MSC综述new

间充质干细胞研究进展及其在血液系统疾病中的临床应用

乔淑凯 任汉云 石永进

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的一类非造血系统多能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，现已证实MSCs具有很强的抗炎和抑制多种免疫细胞的能力，并能够诱导外周免疫耐受。此外，MSCs还表达多种趋化因子受体，通过炎性趋化因子或细胞因子迁徙到炎症部位，在局部发挥治疗作用。MSCs主要有以下特点：1、MSCs的组织来源丰富、取材方便，可以从骨髓、脂肪、胎盘、脐血等多种组织中分离；2、MSCs容易进行体外扩增，在短时间内就可以得到治疗所需细胞数量；3、MSCs具有免疫豁免特性，低免疫原性使其能够逃避受者免疫系统反应，使MSCs供者来源几乎无限制性；4、MSCs不表达MHC II类分子和仅表达低水平MHC I类分子，几乎无被排斥的风险，是一种理想的异基因细胞治疗载体；5、MSCs具有迁徙和归巢能力，能使临床应用无创性手段达到全身细胞治疗目的。因此，MSCs在同种异体免疫、自身免疫性疾病治疗和细胞缺损性疾病中有广阔的应用前景。本文就MSCs生物学特性、免疫抑制机制以及在血液系统疾病中的应用做一综述。 一、间充质干细胞的生物学特性及表面标记

MSCs最早由Friedenstein等在上世纪60年代从骨髓基质细胞中分离，由于其具有自我更新和多向分化潜能，1991年Caplan首次提出骨髓来源的基质细胞具有干细胞特性并将其命名为MSCs。最初的MSCs细胞特指来源于骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)，目前MSCs概念已延伸至多组织细胞来源，在脂肪、胎盘、子宫内膜、肝脏、脐血、羊水、牙髓等多种组织中都能够分离出。MSCs在体外培养时具有塑料粘附和生成纤维母细胞样集落形成单位（colony forming unit fibroblasts，CFU-F）的能力。在一定培养条件下，MSCs除具有分化为中胚叶来源细胞（如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞等）潜能外，还可以突破胚系壁垒，跨系分化为肝细胞、神经样细胞和星形胶质细胞等的能力。

MSCs表面标记呈异质性，缺乏公认的特异性抗原标记，可能与MSCs的种属差异、组织来源和培养条件的不同有关。目前多数研究认为MSCs不表达造血干组细胞表面标记(CD34)、单核巨噬细胞系标记(CD14)、淋巴细胞系标志(LFA-1,

作者单位：100034 北京大学第一医院血液科 通信作者：任汉云

Email：renhy0813@ 163.com

基金资助项目：国家自然科学基金 30940030和81070448

CD11a)、白细胞共同抗原（CD45）、红细胞表面标记（血型糖蛋白A)和内皮细胞标记(CD31)，以及 CD11 b和HLA-DR等抗原标记，而是表达CD73、CD90、CD105 、CD44和CD29等表面标记。为了避免各研究之间的不均一性，2006年国际细胞治疗协会定义了间充质干细胞的最低标准[1]（见表1）。

表1 间充质干细胞的最低标准

项目 特性

培养特性 在标准培养条件下有粘附塑料的特性

免疫表型 阳性表达（≥95%） 阴性表达（≤2%） CD73 CD14或CD11b CD90 CD19或CD79a CD105 CD34 CD45 HLA-DR

体外分化 在特定刺激下，细胞可分化为骨细胞、脂肪细胞和成软

骨细胞

二、MSCs免疫抑制功能机制 1、MSCs激活及分泌的细胞因子

MSCs免疫抑制功能的发挥需要被预先激活，体内实验证实，一些免疫细胞分泌的前炎性细胞因子，如IFNγ单独或联合TNFα、IL-1α和IL-1β等细胞因子可以激活MSCs，使MSCs发挥免疫抑制作用。Polchert等[2]在GVHD模型鼠中发现，敲除IFNγ基因受者鼠T细胞对MSCs治疗无反应，并最终死于GVHD。此外， IFNγ受体1缺乏小鼠的MSCs不具有免疫抑制活性，也进一步证实了IFNγ在激活MSC中的重要性。

虽然MSCs可以通过与靶细胞直接接触，在免疫抑制中发挥一定作用，但MSCs免疫抑制作用主要是通过释放一些可溶性细胞因子来实现。MSCs通过分泌某些可溶性分子或上调某些细胞因子，使之作用于靶细胞，从而发挥免疫抑制作用。吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）是MSCs所分泌的一种重要分子，研究表明，在IFNγ刺激作用下，IDO使色氨酸代谢为犬尿氨酸，引起局部色氨酸缺乏和毒性代谢产物蓄积，IDO主要通过局部色氨酸代谢产物蓄积来发挥作用[3]。Opitz等

[4]

发现人MSCs缺乏IFNγ受体，仍能诱导生成IDO，是人MSC可以通过表达的Toll

样受体，自分泌IFNβ，依赖蛋白激酶R信号通路诱导IDO生成，发挥其免疫调节

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活性。鼠MSCs缺乏IDO活性，主要通过诱导一氧化氮合成酶（iNOS）来生成一氧化氮（NO），NO是一种气态的生物活性物质，可以影响巨噬细胞和T细胞功能，NO在T细胞增殖抑制中发挥重要作用。鼠MSCs被IFNγ 、TNFα、IL-1α等激活后，可以诱导生成iNOS。研究证明，iNOS基因敲除鼠MSCs抑制T细胞增殖能力下降，人MSCs表达iNOS mRNA水平很低，因此几乎不分泌NO[5]。综上，MSCs在不同的物种通过不同的生物分子发挥免疫抑制作用，人MSCs主要通过IDO分子发挥作用，而鼠MSCs则以NO为主导。

前列腺素E2(PGE2)在MSCs免疫抑制活性中也发挥一定作用，PGE2是花生四烯酸的代谢产物，有很强的免疫抑制作用，抑制T细胞有丝分裂和IL-2的生成，是一种可诱导Th2活化的辅助因子。MSCs被激活后，生成PGE2能力增强，此时如用特异性抑制剂阻断PGE2，可以使T淋巴细胞增殖恢复。此外，MSC来源的PGE2还可以通过刺激IL-10生成，作用于巨噬细胞下调其表面的MHC-II分子，并阻碍单核细胞向树突状细胞分化（DC）[6]。

IL-6是MSC细胞分泌的另一种因子，主要作用于单核细胞向树突状细胞的转化过程，降低DC对T细胞的抗原呈递，抑制T细胞活化。IL-6还可以延缓淋巴细胞和中性粒细胞的凋亡[7]。最近有研究报道，MSCs和活化T细胞接触可以诱导IL-10生成，MSCs经IL-10刺激后分泌可溶性HLA-G5，HLA-G5可以抑制T细胞增殖、NK细胞的溶细胞活性和CTL细胞毒作用，并促进调节性T细胞（Treg）的生成[8]。

半乳凝集素（galectins）是β-半乳糖连接蛋白，属于凝集素家族之一，MSC在mRNA和蛋白水平高表达galectin-1 和galectin-3，并且将其分泌到细胞膜外。研究表明，用siRNA技术抑制galectin-1和galectin-3表达，能消除MSC对T细胞的抑制作用。此外，Galectin-1和galectin-还可以间接对DC细胞实施影响，诱导免疫耐受，但并不影响NK细胞功能[9]。

其它一些生物调控分子，如转化生长因子β1、肝细胞生长因子、血红素氧化酶1和白血病抑制因子等，都可以由MSC产生并发挥免疫抑制活性[10]。当然，这些生物调控因子任何一种单独作用并不能使T细胞增殖完全停止，说明MSC介导的免疫抑制是多种生物调控分子在时间和空间上联合作用的结果。 2、MSCs对免疫细胞的抑制作用

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MSCs与T淋巴细胞

MSCs可以影响多种T细胞功能，其中最主要是抑制活化CD4+ T h细胞和CD8+ CTL增殖，MSCs使活化T细胞阻抑在细胞G0/G1期[11]，但并不导致T细胞凋亡。除抑制活化T细胞增殖外，MSCs还可以下调T细胞Fas受体和Fas配体，抑制内源性蛋白酶导致的细胞死亡，来延长未活化T细胞的生存[12]。MSCs 可以诱导Th 1/Th 2 平衡朝向抗炎的Th 2倾斜，使CD4+ Th1细胞生成IFNγ减少，CD4+ Th17细胞释放IL-17减少，使CD4+ Th2细胞释放IL-4增加。此外，MSCs还可以抑制CTL的细胞毒作用[8]。更重要的是MSCs 可以促进功能性的CD4+ CD25+FOXP3+（Treg）或CD8+调节性T细胞生成，研究发现，在混合淋巴细胞反应体系中，将人MSCs与na?ve T细胞共培养，可以显著增加体系中Treg细胞数量，Treg细胞在抑制免疫应答和诱导免疫耐受方面发挥重要作用，通过直接接触或分泌IL-10和TGF-β的方式来抑制其它T细胞的增殖[13]。 MSCs与B细胞

MSCs可以影响B细胞的增殖、凋亡、趋化和免疫球蛋白生成。研究发现MSCs抑制B细胞增殖是通过抗免疫球蛋白抗体、可溶性CD40配体或IL-2和IL-5等细胞因子来实现的[14]。在外源性IFNγ存在下，活化的B细胞对MSCs抑制作用变得敏感，IFNγ发挥抑制性影响与它刺激MSCs生成IDO的能力有关，这反过来又可以抑制效应性T细胞的增殖反应。MSCs通过释放一些细胞因子对B细胞终末分化实施抑制性作用，增加B细胞活性却抑制其增殖，使B淋巴细胞阻抑在G0/G1期[15]。也有研究报道MSCs促进na?ve B细胞增殖和分化为免疫球蛋白分泌细胞，明显增强记忆性B细胞增殖分化为浆细胞能力。这种研究结果的差异可能与纯化细胞方法、实验条件和分析时间的不同有关。 MSCs与DC细胞

髓系DC细胞是抗原呈递能力最强的细胞，在免疫应答和免疫耐受过程中发挥重要作用。不成熟的DCs在成熟过程中获得共刺激分子表达，并上调MHC- I类和MHC- II分子表达，同时也逐渐表达CD11c、CD80、 CD83 和CD86等细胞表面标记。Nauta等[16]通过体外实验发现，活化的MSCs通过分泌IL-6和PGE2抑制单核细胞成熟和CD34+造血祖细胞转化为DCs，减少DCs表面MHC- II分子和共刺激分子表达，直接阻碍DC细胞成熟，引起IL-12和TNFα生成减少，降低其对

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T细胞的抗原提呈能力。 MSCs与NK细胞

NK细胞是一种具有细胞毒活性的杀伤细胞，其主要靶向作用于缺乏HLA- I分子表达的细胞。NK细胞的杀伤作用依赖于其表面激活或者抑制性受体与靶细胞表面HLA分子交联后信号转导平衡的改变，MSC通过下调激活性受体NKp30和NKG2D，抑制NK细胞激活和对靶细胞杀伤作用。Sotiropoulou等[17]证实MSCs能抑制IL-2或IL-15诱导的NK细胞增殖，减少IFNγ生成并抑制其对表达HLA- I分子靶细胞的细胞毒作用，这些免疫抑制作用的发挥依赖MSCs与靶细胞的直接接触或通过释放一些可溶性细胞因子（如TGFβ1、HLA-G5和PGE2）来实现，说明MSC对NK细胞的抑制作用是通过多种不同作用机制来实现的。 MSCs与中性粒细胞

中性粒细胞是固有免疫系统重要成员之一，主要通过产生活性氧来杀伤病原微生物，MSC可以通过分泌IL-6来延缓中性粒细胞凋亡，凋亡延迟有助于维持中性粒细胞池水平，使其在感染早期即能迅速发挥作用[18]。Nemeth[19]等发现，在机体发生败血症时，体内增加的LPS和TNFα可以刺激MSCs分泌高水平的PGE2，来调控单核细胞/巨噬细胞的比例，并产生大量的IL-10。IL-10的释放可以阻止中性粒细胞迁徙进入组织而引起氧化损伤，从而减轻多脏器的功能损害。上述研究结果说明：MSCs可以调控固有免疫反应应答，阻止败血症进展所致的多脏器衰竭而改善生存。

综上可知，MSCs经激活后可分泌IDO、NO 、PGE2、IL-6和HLA-G等可溶性分子，通过这些介质的生成，不仅可以直接或间接作用于DCs、NK细胞和中性粒细胞等，对固有免疫系统进行调控，还可以通过对T、B细胞增殖抑制和功能影响，以及诱导Treg的生成，对适应性免疫系统进行调节，从而来发挥对免疫系统的多重调控（见图1）。

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MSCs与免疫细胞相互作用分化↓MonocyteIL6IL10成熟↓Immature DCIL-6TGFβ1 抗原提呈↓Mature DC凋亡↓NeutrophilIL-6 、PGE2 MSCCD40LNOPGE2galectins PGE2HLA-G5增殖↓NK cell细胞毒↓IL-1β诱导↑ 活性↑

增殖↓Ig生成↓B cell增殖↓T cellCTL形成↓Tregcell

三、间充质干细胞在血液系统疾病中的应用

MSCs有很强的多系分化潜能，因此利用其特性进行细胞治疗大有前景。MSCs移植目前已被应用在因细胞损伤或缺失导致的多种疾病中，如心肌梗死、脑外伤、股骨头坏死、糖尿病足和一些自身免疫性疾病。在血液系统疾病中，MSCs除可以预防和治疗造血干细胞移植后GVHD外，在其它一些血液学疾病，如再生障碍性贫血、急性白血病、免疫性血细胞减少症（ITP、AIHA）等方面都有良好的应用前景。

（1） MSCs促进造血细胞植入和在预防及治疗GVHD中的作用

GVHD是异基因造血干细胞移植后一种严重并发症，有很高的致死率，首选药物治疗通常为糖皮质激素，激素无效者则换用其它更强的免疫抑制剂，但常引起严重的免疫缺陷，甚至导致重症感染而死亡。Ball等[20]研究发现在14例儿童单倍体造血干细胞移植中，同时植入供者MSCs，可获得持久造血干细胞植入而没有任何副反应，表明MSCs可以减少单倍体移植受者植入失败的风险。在一项欧洲多中心II期临床试验中，应用骨髓来源MSCs治疗了55例激素无效的急性GVHD患者，30例（55%）取得完全缓解，9（16%）例取得改善，所有患者均未出现

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MSCs相关副反应，缓解率与MSC供者的HLA匹配程度无关，经过60个月随访，完全缓解者移植相关死亡率比部分或无反应者显著降低，2年整体生存率显著升高，证实MSCs对常规治疗无效的急性GVHD是一种有效治疗手段[21]。Ringden等[22]发现用HLA匹配或第三方MSCs治疗急性GVHD同样有效，儿童患者疗效优于成人，同时还发现MSCs对慢性GVHD也有一定效果，并能够逆转组织损伤。MSCs在脐血移植中也大有裨益，因脐血干细胞数量有限，会引起延迟植入甚至导致植入失败，因此同时移植第三方干细胞可以克服脐血移植中干细胞数量不足缺陷，但GVHD风险很高，如同时输注第三方供者MSCs则可以显著减少GVHD发生。综上，MSCs在造血干细胞移植后GVHD的防治方面有着举足轻重的地位。 2. MSC与再生障碍性贫血（AA）

T淋巴细胞介导造血干细胞（HSC）免疫损伤是AA最主要的发生机制之一。各种病因使AA患者T细胞功能亢进，导致Th1/Th2比例失衡，异常激活的Th1细胞分泌IL-2、IFNγ 、TNFα等造血负调因子并活化细胞毒性T淋细胞（CTL)，一方面直接抑制HSC的增殖与分化，另一方面通过上调HSC上的Fas受体，始动其凋亡。此外，IFNγ、TNFα可以使骨髓细胞一氧化氮合酶增加，NO的过度生成加重细胞毒性，更减少HSC。由于CTL同时产生IL-2增加，进一步导致T细胞克隆性扩增，形成恶性循环。

而MSCs对T细胞的增殖抑制、诱导Th 1/Th 2平衡向Th 2倾斜、抑制CTL细胞毒作用和诱导Treg细胞生成等多重作用，可以针对AA发病过程中的各个环节起到治疗作用。Chao等[23]对重型再障（SAA）患者和正常人的MSCs进行了比较，发现两者在形态学和免疫表型方面并无差异，但SAA患者MSCs数量和增殖能力较正常人明显下降。Bacigalupo[24]等研究发现，SAA患者MSCs不仅抑制T淋巴细胞增殖的能力下降，而且抑制T淋巴细胞产生IL2、IFNγ和TNFα的能力明显受损。因此，应用异基因MSCs治疗AA可能有很好的临床前景。黄颖等[25]通过建立小鼠AA模型，观察了对照组、MSCs组和全骨髓细胞组的疗效，发现对照组小鼠全部死亡（8/8），MSCs组4只死亡（4/8），全骨髓细胞组1只死亡（1/8），提示单纯应用MSCs治疗AA有一定疗效，但较全骨髓细胞仍有一定差距。目前国内外尚未见到单纯异基因MSCs移植治疗AA的报道，但由于MSCs来源广泛、体外易于扩增、无MHC限制性和低免疫原性等优势，如能选择适当的MSCs数量或同强免疫抑制

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疗法和细胞因子支持治疗相结合，可能会取得更好的疗效，并能克服临床上异基因造血干细胞移植供者来源的壁垒，使更多的AA患者受益。 参考文献：

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