膜两侧压力差为推动力；②按体积大小而分离；③膜的制造方法、结构和操作方式都类似。 区别：①膜孔径：微滤0.1－10?m > 超滤0.01－0.1? > 纳滤0.001－0.01?m > 反渗透 小于0.001?m；②分离粒子：微滤截留固体悬浮粒子，固液分离过程；超滤、纳滤、反渗透为分子级水平的分离；③分理机理：微滤、超滤和纳滤为截留机理，筛分作用；反渗透机理是渗透现象的逆过程：④压差：微滤、超滤和纳滤压力差不需很大，0.1－0.6 MPa

8、微滤:以多孔薄膜为过滤介质，压力差为推动力，利用筛分原理使不溶性粒子（0.1-10um）得以分离的操作。操作压力0.05-0.5MPa。

应用:1)除去水/溶液中的细菌和其它微粒；2)除去组织液、抗菌素、血清、血浆蛋白质等多种溶液中的菌体；3)除去饮料、酒类、酱油、醋等食品中的悬浊物、

微生物和异味杂质。 9、超滤:是以压力为推动力，利用超滤膜不同孔径对液体中溶质进行分离的物理筛分过程。

应用: 1)蛋白、酶、DNA的浓缩；2)脱盐/纯化；3)梯度分离；4)清洗细胞、纯化病毒；5)除病毒、热源。

10、反渗透：利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂而截留离子物质性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。

11、反渗透中溶剂和溶质是如何透过膜的，在膜中的迁移方式如何？

答：溶解扩散模型，优先吸附模型（溶解扩散模型适用于均匀的膜，能适合无机盐的反渗透过程，对有机物优先吸附－毛细孔流动模型比较优越。） 12、溶解－扩散模型 （无孔学说）：膜是均匀的，无孔，水和溶质分两步通过膜： 第一步：首先吸附溶解到膜材质表面上；第二步：在膜中扩散传递(推动力为化学位梯度)，扩散是控制步骤，服从Fick定律。 13、优先吸附-毛细孔流动模型（有孔学说）：优先被吸附的组分在膜面上形成一层吸附层，吸附力弱的组分在膜上浓度急骤下降，在外压作用下，优先被吸附的组分通过膜毛细孔而透过膜。与膜表面化学性质和孔结构等多种因素有关。 14、纳滤：分离范围介于反渗透和超滤之间，能截留透过超滤膜的那部分有机小分子，透过无机盐和水。

15、纳滤膜的特点：1）纳滤膜的截留率大于95%的最小分子约为１nm,故称之为纳滤膜；2）从结构上看纳滤膜大多是复合膜，即膜的表面分离层和它支撑层化学组成不同。其表面分离层由聚电解质构成；3）能透过一价无机盐，渗透压远比反渗透低，故操作压力很低。

16、纳滤的应用：①小分子量的有机物质的分离；②有机物与小分子无机物的分离；③溶液中一价盐类与二价或多价盐类的分离；④盐与其对应酸的分离。 17、浓差极化：膜分离过程中，膜面浓度高于主体浓度的现象。

18、浓差极化 - 凝胶层模型：①当发生浓差极化后，膜面上浓度 Cw大于主体浓度Cb，溶质向主体反扩散；②当溶质向膜面的流动速度与反扩散速度达到平衡时，在膜面附近存在一个稳定的浓度梯度区，这一区域称为浓度极化边界层；③在边界层中取一微元薄层，对此微元薄层作物料衡算。推导边界层形成后，通量与Cw及Cb的关系。

19、影响膜过滤的各种因素：1.压力：在超滤中压力升高引起膜面浓度升高，则透过膜的溶质也增大，因而截留率减小；2.浓度；3.温度，在超滤或微滤中，一般说来，温度升高都会导致通量增大，因为温度升高使粘度降低和扩散系数增大；4.流速,根据浓差极化-凝胶层模型,流速增大,可使通量增大；5.其它因素，在反渗透中特别要注意不要使溶解度小的溶质析出，膜过滤含胶体粒子，以免膜堵塞。 20、膜的污染：是指处理物料中的微粒，胶体或溶质大分子与膜存在物理化学作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附，沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化现象。大体可分为沉淀污染、吸附污染、生物污染 。

21、防止膜污染的方法：①进料液的预处理：预过滤、pH及金属离子控制；②选择合适的膜材料：减轻膜的吸附；③改善操作条件：加大流速。

22、膜污染的清洗方法：物理法：海绵球擦洗、热水法、反冲洗和循环清洗；化学法：（选择清洗剂要注意三点：1.要尽量判别是何种物质引起污染；2.清洗剂要

不致于对膜或装置有损害;3.要符合产品要求。）

23、化学法常用的清洗剂有：NaOH、酸、表面活性剂、氧化剂、酶、有机溶剂 24、膜污染的清洗方式:利用膜的不对称性和膜组件的结构特点进行清洗。

第六章 溶剂萃取法

思考题：1.将青霉素由水相萃取到丁酯相中，其pK=2.75，萃取条件：pH=2.5，T=10℃，VF∶VS = 1∶1，测得萃取前发酵液（水相）效价20000 u/ml，平衡后废液效价645.2 u/ml，求

pH － pK

分配系数K和K0？弱酸的表观分配系数：K=K0 /(1 ＋10 )。弱酸的表观分配系数： K=K0

pK － pH

/(1 ＋10 )

2.为什么青霉素在酸性（pH≤2.5）条件下，而红霉素却要在碱性（pH≥9.8）条件下才能被萃取到丁酯中去呢？ 答：（1）根据表观分配系数公式可知，弱酸的表观分配系数：K=K0 /(1 ＋10 pH － pK )弱酸的表观分配系数： K=K0 /(1 ＋10 pK － pH )。对于弱酸：pH< pK 时，分配系数大，对于弱碱：pH> pK 时，分配系数大。

（2）不同pH条件影响弱电解质电离，从而影响分子的极性，根据相似相溶原则，在弱极性的丁酯中极性小的分子溶解度比水中大

酸碱性 pHpK

青霉素 红霉素 弱酸性(2.75) 弱碱性(9.4) 游离分子 “+” “–” 游离分子

根据相似相溶原则，在弱极性的丁酯中游离分子极性小，溶解度比水中大，故从水相转入丁酯相中，而发酵液中存在的其它杂质由于极性情况与抗生素不同，故很少进入丁酯中，这样就达到一定程度的纯化。酸性物质：pH > pK时，主要以负离子存在；pH < pK时，主要以游离分子存在；pH ＝ pK时,两种形式各占50％ 生化物质 酸性 碱性 杂 质 碱性(pK碱杂>pK生) 酸性(pK酸杂pK生) 萃取操作条件的控制 萃取时 杂质自然除去 pK酸杂 < pH < pK生 萃取时无法去除 反萃取pK酸杂>pH > pK生 萃取时杂质自然除去 pK碱杂 > pH > pK生 萃取时无法去除 反萃取pK碱杂 pK生) 碱性(pK碱杂

3、乳化：水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。这样形成的分散体系称乳浊液。

4、乳浊液的破坏措施：物理法：离心、加热，吸附，稀释；化学法：加电解质、其他表面活性剂。

5、乳浊液稳定性和下列几个因素有关：①界面上保护膜是否形成；②液滴是否

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